Introduzione laboratorio
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Clonaggio (molecolare) Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti BamHI 1200 bp EcoRI Isolamento acidi nucleici 1. lisi cellulare 2. deproteinizzazione 3. concentrazione Purificazione acidi nucleici • Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici • Precipitazione: cationi + etanolo (Na, NH4) isopropanolo Purificazione acidi nucleici Purificazione acidi nucleici Isolamento DNA plasmidico • Protocollo “classico” • Colonnine cromatografiche (kit commerciali) Protocollo classico Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione in TE Analisi acidi nucleici • Spettrofotometro (quantitativa) • Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa) Spettro di assorbimento del DNA 1.5 Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml 1.0 OD260/OD280=1,8-2,0 0.5 220 240 260 280 300 320 lunghezza d’onda (nm) Elettroforesi di acidi nucleici • Gel di agarosio • Gel di acrilammide PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO GEL DI AGAROSIO Elettroforesi su gel di agarosio Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006 CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO GEL DI AGAROSIO Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi. Fattori che influenzano la migrazione • Peso molecolare • Concentrazione di agarosio • Conformazione DNA • Voltaggio applicato • Intercalanti • Tampone di elettroforesi Visualizzazione del DNA Marcatori di peso molecolare HindIII DNA circolare con superavvolgimento = 0 DNA superavvolto negativamente ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2010/2011 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel di agarosio: 1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate 2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione 3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4) Analisi della digestione su gel di agarosio Discussione dei risultati SacI 1200 bp EcoRI
