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Studio proteine: proteine extracellulari – cellulari
PROTEINE EXTRACELLULARI:
Matrice extracellulare - liquidi interstiziali, liquidi biologici:
siero (plasma), liquor cefalorachidiano, liquido sinoviale,
saliva, liquido amniotico.
PROTEINE CELLULARI: legate alla membrana plasmatica e intracellulari
ORGANI - TESSUTI – parenchima e cellule funzionali
tessuto di sostegno, connettivo
Muscolo scheletrico – miociti, fibrocellule; muscolo cardiaco: cardiomiociti;
Encefalo: neuroni, astrociti, glia;
Sangue: eritrociti; linfomonociti, granulociti, piastrine;
Fegato: epatociti; rene: unità funzionale nefrone
COLTURE CELLULARI: linee cellulari, cloni cellulari, etc.
Frazionamento cellulare, basilare per lo studio di proteine cellulari in organi e tessuti
specifici o in linee cellulari: si devono ottenere frazioni definite di “arricchimento” di
particolari componenti cellulari: ex. frazione citoplasmatica o solubile; frazione di
membrane plasmatiche; frazione microsomiale; frazione mitocondriale; nuclei.
Le tecniche separative che si possono utilizzare si diversificano in relazione al tipo di
tessuto/cellula e al grado di purezza della/e frazione/i subcellulare/i ritenuto necessario.
STUDIO DELLE PROTEINE CELLULARI- FRAZIONAMENTO CELLULARE
Le cellule eucariotiche (ex. animali) sono organizzate in modo complesso:
compartimenti, organelli, strutture subcellulari, dove le proteine sono variamente
distribuite. Lo studio di proteine specifiche (enzimi, recettori, etc.) si effettua in frazioni
cellulari (sub-cellulari): quelle, ad esempio, dove le proteine di nostro interesse sono >>
espresse. Il frazionamento può anche servire per vedere il profilo di distribuzione di una o
più proteine nella cellula; come fase iniziale di preparazione alla purificazione di una o più
proteine, a partire da un omogenato grezzo.
FRAZIONAMENTO CELLULARE
1) Fase di omogeneizzazione: disorganizzazione del tessuto e rottura di cellule
OMOGENATO
2) Fase di separazione: reintroduce un ordine di nuovo tipo raggruppando le
componenti cellulari contenute nell’omogenato in base a uguali caratteristiche e
proprietà di tipo fisico quali dimensioni, densità.
CENTRIFUGAZIONE
(differenziale, zonale,
isopicnica)
Procedure che devono essere eseguite al fine di ottenere la max. resa possibile;
in particolare l’omogeneizzazione, deve essere adattata all’eterogeneità dei diversi
organi e tessuti: cellule che differiscono x dimensioni, densità e fragilità
Eterogeneità del tessuto
Mezzo, soluzione ; metodo di omogeneizzazione
(Blendor)
Ultraturrax; Potter-Dounce manuale;
Potter-Elvejham-elettr.
Sonicazione: onde sonore alta freq.
(x omogenati di colture batteriche)
L’omogeneizzazione avviene in tampone solitamente ipotonico e a pH fisiologico;
il tampone ipotonico facilita la rottura delle cellule;
si cerca tuttavia di mantenere condizioni in vitro non troppo drastiche: non
deve essere alterata la struttura delle proteine che vogliamo studiare
Condizioni opportune per l’omogeneizzazione di tessuti e cellule:
Se eseguiamo il frazionamento cellulare per studiare la funzione di una o più proteine,
dobbiamo ottenere, alla fine della procedura, una buona resa di queste(a) proteine(a).
Per ogni tessuto, organo, tipo di frazione cellulare e proteine in studio esistono procedure
e protocolli adattati e variabili al fine di ottenere risultati il più possibile ottimizzati.
Calore, pH estremi, solventi organici, detergenti:
possono provocare denaturazione delle proteine
Temperatura: si opera in ghiaccio- 4°C – non si devono denaturare le proteine;
a basse temperature si bloccano anche attività enzimatiche proteolitiche e digestive
che si trovano in lisosomi e perossisomi e si possono liberare durante la lisi –
inibitori di proteasi.
Composizione salina bilanciata e adattata, ipotonica per provocare rottura delle
membrane.
pH fisiologico, 7-7.4 – media che sono tamponi – uso di detergenti per solubilizzare
proteine. Tamponi: impediscono cambiamenti del pH fisiologico x aggiunta di
acidi o basi – acido o base deboli + loro sale ottenuto da base e acido forte.
Tamponi fosfato, Tris-HCl, Hepes-NaOH, a varie conc. 5-100 mM vs. conc. salina
isotonica ≈120 mM NaCl.
Velocità di sedimentazione di particelle in soluzione
per centrifugazione
v
2 rP2 (P  M ) 2r
9  ( f / f0 )
Tra le numerose applicazioni della centrifugazione vi è la separazione di particelle
(cellule, organelli,frazioni sub-cellulari, macromolecole)- preparativa o analitica.
-La velocità di sedimentazione V incrementa proporz al quadrato del raggio particella
(rp2)
- La velocità di sedimentazione V aumenta. proporz. alla diff. tra densità particella e
densità del mezzo
-La V sed. incrementa con l’incremento del campo di centrifugazione = 2r
-- La V sed. diminuisce all’aumento della viscosità del mezzo ( ) e di f/f0 =
rapporto di attrito
Frazionamento sub-cellulare e centrifugazione
Centrifugazione differenziale, zonale e isopicnica
Organello
Nucleo
Diametro (mM)
5-10
Densità (g/cm3)
1.40
Mitocondrio
1-2
1.18
Lisosoma
1-2
1.13
Ribosoma
0.02
1.61
Rotori swing-out – a braccio oscillante
Rotori ad angolo fisso
Centrifugazione differenziale
p – m > 0
tecnica più usata per il frazionamento cellulare
centrifugando un omogenato cellulare per tempi
relativamente brevi ed a velocità modeste sarà
possibile ottenere la sedimentazione dei nuclei ma
non degli altri organelli, che hanno densità e/o
dimensioni minori e che rimarranno nel surnatante.
Il surnatante può essere ulteriormente processato
per ottenere altri tipi di particelle
SOVRANATANTE
1
SOVRANATANTE
2
SOVRANATANTE
3
25,000 g
10 min
100,000 g
60 min
300,000 g
120 min
CITOSOL
600 g
10 min
OMOGENATO
PELLET 1
Nuclei
PELLET 2
Mitocondri
Cloroplasti
Lisosomi
Perossisomi
PELLET 3
Microsomi
Poliribosomi
Frammenti di
membrane
PELLET 3
Ribosomi
Virus
Grandi Macromolecole
centrifugazioni ripetute: con una serie di centrifugazioni opportune si
possono ottenere le principali frazioni sub-cellulari; con le metodiche in gradiente
di densità le frazioni possono essere ottenute con un solo passaggio.
Relazione tra RCF (g) e RPM
Equazione di conversione
Esercitazione - Tessuto muscolare
1 gr di tessuto - Omogeneizzazione in tampone
fosfato 100mM pH 7,4 (1:10 p:vol), in
ghiaccio
Ultraturrax
Centrifugazione diff. a 10,000 g a 4°C
Pellet
Surnatante
FRAZIONE “SOLUBILE”
(contenente citosol, microsomi, particelle e organelli + leggeri, proteine del citoplasma, enzimi)
Dosaggio delle proteine totali ottenute: metodo biureto
Dosaggio dell’enzima LDH in condizioni saturanti