Elettroforesi e PCR - Macroarea di Scienze

L’elettroforesi è una tecnica che utilizza un campo elettrico per separare e visualizzare
frammenti di DNA in base al loro peso molecolare ed alla loro carica. Gli acidi nucleici, migrano
sempre verso il polo positivo per la presenza, nella loro molecola, della carica negativa data dai
gruppi fosfato.
Il supporto utilizzato per eseguire l’elettroforesi è il gel, che si ottiene dalla fusione e successiva
gelificazione di una soluzione contenente agarosio e, come solvente, TAE.
L’ele%roforesi in gel è il metodo standard u4lizzato per separare, iden4ficare e purificare frammen4 di DNA. L’agarosio è un polimero di carboidra4 estra%o dalle alghe. Fuso e gelificato, forma una matrice, la cui porosità dipende dalla concentrazione Il risultato è che i frammen4 di DNA si separeranno nella matrice in funzione del peso molecolare e della forma Elevate concentrazioni si usano per separare frammen4 più piccoli, concentrazioni più basse frammen4 più grandi. La concentrazione dell’agarosio può essere variata per oGmizzare la migrazione. 0,8% riesce a separare un range di dimensioni da circa 500 bp a circa 20.000 bp. 2%, si osserverà una migliore separazione dei piccoli frammen4, perché anche ques4 saranno rallenta4 dalla matrice più concentrata. Le soluzioni hanno lo scopo, di determinare e mantenere stabili il pH e la concentrazione di ioni del gel. TAE e TBE sono i tamponi più comunemente usa4 per l’ele%roforesi. • T sta per Tris/HCl, che consente il mantenimento di un valore costante di pH della soluzione; •  E sta per EDTA, che chela i ca4oni bivalen4, come il magnesio. Questo è importante, perché la maggior parte delle nucleasi richiede ca4oni bivalen4 per funzionare. • A o B sta per acido Borico o Ace4co che forniscono l’appropriata forza ionica al tampone. Ogni pozze%o del gel viene caricato con 5 µl di ciascun estra%o mescola4 con 1 µl di un “gel loading buffer” contenente 0,25% xylene. Il buffer serve per tre scopi: •  aumenta la densità del campione perme%endo al DNA di penetrare in maniera uniforme nei pozzeG del gel; • colora il campione semplificando in tal modo il caricamento; • con4ene dei coloran4 che si muovono in un campo ele%rico verso l’anodo con una velocità prevedibile. TuG i prodoG amplifica4 vengono faG migrare insieme ad un controllo posi4vo e ad un controllo nega4vo non contenente DNA, per poter valutare o meno la presenza del prodo%o estra%o. Caricamento Il risultato della corsa elettroforetica consiste in una serie di bande visualizzabili mediante
colorazione del gel con bromuro d’etidio Il bromuro d’etidio è una molecola in grado di intercalarsi tra le basi del DNA e che emette
fluorescenza se esposta agli UVA a 254 nm.
Se la procedura di estrazione è avvenuta in modo corretto, si visualizzerà una banda o uno smirn
(strisciata).
PCR La reazione di polimerizzazione a catena è una tecnica che perme%e la selezione e l’amplificazione esponenziale in vitro di un qualsiasi tra%o di DNA di cui siano note le estremità, rendendo così possibile o%enere, in tempi estremamente brevi, un elevato numero di copie di un frammento di DNA. La PCR consiste nella ripe4zione di un certo numero di cicli di denaturazione e rinaturazione di DNA in presenza di una DNA polimerasi termostabile, la Taq polimerasi, e di due sequenze oligonucleo4diche lunghe tra le 18 e le 25 paia di basi, i primers, specifiche per il segmento di DNA da amplificare. 235 ● DNA ● primer L 15996 ● primer H 408 ● tampone di reazione contenente Tris pH 8,3; MgCl₂; KCl; gela4na. Lo ione magnesio è essenziale per la PCR, in quanto influenza l’aGvità dell’enzima, condizionando l’a%acco dei primers ● dNTPs (2’deossinucleosidi-­‐5’trifosfato), una miscela di qua%ro nucleo4di (sinte4zza4 a par4re dai corrisponden4 ribonucleo4di mediante la riduzione del carbonio in posizione C2’) presen4 in uguale quan4tà che serve per portare avan4 la polimerizzazione ● Taq polimerasi ● ddH₂O autoclavata Per ogni esperimento si preparano anche un controllo nega4vo (reazione PCR che non con4ene DNA) ed uno posi4vo (reazione PCR che con4ene un DNA estra%o da sangue, di sicura amplificazione). Temperatura di Mel6ng e di annealing ●Temperatura di denaturazione superiore alla temperatura di Mel4ng ● Tm = 4°C x (G+C) + 2°C x (A + T) ● Temperatura di annealing circa 5°C inferiore alla Tm Ele:roforesi dei prodo> amplifica6