piano di attività

TUTOR
Prof. De Giorgio Roberto
TITOLO DEL PROGETTO
La stipsi cronica nel paziente con Morbo di Parkinson: Ruolo delle alterazioni
dell'innervazione, della glia e della barriera epiteliale enterica.
DESCRIZIONE DEL PROGETTO
Stato dell’Arte e Razionale
Varie condizioni patologiche, tra cui le malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale
(SNC) – come il morbo di Parkinson (MP) – possono coinvolgere il sistema nervoso enterico
(SNE), uno dei principali meccanismi di controllo delle funzioni gastrointestinali (GI) (Fasano &
Pfeiffer, 2015; Furness, 2006). Oltre alle alterazioni neurologiche motorie somatiche, i pazienti con
MP manifestano segni e sintomi GI riferibili a disfunzioni del SNE (Aminoff, 2001). Tra queste, la
stipsi cronica severa (SC) può essere identificata sin dalle fasi precoci della malattia, precedendo di
anni la comparsa dei disturbi centrali (Derkinderen et al., 2011). La relazione tra MP e SNE ha
portato a postulare l’ “ipotesi di Braak”, secondo cui il SNE rappresenta “la porta di accesso” a
noxae esterne e “il luogo di origine” di alterazioni neuronali, che poi si diffondono al SNC (Braak
et al., 2006). Data l’ampia superficie intestinale (circa 400 m2), è possibile che le anomalie che
colpiscono l’integrità morfo-funzionale del SNE traggano origine da una maggiore permeabilità
della barriera epiteliale intestinale (BEI). Come già dimostrato in varie condizioni patologiche
(Marchiando et al., 2010), anche nella MP noxae provenienti dal lume intestinale passano,
attraverso una BEI più permeabile, nel versante sottomucoso dove innescano processi immunomediati / infiammatori, contribuendo alla genesi dei disturbi GI. A supporto di tali meccanismi,
recenti dati mostrano una compromissione dell’ecosistema intestinale (o gut microbiota) nei
pazienti con MP e disturbi GI (Scheperjans et al., 2015).
La BEI esercita un essenziale ruolo di protezione dall’ingresso di noxae esterne, oltre al controllo
della secrezione e dell’assorbimento dei fluidi tramite il mantenimento delle tight junction (TJ).
Queste sono costituite da varie proteine: di membrana (occludine, claudine, JAM); del complesso
giunzionale (ZO-1, ZO-2, ZO-3); del citoscheletro (Visser, 2009). Recenti evidenze dimostrano che
le cellule gliali, parte integrante del SNE, contribuiscono al mantenimento della BEI, seppur con
meccanismi non ancora completamente definiti (Neunlist et al., 2014). La glia enterica risente di
stimoli, quali l’infiammazione, risultandone “attivata”, con un aumento di espressione della glial
fibrillary acid protein (GFAP) (De Giorgio et al., 2012). Alterazioni della glia enterica si associano
quindi a risposte infiammatorie e a fenomeni degenerativi che possono modificare il SNE. In sintesi
BEI, cellule gliali e neuroni enterici, sono strettamente interconnessi, esercitando un ruolo
fondamentale nella fisiologia e fisiopatologia GI. Tali aspetti restano a tutt’oggi non ben definiti nei
pazienti con MP e disturbi GI come la stipsi.
Obiettivi
La presente ricerca ha l’obiettivo di caratterizzare le alterazioni della BEI e dell’espressione delle
cellule gliali in biopsie della mucosa di colon da pazienti stitici con MP rispetto a pazienti stitici
(non parkinsoniani) e controlli asintomatici.
Il progetto è volto a:
ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
SEDE AMMINISTRATIVA C/O AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA – POLICLINICO S. ORSOLA–MALPIGHI
VIA MASSARENTI 9, PADIGLIONE 11 - 40138 BOLOGNA - ITALIA
1. analizzare l'espressione delle proteine delle TJ: occludina, claudina e ZO-1;
2. esaminare l'espressione della proteina GFAP identificabile nella glia enterica;
3. correlare i risultati delle analisi sperimentali con i parametri neurologici (UPDRS) e
gastrointestinali (sintomatologici, tempi di transito e manometria ano-rettale) dei soggetti inclusi
nello studio.
Metodologia (descrizione del campione, principali tecniche utilizzate, aspetti biostatistici, fattibilità…)
- Descrizione del campione
Verranno studiati 30 soggetti di ambo i sessi e età compresa tra 50-75 anni, di cui 10 affetti da MP
e SC (definita tramite i criteri di Roma III), 10 da SC e 10 controlli asintomatici. L’arruolamento
dei pazienti è già stato approvato dal comitato etico (66/2011/U/Tess). L’assegnista svolgerà attività
di ricerca laboratoristica, non compiti assistenziali (a carico del tutor).
