Università degli Studi di Siena
SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN SCIENZE CHIMICHE
A/A 2011-2012 CICLO XXVII
Dottorando: Dr. Giannotti Luca
Tutor proposto: Prof. M. Taddei
Titolo del progetto di ricerca:
Nuove molecole selettive per il controllo della modulazione epigenetica
Dopo la risoluzione del genoma umano, è apparso chiaro che, per governare le molteplici
funzioni dell’organismo, fosse necessario un ulteriore livello di informazione. Questo livello di
informazioni è detto “epigenetica” ed indica le alterazioni ereditarie dell’espressione genica
non attribuibili a modifiche del codice genetico.1 I processi molecolari che definiscono il
“codice epigenetico” ad oggi noti sono la metilazione e idrossimetilazione non codificata di
RNA e DNA e le modifiche post-traslazionali degli istoni e di altre proteine. 2 Tra le
trasformazioni più importanti c’è l’acetilazione/deacetilazione dei residui di lisina degli istoni e
di altre proteine coinvolte in tutti i processi correlati con l’espressione genica. 3 Proprio per
questa ragione le modulazioni epigenetiche determinano variazioni nell’espressione dei geni e
sono quindi associate con numerose patologie quali tumori, depressione ed altri tipi di malattie
neurodegenerative.4
Tra gli enzimi coinvolti nella modulazione epigenetica, l’istone deacetilasi (HDAC) gioca un
ruolo fondamentale, sia per quanto riguarda le modifiche del core istonico della cromatina che
per la sua capacità di deacetilare anche altre proteine coinvolte nei processi di tumorogenesi
come la tubulina o HSP90.5
Sono state identificate 4 diverse classi di HDAC di cui 3 contenenti Zn (Classe I: HDAC1, 2, 3
e 8; Classe IIa: HDAC4, 5, 7 e 9; Classe IIb: HDCA6 e 10; Classe IV: HDAC11) ed una che
comprende una serie di enzimi che dipendono da NAD+ e che sono detti Sirtuine (Classe III).6
Anche se recentemente alcuni inibitori di HDAC hanno raggiunto il mercato farmaceutico,
sono state numerose le difficoltà incontrate durante lo studio nelle fasi cliniche. Tale difficoltà
è stata imputata alla mancanza di selettività, che può essere originata dal fatto che
l’ottimizzazione delle strutture è realizzata attraverso studi SAR o modeling su enzimi isolati 7
senza tener conto dell’influenza sull’ attività in vivo esercitata dalla formazione dei complessi
proteici.8
Per superare questo problema, in questo progetto si propone la preparazione di molecole con
design innovativo che dovrebbero svolgere la loro funzione attraverso l’alterazione dei processi
di formazione e funzionamento dei complessi proteici. In tal modo dovrebbe essere possibile
accedere ad una serie di molecole capaci di modulare il processo epigenetico in maniera
selettiva agendo sui complessi e sulla possibilità di deacetilare proteine diverse dagli istoni.
Da uno studio di modeling e di analisi delle strutture cristallografiche di alcuni istoni, è stata
evidenziata la presenza di un secondo ione Zinco in alcune isoforme di HDAC presenti nei
complessi. Dovranno quindi essere sintetizzate una serie di molecole in grado di interagire non
solo con l’atomo di Zinco presente nel sito enzimatico di HDAC (per il quale sono ben note le
caratteristiche strutturali ed elettroniche richieste), ma anche con il secondo atomo di Zinco,
presente solamente in alcune isoforme, che riveste un ruolo strutturale ed è coinvolto nella
formazione dei complessi multiproteici responsabili dell’effettivo funzionamento delle diverse
isoforme.9
In un precedente studio preliminare sono state sintetizzate una serie di molecole basate sulla
struttura del SAHA al quale era stata aggiunto, attraverso uno spaziatore, un secondo gruppo
legante per lo Zinco con l’obiettivo di bloccare entrambe i siti metallici.
Le molecole preparate avevano una struttura generale del tipo 1 o 2 nello schema seguente.
Effettuando però test di selettività sulle varie isoforme isolate di HDAC non si sono riscontrati
effetti di attività, specialmente se confrontati con i valori delle molecole di riferimento con X =
CH3.
Per questa ragione, in questo progetto si propone di partire da molecole che presentano di per
se una certa attività e di verificare se l’introduzione del secondo “braccio” legante possa
migliorarne l’attività.
Come modelli verranno presi in considerazione una serie di lattoni precedentemente sviluppati
in Sigma-tau (strutture 3) che risultano sia discretamente citotossici (IC50 su cellule H460 =
2.5 µM) che particolarmente selettivi su HDAC di classe I (selettività media I/II > 100) e lo
scheletro di base di LAQ824, un prodotto Novartis molto potente ma poco selettivo (strutture
4).10
Per entrambi gli scaffolds molecolari verranno introdotti dei gruppi leganti X del tipo ammina,
guanidina, alcole, tiolo o acido idrossamico con uno spaziatore di dimensioni diverse per poter
modulare correttamente il raggiungimento del secondo atomo di Zinco (ione strutturale).
Si prevede pertanto la preparazione di una collezione di 10-30 molecole diverse da testare sia a
livello di citotossicità sia a livello di interazione con il complesso proteomico.
All’identificazione di un possibile hit tra la prima serie di molecole preparate, seguirà
l’ottimizzazione con variazioni sia sullo scheletro strutturale di riferimento che sullo spacer e
sui gruppi leganti, utilizzando principalmente lo strumento del modeling computazionale e del
docking sulle strutture dei singoli HDAC e (possibilmente) sui complessi.
In tal modo dovrebbe essere possibile ottenere molecole particolarmente selettive per HADC di
classe I in grado di modulare eventuali manifestazioni epigenetiche associate a tumori alla
prostata, tumori gastro-rettali e tumori al polmone, tutte patologie nelle quali la
sovraespressione di HDAC1, 2 e 3 è ben documentata.11
1
Gottschling, D. E. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 2004, 69, 507.
Handel, A. E.; Ramagopalan, S. V. Genetics, 2009, 182, 1397.
3
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4
Kalin, J.H.; Vincent, K.; Kozikowski, A. P. Curr. Opin. Chem. Biol. 2009, 13, 263
5
Hubbert C, et al. Nature 2002, 417, 455. Bali P., et al. J Biol Chem 2005, 280, 26729.
6
Gregoretti, I.V., Lee, Y.M.; Goodson, H.V. J. Mol. Biol. 2004, 338,17.
7
Bolden, J.E.; Peart, M.J.; Johnstone, R.W.; Nat. Rev. Drug Discov. 2006, 5, 769.
8
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9
Fiener, R. Curr. Top. Med. Chem. 2009, 9, 235.
10
Cho, Y. S. et al. J. Med. Chem. 2010, 53, 2952.
11
Bertrand, P. Eur. J. Med. Chem. 2010, 45, 2095.
2
