presentazione corsa elettroforetica

ELETTROFORESI SU
GEL DI
AGAROSIO
Esercitatori
94°C
94°C
30’’’
30’’
58°C
72°C
72°C
5’
CONDIZIONI
DI UTILIZZO
PER LA PCR
 2° DAY
30’’
Thermal Cycler
1’
4°C

28 Cycles
(2n-2n)x
n= cycles number
x= starting template
DNA
The integrity of PCR
amplicons will be
analyzed by
electroforesis
ELETTROFORESI
SU GEL DI
AGAROSIO
 2° DAY
• Permette la separazione di acidi nucleici in funzione delle loro
dimensioni, della carica e della forma
• E’ una tecnica fondamentale per:
1_l’analisi (elettroforesi analitica);
2_la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi preparativa)
catodo
-
ELETTROFORESI
SU GEL DI
AGAROSIO
anodo
+
RNA e DNA sono
carichi negativamente
 2° DAY
Gli acidi nucleici sono carichi negativamente ed in un campo elettrico migrano
dal polo negativo verso il polo positivo.
Effetto “setaccio” in un gel uniforme
Nell’elettroforesi gli acidi nucleici vengono sottoposti ad un campo elettrico
(vengono “fatti migrare” o “correre”) all’interno di una matrice (gel di agarosio o
poliacrilammide).
ELETTROFORESI
SU GEL DI
AGAROSIO
-
 2° DAY
+
L’agarosio
è un polisaccaride,
isolato da un’alga, costituito da
residui alternati di D-galattosio e
3,6-anidro-L-galattosio.
ELETTROFORESI
SU GEL DI
AGAROSIO
L’elettroforesi in gel di agarosio
consente la separazione di
molecole di grandi dimensioni
(100-20.000 paia basi).
 2° DAY
Concentrazione
di agarosio
0.8% :
2% :
Risoluzione
0.5 – 20 kb
0.1 – 3 kb
•
•
•
•
1% agarose gel in 1X TAE electroforesis buffer
Run Time: 40 min.
Voltage: 80 V
Samples: 1/20 final Volume (5 l) + Loading buffer
PROTOCOLLO
GEL
AGAROSIO
100V
Polo -
 2° DAY
Polo +
0,2A
ON
100V
0,2A
Polo Polo +
CORSA SU
GEL
AGAROSIO
White
 2° DAY
UV
CORSA SU
GEL DI
AGAROSIO
DEI
PLASMIDI
 3° DAY
NANODROP:
Dosaggio
Spetrofotometrico
del DNA
Plasmidico
 3° DAY