Concetti addizionali: come controllare gli attivatori? Espressione tessuto-specifica o inducibile di fattori di trascrizione costitutivamente attivi Attivazione post-traduzionale di fattori inattivi (es. tramite fosforilazione) Regolazione della localizzazione cellulare (e.s sequestramento nel citoplasma) Attivazione mediata da ligando (es. ormoni steroidei) Attivazione/repressione trascrizionale a lungo raggio: Le regioni di controllo di un locus (Locus Control Regions – LCR) Le regioni di attacco alla matrice nucleare (MAR) Gli isolatori Attivazione/repressione trascrizionale a lungo raggio: Regioni cromosomali trascrizionalmente attive (eucromatina) Regioni cromosomali trascrizionalmente inattive (eterocromatina) Fenomeno del silenziamento posizionale o eterocromatizzazione Lo sviluppo di neoplasie comporta sempre anomalie nell’espressione genica: Fattori di trascrizione come oncogeni. Esempio: attivazione inserzionale c) Attivazione tramite traslocazione nel gene della catena pesante delle Ig – t(8;14) -> LINFOMA DI BURKITT Fattori trascrizionali come soppressori di tumore. Esempio: p53 • La stabilizzazione di p53 causata da danno al DNA induce l’espressione di p21, un inibitore delle cinasi ciclina-dipendenti • l’ inibizione dell’attivita’ cinasica delle cicline Cdk1, 2, 4 e 6 provoca arresto del ciclo cellulare L’importanza delle acetilasi degli istoni: CBP/p300 • L’assenza di CBP nel topo causa lo sviluppo di tumori ematologici (simile alla sindrome Rubinstein-Taybi, associata all’inattivazione dell’attivita’ enzimatica di CBP) • Possibile meccanismo: ridotta attivita’ di p53 •Gli oncogeni virali SV40 large T e E1A dell’adenovirus bloccano CBP e necessitano di questa attivita’ per trasformare le cellule: coinvolgimento di p53? • Il virus oncogeno HTLV-1 necessita di CBP per attivare la trascrizione del suo genoma: Acetilazione aberrante nel cancro:coinvolgimento sia di HAT che di HDAC HAT: Geni codificanti per diverse HAT si trovano traslocati, amplificati, sovraespressi e/o mutati in diversi tipi di tumori, sia ematologici che epiteliali Mutazioni missenso o associate a p300 tronca NON FUNZIONALE si trovano associate a tumori del colon/retto e gastrici (secondo allele deletato) Gli individui con sindrome di Rubinstein-Taybi portano una mutazione che inattiva l’attività HAT di CBP -> aumentato rischio di tumori L’80% dei glioblastomi mostra associazione con perdita di eterozigosi per p300 perdita di eterozigosi attorno al locus di CBP è associata a carcinomi epatocellulari. Traslocazioni di p300 e CBP risultanti in fusioni in frame con diversi geni -> associate a diversi tumori ematologici HDAC e cancro HDAC: Leucemia acuta promielocitica (APL): PML-RARa, l’oncoproteina generata da una fusione per traslocazione cromosomica, reprime i geni normalmente attivati da RARa mediante reclutamento di un co-repressore contenente attività HDAC Linfoma non-Hodgkin: il repressore trascrizionale LAZ3 è anormalmente sovraespresso e causa repressione trascrizionale aberrante (HDAC dipendente) con conseguente trasformazione tumorale La leucemia acuta mieloide M2 è associata con t(8;21) che genera una proteina di fusione AML1/ETO che agisce come un potente repressore trascrizionale dominante tramite reclutamento di HDAC Uno squilibrio nell’acetilazione degli istoni può quindi causare alterazioni della struttura della cromatina e regolazione aberrante di geni coinvolti nel controllo del ciclo cellulare, del differenziamento e/o dell’apoptosi Inibitori delle HDAC: una nuova terapia anti-cancro Diverse sostanze che causano differenziamento, arresto della crescita e/o apoptosi di cellule trasformate -> inibitori di HDAC (es. DMSO, Tricostatina A (TSA), butirrato) Questi inibitori causano arresto del ciclo cellulare in G1 o G2, differenziamento e/o apoptosi in vitro, documentati in tutti i tipi cellulari trasformati incluse linee cellulari derivate sia da tumori ematologici (leucemie, linfomi, mielomi) che epiteliali (tumore dei polmoni, delle ovaie, del seno, della prostata) Le concentrazioni biologicamente attive correlano con quelle richieste per causare accumulazione di istoni acetilati SI IGNORA quali siano gli HDAC la cui attività deve essere bloccata Gli inibitori causano aumento dell’ acetilazione sugli istoni (H2A, H2B, H3 e H4) anche in cellule normali, ma l’attività di soppressione della crescita sembra essere limitata alle cellule trasformate. Geni bersaglio: CDKN1A (codificante per l’inibitore dell’attività cinasica ciclinadipendente p21/WAF1) (tramite un sito di SP1 sul promotore) CDKN2A (p16) Ciclina E Altro meccanismo per reprimere la trascrizione: la metilazione del DNA La metilazione nei vertebrati avviene esclusivamente sui residui di C nel dinucleotide CpG Le sequenze CpG sono sotto-rappresentate nel genoma (probabilmente per la tendenza della 5-metilcitosina a venire deaminata e mutata in T) -> ma abbondanti nelle regioni promotrici dei geni In cellule non embrionali, 80% dei CpG sono metilati, ad eccezione delle isole CpG dei promotori Le DNA metil-transferasi (Dnmt) hanno particolare affinità per le sequenze semi-metilate: tendono quindi a metilare il nuovo filamento che si è formato su uno stampo metilato-> mantenimento del pattern di metilazione La metilazione è regolata durante lo sviluppo: Il DNA viene ipermetilato nei gameti Demetilato durante le prime divisioni cellulari Successivamente rimetilato in modo specifico per i diversi tipi cellulari (modificazione epigenetica) Funzioni della metilazione: Difesa contro i trasposoni Regolazione genica Metilazione e regolazione genica: Dnmt metilano il DNA Il DNA metilato è legato da proteine che legano il metile (MeCP2, MBD1-4) Queste a loro volta sono in grado di reclutare diversi HDAC -> repressione della trascrizione Il pattern di metilazione dei geni è alterato nelle cellule tumorali, e metilazione alle isole CpG di certi geni è associata al loro silenziamento specifico (es. PML-RAR lega il promotore del gene RARb e causa il reclutamento di DNMT -> metilazione -> MBD -> HDAC) La metilazione è il meccanismo su cui si basa l’imprinting Modificazioni epigenetiche, trascrizione e ambiente In quanto reversibili, i cambiamenti epigenetici possono essere modificati dall’ambiente Sia ipo- che iper-metilazione sono stati associati all’invecchiamento (perdita generica di metilazione, ipermetilazione di geni specifici: silenziamento di soppressori tumorali?) Vitamine quali l’acido folico, che sono importanti per l’attività degli enzimi che forniscono gruppi metilici, hanno effetti notevoli sull’incidenza di tumori quali in cancro al colon Dieta scarsa in folati -> instabilità genomica e ipometilazione Dieta scarsa di gruppi metilici -> cancro del fegato, e ipometilazione+sovraespressione di oncogeni (c-ras, c-myc, c-fos) Cooperatività tra inibitori di HDAC e di DNMT 5-aza-2’-desossicitidina (inibitore di DNMT1) -> ipometilazione e riattivazione di soppressori di tumori silenziati Può cooperare con inibitori dele HDAC quali TSA Con potenziale riduzione delle dosi richieste e della tossicità, e minori possibilità di insorgenza di meccanismi di resistenza