Batteri nell’
nell’ambiente: testimoni e/o
attori principali
Specifici microrganismi possono essere utilizzati
come “biosensori”
biosensori”, cioè
cioè come strumenti di
detezione e di determinazione della presenza di
sostanze tossiche/inquinanti
Microrganismi vengono utilizzati per
promuovere o accelerare il risanamento
ambientale (bioremediation
(bioremediation))
Biosensori vs. “Biorimediatori”
Biorimediatori”
I-Biosensori
Escherichia
coli,
coli, e batteri del genere Pseudomonas,
Pseudomonas,
P. putida in particolare
-
L’attività
attività di un biosensore si “limita”
limita” alla rilevazione di un
composto inquinante di interesse
Può essere utilizzato in condizioni di laboratorio (a cui viene
aggiunto il campione da testare)
Organismo geneticamente ben caratterizzato e disponibilità
disponibilità di
mutanti
Disponibilità
Disponibilità di vettori di clonaggio ed espressione espressi
stabilmente
Biosensori vs. “Biorimediatori”
Biorimediatori”
IIII-Biorimediatori
Pseudomonas sp.,
sp., Rhodococcus,
Rhodococcus, Sphingomonas,
Sphingomonas,
Mycobacterium,
Mycobacterium, Rhizobium,
Rhizobium, batteri non identificabili
e/o consorzi microbici.
-
Devono essere in grado di degradare in maniera consistente le
sostanze inquinanti di interesse
Devono essere attivi “in situ”
situ”, cioè
cioè nell’
nell’ambiente naturale
Devono persistere nell’
nell’ambiente senza turbarne la biodiversità
biodiversità
Devono possedere attività
attività biodegradativa endogena (non essere geneticamente
modificati, a meno che possa essere contenuta la loro dispersione
dispersione
nell’
nell’ambiente)
-
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Biosensori vs. “Biorimediatori”
Biorimediatori”
I-Biosensori
Escherichia
coli,
coli, e batteri del genere Pseudomonas,
Pseudomonas,
P. putida in particolare
-
L’attività
attività di un biosensore si “limita”
limita” alla rilevazione di un
composto inquinante di interesse
Può essere utilizzato in condizioni di laboratorio (a cui viene
aggiunto il campione da testare)
Organismo geneticamente ben caratterizzato e disponibilità
disponibilità di
mutanti
Disponibilità
Disponibilità di vettori di clonaggio ed espressione espressi
stabilmente
Impiego di batteri biosensori e loro
problematica
Pseudomonas
-
-
-
putida,
putida, Escherichia coli, ecc.
L’impiego di biosensori è alternativo o complementare
a strumenti analitici per “risk assessment”
assessment” (es.
valutazione della concentrazione di inquinante)
Facilità
Facilità e convenienza d’
d’uso (ma risposta
semiquantitativa)
Selettività
Selettività del riconoscimento di composti chimici: (es.
isomeri di composti organici, metalli pesanti)
derepressione
Promotori inducibili:
(es. operoni per la degradazione
di substrati complessi,
induzione da stress cellulari,
detossificazione)
Espressione indotta esclusivamente
in risposta ad uno stimolo specifico
mediato dall’accumulo di un induttore
attivazione
2
Molti promotori inducibili sono di interesse
biotecnologico ambientale
operoni per la degradazione
di substrati complessi,
induzione da stress cellulari,
detossificazione
Es. idrocarburi,
substrati aromatici
Es. metalli pesanti (Hg, Cr)
Gli operoni per la degradazione di substrati complessi (es. composti
aromatici come toluene e xylene) sono a loro volta piuttosto complessi!
Plasmidi pSVS/pTOLs
Geni controllati da un
promotore di interesse
Situazione fisiologica;
ceppo wild type
Es. codificanti per geni
per la degradazione
Biosensore
Gene reporter: codifica una
proteina la cui attività può essere
facilmente saggiata;
La fusione promotore::gene
reporter (es. xylE::lacZ) può
essere costruita inattivando
l’operone originale o clonando il
promotore a monte di un gene
reporter, generalmente su un
plasmide
Promotore di interesse clonato
a monte di un gene reporter
Rep. gene
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Principali geni reporter comunemente utilizzati in microrganismi
Protein
Activity & Measurement
CAT (chloramphenicol
acetyltransferase)
Transfers radioactive acetyl groups to
chloramphenicol.
GAL (β−galactosidase)
Hydrolyzes colorless galactosides to
yield colored products (X-gal, ONPG).
GUS (β−glucuronidase)
Hydrolyzes colorless glucuronides to
yield colored products. (PNPG).
LUC (luciferase)
Oxidizes luciferin, emitting photons.
GFP (green fluorescent
protein)
Fluoresces on irradiation with UV.
Un gene reporter “visuale”: la green fluorescent protein (GFP)
Use of GFP to detect response to 3-chlorobenzoate
3-ChlB
3-ChlB
Determinazione di espressione di β-galattosidasi su piastre McConkey contenenti X-gal
Legame scisso dalla β-galattosidasi
Negativo
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolylβ -galactopyranoside)
Positivo
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Utilizzo di geni reporter per lo sviluppo di biosensori:
Problemi concettuali e tecnici
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