- Principali tecniche utilizzate
Lo studio prevede n=4 biopsie mucose ottenute in corso di rettosigmoidoscopia di routine:
1) Congelamento di n=2 biopsie mucose di colon discendente da cui si separerà la sottomucosa con
la componente neuronale e gliale; 2) estrazione di RNA e proteine da altre n=2 biopsie mucose di
colon; 3) analisi immunoistochimica / immunofluorescenza della distribuzione di Occludina,
Claudina, ZO-1 e GFAP; 4) analisi dell’espressione proteica mediante western blot di Occludina,
Claudina, ZO-1e GFAP; 5) analisi dell’espressione genica mediante real-time PCR quantitativa di
Occludina, Claudina, ZO-1e GFAP; 6) analisi statistica dei dati; 7) correlazioni tra dati morfofunzionali e parametri clinici.
- Aspetti biostatistici
I dati di espressione proteica e genica, saranno analizzati mediante test non parametrici per il
confronto tra gruppi (ANOVA). Le associazioni tra le analisi sperimentali e i parametri clinici dei
pazienti saranno effettuate mediante opportuni test di correlazione.
- Fattibilità
Il laboratorio possiede un'ampia conoscenza clinica e laboratoristica delle problematiche relative al
SNE, alla SC con/senza MP, condizioni necessarie per la realizzazione del progetto.
Risultati attesi
L'evidenza di alterazioni della BEI e dell’attivazione gliale nei pazienti con stipsi e MP potrebbe
mettere in luce uno dei meccanismi responsabili delle alterazioni GI (la stipsi) nei parkinsoniani.
Questo dato, se fosse confermato, porterebbe rafforzare l’ipotesi di Braak sulla genesi della MP
tramite il SNE. Inoltre, l’approfondimento dei meccanismi molecolari alla base della stipsi cronica
severa nella MP potrebbe suggerire nuovi target terapeutici.
ALMA MATER STUDIORUM - UNIVERSITÀ DI BOLOGNA
SEDE AMMINISTRATIVA C/O AZIENDA OSPEDALIERO-UNIVERSITARIA – POLICLINICO S. ORSOLA–MALPIGHI
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DESCRIZIONE DELLE ATTIVITÀ DELL’ASSEGNISTA
- Competenze richieste
L’assegnista dovrà dimostrare di possedere conoscenze sull’anatomia, della fisiologia e della
fisiopatologia del SNE. Risulta fondamentale un buon livello esperienza di ricerca di base, in
particolare delle tecniche previste dal presente progetto, accompagnato dalla capacità di gestire in
maniera autonoma la pianificazione del lavoro sperimentale. Dovranno inoltre essere note adeguate
conoscenze delle basi e dei programmi per effettuare l’analisi statistica, nonché uno spiccato senso
critico nella valutazione dei risultati. Non ultimo, è richiesto un buon livello di scrittura di lavori
scientifici in lingua inglese.
Nello specifico è richiesta esperienza in:
- Congelamento dei campioni per il taglio al criostato;
- Taglio al criostato;
- Estrazione di acidi nucleici (RNA) e proteine;
- Western blot;
- Real-time PCR quantitativa;
- Immunoistochimica / immunofluorescenza;
- Analisi d’immagine al microscopio ottico e a fluorescenza
- Analisi statistica.
- Scansione temporale della formazione
Il primo mese di attività sarà dedicato alla conoscenza dei membri del gruppo di ricerca e
dell’ambiente del laboratorio, all’approfondimento delle tecniche richieste, nonché all’approccio
con le strumentazioni a disposizione. Successivamente il vincitore sarà tenuto a iniziare lo
svolgimento del progetto di ricerca, partendo dalla messa a punto dei parametri e delle variabili
sperimentali, godendo del supporto degli altri membri del gruppo. Il fine sarà quello di svolgere gli
esperimenti e l’analisi dei dati in maniera quanto più possibile autonoma.
- Scansione temporale dell’attività
Il presente progetto è diviso nelle seguenti fasi:
1) 1-4 mesi: processamento dei tessuti per ottenere preparazioni adatte alle successive analisi
sperimentali; messa a punto delle tecniche di immunofluorescenza, western blot e real-time PCR
quantitativa.
2) 4-6 mesi: esecuzione degli esperimenti di immunofluorescenza e acquisizione dei relativi dati.
3) 6-10 mesi: esecuzione degli esperimenti di espressione proteica e espressione genica.
4) 10-12 mesi: analisi statistica dei dati sperimentali e correlazioni cliniche.
- Obiettivi
Obiettivi dell’assegnista saranno:
1) la messa punto le procedure sperimentali necessarie allo svolgimento del progetto;
2) lo svolgimento delle attività sperimentali in maniera costante e produttiva, facendo fronte agli
eventuali problemi che potranno presentarsi e interfacciandosi coni membri del gruppo;
3) l’ottenimento di dati originali e consistenti, pertinenti allo scopo del presente progetto;
4) la produzione di un lavoro di ricerca idoneo per essere pubblicato su riviste scientifiche
internazionali.
Scheda attività assistenziale (se prevista)
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PIANO DELLE ATTIVITÀ ASSISTENZIALI DELL’ASSEGNISTA
ATTIVITÀ
N. ORE SETTIMANA
N/A
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