Individuazione del prodotto di una PCR mediante

Individuazione del prodotto di una PCR mediante AGAROSE GEL Elettroforesi.
Fase dispersa: AGAROSIO
L’Agarosio è un polimero lineare, costituito da monomeri
ripetuti di Agarobiosio, un disaccaride a sua volta formato da
D-galattosio e 3,6-desossi-L-galattopiranosio. Viene estratto da
vari tipi di alghe rosse. Da secoli è impiegato per uso
alimentare nella cucina giapponese.
Un idrocolloide è una sostanza che si trova in uno stato
colloidale (intermedio tra una soluzione e una sospensione) formato da due elementi: l’ acqua, quale fase
disperdente, e dall’agar una fase dispersa. L’agar è insolubile a freddo ma si scioglie, mescolato adeguatamente,
in acqua portata all’ebollizione. Se successivamente viene lasciato raffreddare le sue molecole pian piano si
legano fra loro per formare un reticolo che intrappola l’acqua e le altre molecole presenti formando un gel,
quando la temperatura ha raggiunto i 30-40 °C. La gelificazione avviene attraverso la formazione di legami a
idrogeno tra le molecole di agarosio. L’agar gelifica a concentrazioni molto basse, a partire dallo 0.2%. Le
concentrazioni tipiche a cui viene utilizzato sono tra lo 0.5% e il 2% rispetto all’acqua. Esso è un idrocolloide
termoreversibile (A differenza del gel formato dall’amido): si riscioglie se scaldato e si riforma per
raffreddamento. Questa trasformazione può essere ripetuta indefinitamente a meno di avere in soluzione
sostanze o condizioni che possano idrolizzare o ossidare l’agarosio, ad esempio pH molto acido (< 2.5). Il gel di
agar resiste alle alte temperature, sciogliendosi solo attorno agli 85-90 °C. Il fenomeno per cui la temperatura di
fusione del gel è diversa dalla temperatura di solidificazione è chiamato isteresi. L’agarosio non presenta cariche
nette e ha un basso grado di complessità molecolare. Queste caratteristiche fanno si che abbia una scarsa
interazione con le biomolecole e pertanto sia una matrice ideale per lavorare con proteine ed acidi nucleici. I Gel
a base di agarosio hanno una dimensione dei pori relativamente grandi, che li rende utili per la separazione di
grandi molecole, quali proteine e complessi proteici> 200 kDa, e frammenti di DNA> 100 paia di basi. La maggior
parte gel di agarosio sono fatti con tra 0,7% (buona separazione o risoluzione del 5-10kb grandi frammenti di
DNA) e 2% (buona risoluzione per piccoli frammenti 0,2-1 kb) agarosio disciolto in tampone di elettroforesi.
Fino al 3% può essere usato per separare frammenti molto piccoli, ma un gel di poliacrilammide verticale è più
appropriato in questo caso. I gel di agarosio non hanno una porosità uniforme, ma sono ottimali per elettroforesi
di proteine che sono più grandi di 200 kDa.
Plasmide di circa 6000 bp -> Gel all’1% volume 55ml
volume della camera 350 ml
Fase disperdente : tampone TBE (Tris/Borate/EDTA)
TBE o Tris / Borato / EDTA, è una soluzione tampone contenente una miscela di Tris base, acido borico e EDTA.
In biologia molecolare, i buffer TBE e TAE sono spesso utilizzati nelle procedure che coinvolgono gli acidi
nucleici, l'essere elettroforesi più comune. Soluzioni tris-acido sono buffer efficaci perché mantengano DNA
deprotonato e solubile in acqua. EDTA è un chelante di cationi bivalenti, particolarmente di magnesio (Mg2 +).
Poiché questi ioni sono necessari cofattori per molti enzimi, tra nucleasi contaminanti, il ruolo del EDTA è
proteggere gli acidi nucleici contro la degradazione enzimatica.
I gruppi fosfato primari di nucleotidi sono completamente dissociati sotto pH 2, mentre i gruppi amminici delle
basi dissociarsi tra pH 2 e 5. I fosfati secondari hanno essenzialmente identica pK valori a 6. I gruppi enolici
hanno valori del pK vicino o sopra 9. L'elettroforesi di polinucleotidi quindi dipende unicamente dalla carica di
ionizzate che collegano gruppi fosfato di separazioni vengono eseguite in un range di pH 5-10. Molecole di DNA
migrare più rapidamente sopra pH 7, condizioni in cui, per la pratica finalità, i fosfati sono completamente
deprotonato. All'interno queste considerazioni, il pH non è un fattore importante per elettroforesi di DNA o RNA
Tris (tridrossimetil amminometano)ha un pKa di 8,07 a 25 ° C, il che implica che il buffer ha un range di pH
efficace tra 7.1 e 9.0.
Acido Borico pK: 9,1-9,4. Pari o inferiore a questo pH, una soluzione di acido borico serve come tampone contro
la produzione di idrossido al catodo.
EDTA chelante per il magnesio.
Sistema di rivelazione : Syber Green
SYBR Green I è una cyanina. Si lega al DNA. Il complesso DNA-dye assorbe la
luce blu ( max = 497 nm) ed emette luce verde (max = 520 nm). La colorante si
lega preferenzialmente al DNA a doppia elica, ma anche al DNA a singolo
filamento con prestazioni inferiori. SYBR green può anche marcare RNA con
una performance inferiore a quella del DNA
SYBR Green I è commercializzato come un sostituto per il mutageno bromuro
di etidio. È più sicuro per lavorare e senza le complesse problematiche di
smaltimento dei rifiuti di etidio. Tuttavia qualsiasi piccola molecola capace di
legare il DNA con alta affinità è un possibile cancerogeno
Loading buffer (6X)
0.25% Bromophenol blue
0.25% Xylene cyanol FF
15% glicerolo
Distilled H2O
Blu di bromofenolo migra attraverso gel di agarosio eseguiti in 0,5 x TBE approssimativamente alla stessa
velocità di un DNA a doppio filamento lungo circa 300 bp di lunghezza, mentre xilene cyanol FF migra
approssimativamente alla stessa velocità di un doppio filamento di DNA di 4 kb di lunghezza.
Marker
Il ™ 1 Kb DNA Ladder TrackIt è adatto la marcatura di frammenti di DNA a doppio
filamento da 500 bp-12 kb. Il ™ 1 Kb DNA Ladder TrackIt è formulato con
inseguimento unicocoloranti, xilene cyanol FF (XCFF) e tartrazina, che consentono
di monitorare visivamente la migrazione del DNA durante l'elettroforesi e anche
indicare quando
massima risoluzione si ottiene.
Le caratteristiche importanti della scaletta sono elencati di seguito:
• Composto da 12 bande da 396 paia di basi a 12 216 bp.
• Formulato con coloranti di registrazione univoco, XCFF e tartrazina
• Progettato per l'uso con E-Gel ® gel di agarosio e TBE / TAE agarosio Gel
• Fornito in un formato pronto per il carico
• visualizzati con bromuro di etidio o SYBR ® Green
La tartrazina è un colorante sintetico giallo usato principalmente come colorante
alimentare. Tartrazina è derivato da petrolio. E 'solubile in acqua e ha una
assorbanza massima in soluzione acquosa a 427 ± 2 nm.