Introduzione laboratorio

Clonaggio (molecolare)
Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi
Scelta e preparazione del vettore
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Giunzione del DNA da clonare al vettore
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Analisi dei prodotti
BamHI
1200 bp
EcoRI
Isolamento acidi nucleici
1. lisi cellulare
2. deproteinizzazione
3. concentrazione
Purificazione acidi nucleici
• Deproteinizzazione:
agenti enzimatici
solventi organici
• Precipitazione:
cationi +
etanolo
(Na, NH4)
isopropanolo
Purificazione acidi nucleici
Purificazione acidi nucleici
Isolamento DNA plasmidico
• Protocollo “classico”
• Colonnine cromatografiche (kit
commerciali)
Protocollo classico
Risospensione delle cellule in
tampone con RNasi
Lisi cellulare con NaOH/SDS
Neutralizzazione con Kacetato
(precipitazione di proteine)
Estrazione fenolo/cloroformio
Precipitazione con isopropanolo
Risospensione in TE
Analisi acidi nucleici
• Spettrofotometro (quantitativa)
• Elettroforesi su gel (qualitativa,
semiquantitativa)
Spettro di assorbimento del DNA
1.5
Assorbanza
(OD)
1 OD260=50g/ml
1.0
OD260/OD280=1,8-2,0
0.5
220 240 260 280 300 320
lunghezza d’onda (nm)
Elettroforesi di acidi nucleici
• Gel di agarosio
• Gel di acrilammide
PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO
GEL DI AGAROSIO
Elettroforesi su gel di agarosio
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO
GEL DI AGAROSIO
Migrazione del DNA su gel
Le molecole lineari di dsDNA
migrano a velocità
inversamente proporzionali
al logaritmo in base 10 del
numero di paia di basi.
Fattori che influenzano la migrazione
• Peso molecolare
• Concentrazione di agarosio
• Conformazione DNA
• Voltaggio applicato
• Intercalanti
• Tampone di elettroforesi
Visualizzazione del DNA
Marcatori di peso molecolare
HindIII
DNA circolare con
superavvolgimento = 0
DNA superavvolto
negativamente
ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2010/2011
Descrizione generale esercitazioni di laboratorio
Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel
di agarosio:
1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate
2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio
Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione
3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione
Analisi spettrofotometrica del DNA preparato
4) Analisi della digestione su gel di agarosio
Discussione dei risultati
SacI
1200 bp
EcoRI