TEC CELL 7 4 Ottmizzazione vettori per trasformazione File

La scelta del sistema cellulare
• coltura primaria
• cellula immortalizzata
• linea tumorale
Scelta del sistema cellulare.
1. Facilità di coltura e stabilità
2. Efficienza di transfezione
3. Modificazioni post-traduzionali
4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione
genica
5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della
proteina (espressione di proteine omologhe)
Scelta del vettore per ingegneria cellulare
Vettori per ingegneria cellulare

sequenze per la replicazione in procariote

Cassetta di espressione

Polylinker

Promotore (virale, tess. specifico,inducibile , ecc.)

Modificazioni posttrascrizionali (Siti di: terminazione della
trascrizione; poliadenilazione; segnali di splicing )

Marcatori di selezione
• SV40 origin for episomal replication and simple vector rescue in cell lines expressing the
large T antigen (i.e., COS-1 and COS-7)
Transfezione stabile
Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle cellule
contengono il DNA esogeno.
In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le cellule che
non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo perdono.
Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una
pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di selezione.
• Marker di selezione:
•
Crescono solo le cellule che hanno acquisito il vettore
• Creazione di linee stabili
Caratteristiche del gene marker:
- deve esprimersi in un’ampia gamma di cellule e tessuti
- deve produrre una chiara modificazione del fenotipo
- deve distinguersi perfettamente da attività endogene simili
- la resistenza endogena al composto selettivo deve essere bassa
- deve potersi esprimere a livelli sufficienti per garantire la resistenza
- l’enzima prodotto deve inattivare il composto ad alta velocità
- i metaboliti liberati dopo la reazione non devono essere tossici.
I markers di selezione sono geni che neutralizzano l’effetto di farmaci tossici
Lista di markers di selezione frequentemente utilizzati negli eucarioti superiori
neo R – neomycin (G418, neomycin (G418, analogo analogo della Neomicina Neomicina
solfato solfato )
hyg R – hygromycin
pac R – puromycin
zeo R – zeomycin
Geni per markers selettivi:
•aminoglicoside fosfotransferasi (Neo):
conferisce resistenza agli antibiotici aminoglicosidici (kanamicina, neomicina, geneticina…).
Questi antibiotici tendono a non essere tossici a piccole dosi, per selezionare le cellule sono
necessarie dosi elevate che però possono danneggiare anche le cellule trasfettate
necessario determinare la dose appropriata.
• Igromicina B fosfotransferasi: conferisce resistenza all’igromicina (Hyg)
•Hygromycin B is an aminoglycosidic antibiotic that inhibits protein synthesis by disrupting
translocation and promoting mistranslation at the 80S ribosome.
•Resistance to Hygromycin B is conferred by the E. coli hygromycin resistance gene (hyg or hph).
Geni per markers selettivi:
Il marker può essere presente sullo stesso plasmide del gene di nostro interesse oppure cotrasfettato con un secondo plasmide.
• timidina chinasi (Tk): enzima che permette la sintesi della timidina.
•Si selezionano cellule Tk- che vengono poi trasfettate con il plasmide Tk+. In un terreno –
timidina crescono solo le cellule che hanno acquisito il plasmide.
•- sono poche le cellule Tk- e non è detto che vadano bene per il
nostro studio
•asparagina sintetasi
• xantina-guanina fosforibosil transferasi
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Timidino chinasi
Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio”
L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio
Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT
(Aminopterina) se la via di salvataggio non è praticabile
5-fosforibosil-1pirofosfato
Uridina monofostato
AMINOPTERINA
Timidina monofostato
Inosina
monofostato
Guanina
monofostato
Ipoxantina
Adenina
monofostato
Timidina
Sito di poliadenilazione
• RNApol II trascrive anche il sito di poliadenilazione, parte della porzione 3' viene rimossa e
l'RNA poliadenilato.
• Le sequenze downstream devono essere incluse nei vettori di espressione degli eucarioti per
avere la sintesi di mRNA
•
• Due elementi indispensabili per corretta POLIADENILAZIONE
• sequenze ricche di GU o U downstream il sito di poliadenilazione;
• sequenze di 6 nucleotidi AAUAAA localizzate 11-30 nucleotidi upstream il sito di
poliadenilazione
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La scelta del vettore
Determinata dal tipo di sistema che si vuole generare:
1. iperespressione proteica
2. espressione regolata per studio della funzione del gene,
per produzione limitata nel tempo
3. studio della regolazione della espressione di un gene
Scopo della trasfezione
1. Indagini sulla funzionalità di un gene/proteina
• PROMOTORE STD + GENE D’INTERESSE
PROMOTORE
Gene XYZ
Scopo della trasfezione
2. Studio attività-funzione di una proteina
