PCR (polymerase chain reaction)
PCR
• Scelta dello stampo
• Scelta dei primer
PCR da DNA
genomico
PCR da mRNA (RT-PCR)
Uso dei “linkers”
Vettori dA:dT
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
PCR da DNA
genomico
BamHI
EcoRI
Elettroforesi di acidi nucleici
• Gel di agarosio
• Gel di acrilammide
PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO
GEL DI AGAROSIO
Elettroforesi su gel di agarosio
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
GEL DI AGAROSIO
Tamponi di elettroforesi
Soluzioni di caricamento
Soluzioni di caricamento
• Aumentano la densità del campione
• Colorano il campione
• Rendono visibile la corsa elettroforetica
Migrazione del DNA su gel
Fattori che influenzano la migrazione
• Peso molecolare
• Concentrazione di agarosio
• Conformazione DNA
• Voltaggio applicato
• Intercalanti
• Tampone di elettroforesi
Visualizzazione del DNA
GEL DI AGAROSIO
Marcatori di peso molecolare
HindIII
DNA circolare con
superavvolgimento = 0
DNA superavvolto
negativamente
Fotodocumentazione
Recupero DNA da gel
• Elettroeluizione
• Agarosio “low melting”
• Solubilizzazione agarosio
Gel di acrilammide
Apparato per gel di acrilammide
Gel di poliacrilammide di sequenza
Descrizione generale esercitazioni di laboratorio
Studio della localizzazione intracellulare della proteina
SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae
A) Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con
"tag" (GFP)
B) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western
blot di estratti frazionati
Parte A
I)
1. PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare)
2. Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina
3. Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione
II) 1. Reazione con enzima "ligasi"
2. Analisi su gel di agarosio
3. Analisi spettrofotometrica del DNA preparato
4. Trasformazione batterica
5. Preparazione piastre di agar
III) 1. Analisi risultati trasformazione
2. Minipreparazione DNA plasmidico
3. Analisi su gel di agarosio
Clonaggio con doppia digestione
BamHI
EcoRI
GAATTC AAGCTT
CTTAAG TTCGAA
BamHI
AGCTT
G
A
CTTAA
DNA ligasi
EcoRI
