TUTOR Prof. De Giorgio Roberto TITOLO DEL PROGETTO La stipsi cronica nel paziente con Morbo di Parkinson: Ruolo delle alterazioni dell'innervazione, della glia e della barriera epiteliale enterica. DESCRIZIONE DEL PROGETTO Stato dell’Arte e Razionale Varie condizioni patologiche, tra cui le malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale (SNC) – come il morbo di Parkinson (MP) – possono coinvolgere il sistema nervoso enterico (SNE), uno dei principali meccanismi di controllo delle funzioni gastrointestinali (GI) (Fasano & Pfeiffer, 2015; Furness, 2006). Oltre alle alterazioni neurologiche motorie somatiche, i pazienti con MP manifestano segni e sintomi GI riferibili a disfunzioni del SNE (Aminoff, 2001). Tra queste, la stipsi cronica severa (SC) può essere identificata sin dalle fasi precoci della malattia, precedendo di anni la comparsa dei disturbi centrali (Derkinderen et al., 2011). La relazione tra MP e SNE ha portato a postulare l’ “ipotesi di Braak”, secondo cui il SNE rappresenta “la porta di accesso” a noxae esterne e “il luogo di origine” di alterazioni neuronali, che poi si diffondono al SNC (Braak et al., 2006). Data l’ampia superficie intestinale (circa 400 m2), è possibile che le anomalie che colpiscono l’integrità morfo-funzionale del SNE traggano origine da una maggiore permeabilità della barriera epiteliale intestinale (BEI). Come già dimostrato in varie condizioni patologiche (Marchiando et al., 2010), anche nella MP noxae provenienti dal lume intestinale passano, attraverso una BEI più permeabile, nel versante sottomucoso dove innescano processi immunomediati / infiammatori, contribuendo alla genesi dei disturbi GI. A supporto di tali meccanismi, recenti dati mostrano una compromissione dell’ecosistema intestinale (o gut microbiota) nei pazienti con MP e disturbi GI (Scheperjans et al., 2015). La BEI esercita un essenziale ruolo di protezione dall’ingresso di noxae esterne, oltre al controllo della secrezione e dell’assorbimento dei fluidi tramite il mantenimento delle tight junction (TJ). Queste sono costituite da varie proteine: di membrana (occludine, claudine, JAM); del complesso giunzionale (ZO-1, ZO-2, ZO-3); del citoscheletro (Visser, 2009). Recenti evidenze dimostrano che le cellule gliali, parte integrante del SNE, contribuiscono al mantenimento della BEI, seppur con meccanismi non ancora completamente definiti (Neunlist et al., 2014). La glia enterica risente di stimoli, quali l’infiammazione, risultandone “attivata”, con un aumento di espressione della glial fibrillary acid protein (GFAP) (De Giorgio et al., 2012). Alterazioni della glia enterica si associano quindi a risposte infiammatorie e a fenomeni degenerativi che possono modificare il SNE. In sintesi BEI, cellule gliali e neuroni enterici, sono strettamente interconnessi, esercitando un ruolo fondamentale nella fisiologia e fisiopatologia GI. Tali aspetti restano a tutt’oggi non ben definiti nei pazienti con MP e disturbi GI come la stipsi. Obiettivi La presente ricerca ha l’obiettivo di caratterizzare le alterazioni della BEI e dell’espressione delle cellule gliali in biopsie della mucosa di colon da pazienti stitici con MP rispetto a pazienti stitici (non parkinsoniani) e controlli asintomatici. Il progetto è volto a: ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA SEDE AMMINISTRATIVA C/O AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA – POLICLINICO S. ORSOLA–MALPIGHI VIA MASSARENTI 9, PADIGLIONE 11 - 40138 BOLOGNA - ITALIA 1. analizzare l'espressione delle proteine delle TJ: occludina, claudina e ZO-1; 2. esaminare l'espressione della proteina GFAP identificabile nella glia enterica; 3. correlare i risultati delle analisi sperimentali con i parametri neurologici (UPDRS) e gastrointestinali (sintomatologici, tempi di transito e manometria ano-rettale) dei soggetti inclusi nello studio. Metodologia (descrizione del campione, principali tecniche utilizzate, aspetti biostatistici, fattibilità…) - Descrizione del campione Verranno studiati 30 soggetti di ambo i sessi e età compresa tra 50-75 anni, di cui 10 affetti da MP e SC (definita tramite i criteri di Roma III), 10 da SC e 10 controlli asintomatici. L’arruolamento dei pazienti è già stato approvato dal comitato etico (66/2011/U/Tess). L’assegnista svolgerà attività di ricerca laboratoristica, non compiti assistenziali (a carico del tutor). - Principali tecniche utilizzate Lo studio prevede n=4 biopsie mucose ottenute in corso di rettosigmoidoscopia di routine: 1) Congelamento di n=2 biopsie mucose di colon discendente da cui si separerà la sottomucosa con la componente neuronale e gliale; 2) estrazione di RNA e proteine da altre n=2 biopsie mucose di colon; 3) analisi immunoistochimica / immunofluorescenza della distribuzione di