Lez_2-10
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PCR (polymerase chain reaction) PCR • Scelta dello stampo • Scelta dei primer PCR da DNA genomico PCR da mRNA (RT-PCR) Uso dei “linkers” Vettori dA:dT 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ PCR da DNA genomico BamHI EcoRI Elettroforesi di acidi nucleici • Gel di agarosio • Gel di acrilammide PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO GEL DI AGAROSIO Elettroforesi su gel di agarosio CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO GEL DI AGAROSIO Tamponi di elettroforesi Soluzioni di caricamento Soluzioni di caricamento • Aumentano la densità del campione • Colorano il campione • Rendono visibile la corsa elettroforetica Migrazione del DNA su gel Fattori che influenzano la migrazione • Peso molecolare • Concentrazione di agarosio • Conformazione DNA • Voltaggio applicato • Intercalanti • Tampone di elettroforesi Visualizzazione del DNA GEL DI AGAROSIO Marcatori di peso molecolare HindIII DNA circolare con superavvolgimento = 0 DNA superavvolto negativamente Fotodocumentazione Recupero DNA da gel • Elettroeluizione • Agarosio “low melting” • Solubilizzazione agarosio Gel di acrilammide Apparato per gel di acrilammide Gel di poliacrilammide di sequenza Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae A) Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP) B) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western blot di estratti frazionati Parte A I) 1. PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare) 2. Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina 3. Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione II) 1. Reazione con enzima "ligasi" 2. Analisi su gel di agarosio 3. Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4. Trasformazione batterica 5. Preparazione piastre di agar III) 1. Analisi risultati trasformazione 2. Minipreparazione DNA plasmidico 3. Analisi su gel di agarosio Clonaggio con doppia digestione BamHI EcoRI GAATTC AAGCTT CTTAAG TTCGAA BamHI AGCTT G A CTTAA DNA ligasi EcoRI