- promotore forte, cellula-specifico + gene per quella proteina
PROMOTORE
Gene XYZ
FEGATO
PROMOTORE
Gene XYZ
POLMONE
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Scopo della trasfezione
3. Controllo dell’espressione genica: indagini sulla regolazione del promotore
PROMOTORE DEL GENE DI INTERESSE + GENE REPORTER
PROMOTORE
REPORTER
Scopo della trasfezione
4. Studi di attività trascrizionale: vettore promoterless
Promotore + reporter
Enhancer + Promotore + reporter
Promotore deleto + reporter
Promotore con inserzione + reporter
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Reporter :
Le cellule con il vettore acquisiscono particolari caratteristiche
Funzionalità di un promotore:
reporter posto sotto il controllo di quel promotore
Funzionalità di un gene:
Fusione del gene d’interesse con il gene reporter
Entrambi posti sotto la regolazione dello stesso promotore
Caratteristiche di un reporter
• NON deve avere un’attività proteica SIMILE a quella del gene d’interesse
• l’attività proteica del Reporter NON deve INTERFERIRE con quelle
fisiologiche della cellula: le vie di segnalazione e il metabolismo cellulare
devono rimanere integri
•
-
il saggio sull’attività del reporter deve essere
specifico;
riproducibile
immediato
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geni reporter
• GFP: green fluorescent protein
• espresso nella medusa Aequorea Victoria
• in natura produce bioluminescenza dovuta al trasferimento di energia (processo
Ca-dipendente associato alla proteina Aeqorina)
• l’esposizione della proteina a raggi ultravioletti produce autofluorescenza di colore
verde in assenza di Ca, Aequorina o qualunque cofattore o substrato
• mutazioni puntiformi nel cromoforo producono varianti che emettono luce a
differente lunghezza d’onda
• CFP (cyan, colore blu)
• YFP (yellow, colore giallo)
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geni reporter
• ß-galattosidasi:
• Codificato dal gene LacZ di E.coli
• Conversione di alcune sostanze in composti colorati
• Citochimica: clivaggio del substrato XGal → comparsa di precipitati BLU
(colonie blu)
• Spettroscopia: clivaggio di ONPG (o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside )
→ composto solubile giallo
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MCS
• Vettore
• PLASMIDE
• VIRUS (infezione)
• Promotore:
• Corte sequenze nucleotidiche
• Danno inizio alla trascrizione
• Enhancer: elementi di regolazione positiva
• Derivati da virus
• SV40 early gene enhancer: attivo su molti tipi cellulari
• LTR: long terminal repeat
• Raus Sarcoma Virus
• CMV
• Silencer: elementi di regolazione negativa
• Fattori per la replicazione: cis, trans
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geni reporter
• Cloramfenicolo acetil-transferasi:
• Enzima batterico: resistenza all’antibiotico cloramfenicolo
• Acetilazione del Cloramfenicolo
• Se si usa come substrato l’antibiotico marcato con C14, viene acetilato solo nelle cellule
trasfettate e dove il promotore che controlla l’enzima è attivo. Si produce una miscela di
molecole marcate rilevate su TLC o autoradiografia
Esempio: ANALISI TLC
• IL Clone A non ha attività acetilasica
• I Cloni B e C hanno attività acetilasica
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Luciferasi:
luciferina + ATP
luciferil adenilato + Ppi
luciferil eadenilate + O2
ossiluciferina + AMP + LUCE
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APPLICAZIONI
• SISTEMI INDUCIBILI
•SILENZIAMENTO GENICO
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I sistemi inducibili
• permettono di regolare l’espressione di un gene
• richiedono espressione stabile del gene che si vuole regolare
• permettono di studiare l’espressione di geni tossici: si possono ottenere linee
cellulari trasfettate stabilmente col gene da studiare che viene:
- mantenuto “spento” in propagazione
- “acceso” al momento dell’esperimento
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Tet system: TET-ON e TET-OFF
Sistemi regolati dalla tetraciclina (Tc) o da suoi analoghi come la doxyciclina (Dox).
Tet-On: l’aggiunta di Tc o Dox accende il nostro gene
Tet-Off: l’aggiunta di Tc o Dox mantiene spento il nostro gene
Sistemi sfruttano le proteine di E.coli coinvolte nella resistenza alle tetracicline:
Tet R= tet repressor protein: regola negativamente l’espressione dei geni coinvolti
nella resistenza (trasposone Tn10). In assenza di Tc, Tet R si lega alla sequenza Tet
O=tet operator e blocca la trascrizione.
Per gli exp in cell di mammifero Tet R è stata modificata:
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• nel sistema Tet-Off è necessario aggiungere Tc o Dox nel medium per
mantenere lo stato inattivo. Le due molecole però hanno emivita breve ed è
quindi necessario aggiungerle ogni circa 48 h per reprimere l’espressione del
gene X.
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esempio: NSC34-Tet Off
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