Occludina, Claudina, ZO-1 e GFAP; 4) analisi dell’espressione proteica mediante western blot di Occludina, Claudina, ZO-1e GFAP; 5) analisi dell’espressione genica mediante real-time PCR quantitativa di Occludina, Claudina, ZO-1e GFAP; 6) analisi statistica dei dati; 7) correlazioni tra dati morfofunzionali e parametri clinici. - Aspetti biostatistici I dati di espressione proteica e genica, saranno analizzati mediante test non parametrici per il confronto tra gruppi (ANOVA). Le associazioni tra le analisi sperimentali e i parametri clinici dei pazienti saranno effettuate mediante opportuni test di correlazione. - Fattibilità Il laboratorio possiede un'ampia conoscenza clinica e laboratoristica delle problematiche relative al SNE, alla SC con/senza MP, condizioni necessarie per la realizzazione del progetto. Risultati attesi L'evidenza di alterazioni della BEI e dell’attivazione gliale nei pazienti con stipsi e MP potrebbe mettere in luce uno dei meccanismi responsabili delle alterazioni GI (la stipsi) nei parkinsoniani. Questo dato, se fosse confermato, porterebbe rafforzare l’ipotesi di Braak sulla genesi della MP tramite il SNE. Inoltre, l’approfondimento dei meccanismi molecolari alla base della stipsi cronica severa nella MP potrebbe suggerire nuovi target terapeutici. ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA SEDE AMMINISTRATIVA C/O AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA – POLICLINICO S. ORSOLA–MALPIGHI VIA MASSARENTI 9, PADIGLIONE 11 - 40138 BOLOGNA - ITALIA DESCRIZIONE DELLE ATTIVITÀ DELL’ASSEGNISTA - Competenze richieste L’assegnista dovrà dimostrare di possedere conoscenze sull’anatomia, della fisiologia e della fisiopatologia del SNE. Risulta fondamentale un buon livello esperienza di ricerca di base, in particolare delle tecniche previste dal presente progetto, accompagnato dalla capacità di gestire in maniera autonoma la pianificazione del lavoro sperimentale. Dovranno inoltre essere note adeguate conoscenze delle basi e dei programmi per effettuare l’analisi statistica, nonché uno spiccato senso critico nella valutazione dei risultati. Non ultimo, è richiesto un buon livello di scrittura di lavori scientifici in lingua inglese. Nello specifico è richiesta esperienza in: - Congelamento dei campioni per il taglio al criostato; - Taglio al criostato; - Estrazione di acidi nucleici (RNA) e proteine; - Western blot; - Real-time PCR quantitativa; - Immunoistochimica / immunofluorescenza; - Analisi d’immagine al microscopio ottico e a fluorescenza - Analisi statistica. - Scansione temporale della formazione Il primo mese di attività sarà dedicato alla conoscenza dei membri del gruppo di ricerca e dell’ambiente del laboratorio, all’approfondimento delle tecniche richieste, nonché all’approccio con le strumentazioni a disposizione. Successivamente il vincitore sarà tenuto a iniziare lo svolgimento del progetto di ricerca, partendo dalla messa a punto dei parametri e delle variabili sperimentali, godendo del supporto degli altri membri del gruppo. Il fine sarà quello di svolgere gli esperimenti e l’analisi dei dati in maniera quanto più possibile autonoma. - Scansione temporale dell’attività Il presente progetto è diviso nelle seguenti fasi: 1) 1-4 mesi: processamento dei tessuti per ottenere preparazioni adatte alle successive analisi sperimentali; messa a punto delle tecniche di immunofluorescenza, western blot e real-time PCR quantitativa. 2) 4-6 mesi: esecuzione degli esperimenti di immunofluorescenza e acquisizione dei relativi dati. 3) 6-10 mesi: esecuzione degli esperimenti di espressione proteica e espressione genica. 4) 10-12 mesi: analisi statistica dei dati sperimentali e correlazioni cliniche. - Obiettivi Obiettivi dell’assegnista saranno: 1) la messa punto le procedure sperimentali necessarie allo svolgimento del progetto; 2) lo svolgimento delle attività sperimentali in maniera costante e produttiva, facendo fronte agli eventuali problemi che potranno presentarsi e interfacciandosi coni membri del gruppo; 3) l’ottenimento di dati originali e consistenti, pertinenti allo scopo del presente progetto; 4) la produzione di un lavoro di ricerca idoneo per essere pubblicato su riviste scientifiche internazionali. Scheda attività assistenziale (se prevista) ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA SEDE AMMINISTRATIVA C/O AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA – POLICLINICO S. ORSOLA–MALPIGHI VIA MASSARENTI 9, PADIGLIONE 11 - 40138 BOLOGNA - ITALIA PIANO DELLE ATTIVITÀ ASSISTENZIALI DELL’ASSEGNISTA ATTIVITÀ N. ORE SETTIMANA N/A N/A ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA SEDE AMMINISTRATIVA C/O AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA – POLICLINICO S. ORSOLA–MALPIGHI VIA MASSARENTI 9, PADIGLIONE 11 - 40138 BOLOGNA - ITALIA