relazione AdR 2342.14 - IRIS Verona

Università degli Studi di Verona
Dipartimento di Biotecnologie
RELAZIONE SCIENTIFICA FINALE
Assegno di Ricerca (AdR2342/14)
Nome e Cognome del Beneficiario
Dott.ssa Chiara Santi
Titolo del Programma di Ricerca
Strategie molecolari per l’acquisizione della
resistenza a stress biotici in piante di interesse
interesse agrario
Settore Scientifico Disciplinare di riferimento
BIO/04
Nome e Cognome del Responsabile Scientifico
Prof.ssa Tiziana Pandolfini
Durata dell’Assegno di Ricerca (da…a…)
1/10/2014 – 30/09/2015
Periodo di riferimento della relazione (da…a…)
1/10/2014 – 30/09/2015
Note
(es.: eventuali periodi di sospensione dell’Assegno, etc.)
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Università degli Studi di Verona
Dipartimento di Biotecnologie
DESCRIZIONE DELL’ATTIVITÀ DI RICERCA (presupposti/obbiettivi, metodologie applicate,
risultati intermedi e conclusivi, discussione)
L’assegno di ricerca ha previsto l’analisi molecolare di linee di portainnesto GF677 di pesco
putativamente trasformate mediante il costrutto antivirale ihp35S-PPV194.
Il costrutto a forcina ihp35S-PPV194 contiene il promotore 35S del virus del mosaico del
cavolfiore (CaMV) posto a monte di due porzioni di 194 bp ciascuna del genoma di PPV strain D
(X16415, dalla base 134 alla base 327) inserite come ripetizioni invertite e separate dall’introne
(lunghezza 115 bp) del gene LAX1 di Medicago truncatula. Una volta introdotto stabilmente nel
genoma del portainnesto GF677 mediante trasformazione genetica mediata da Agrobacterium
tumefaciens, l’espressione del costrutto innesca il meccanismo dell’RNA silencing e rende la
pianta resistente all’attacco da parte del Plum Pox Virus.
La trasformazione genetica del GF677 è stata condotta da membri del Dipartimento di Scienze
Agrarie, Alimentari ed Ambientali dell’Università Politecnica delle Marche.
Essendo il pesco una specie vegetale vegetale da cui risulta molto difficile estrarre DNA genomico
di buona qualità (in termini di purezza), poiché molto ricca in carboidrati, si sono rese necessarie
diverse prove preliminari per la messa a punto del protocollo di estrazione. Il metodo che ha
permesso di ottenere DNA genomico integro e puro ha previsto l’impiego, prima della lisi
cellulare, di un tampone di estrazione contenente alte concentrazioni di saccarosio (soluzione STE:
0.25 M saccarosio, 0.03 M Tris, 0.05 M EDTA; Kaufman et al., 1999), allo scopo di rimuovere i
carboidrati presenti nel tessuto vegetale. A questa fase è seguita poi una fase di lisi cellulare, che
ha previsto l’impiego del kit commerciale Nucleon Phytopure (GEHealthcare). Una volta messo a
punto il metodo per l’isolamento del DNA, si è proceduto ad analizzare, mediante tecniche di
PCR e Dot Blot, il materiale vegetale proveniente da diverse linee di GF677 putativamente
trasformate e cresciute in vitro. Da questa prima analisi alcune linee sono risultate positive sia
all’analisi PCR sia all’ibridazione con sonde opportunamente disegnate su diverse porzioni del
costrutto genico ihp35S-PPV194. Le linee una volta trasferite in terra ed ambientate in serra
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verranno analizzate mediante Southern blot allo scopo di identificare l’effettiva presenza di copie
del transgene nel genoma.
Parallelamente, mantenendo la struttura della cassetta genica del costrutto ihp35S-PPV194,
nell’ambito di questo assegno di ricerca, sono stati realizzati due nuovi costrutti genici antivirali.
Si è scelto di mantenere la struttura a forcina del costrutto e di sostituire il promotore 35S con due
diversi promotori tessuto-specifici, in particolare floema-specifici. L’impiego di promotori in
grado di guidare l’espressione del costrutto a forcina in maniera specifica nel floema, sembra
facilitare il movimento sistemico dell’RNA silencing (Pandolfini et al., 2003). E’ stata scelta la
sequenza regolatrice di 941 bp del gene SUC2 (sucrose transporter 2) di Arabidopsis thaliana
(JQ733913.1). E’ noto che il prodotto del gene Suc2 codifica per un trasportatore del saccarosio
localizzato nel floema (Srivastava et al., 2008 and 2009). L’altro costrutto contiene la sequenza
regolatrice di 980 bp del gene PP2 (phloem protein 2) di Arabidopsis thaliana, che codifica per un
prodotto proteico espresso nelle cellule compagne del floema (Zhang et al., 2011). Nonostante le
sequenze regolatrici scelte siano derivate dalla specie eterologa Arabidopsis, è riportato in
letteratura che l’espressione preferenziale nel floema è mantenuta anche in specie legnose (es:
Citrus sinensis) (Miyata et al., 2012; Dutt et al., 2012). I costrutti sono stati realizzati e clonati nel
T-DNA di un vettore derrelazioivativo del pBin19 ed successivamente introdotti in cellule di
Agrobacterium tumefaciens. Sono attualmente in corso prove di trasformazione della pianta
erbacea Nicotiana benthamiana, specie modello per lo studio delle infezioni virali, allo scopo di
verificare, una volta che le piante verranno infettate con il virus PPV, l’azione di questi promotori
nel conferire resistenza locale e sistemica al virus. Una volta testata l’efficacia di questi costrutti
nel conferire resistenza locale e sistemica al virus PPV in Nicotiana, verranno effettuate prove di
trasformazione sul portainnesto GF677.
Il Responsabile Scientifico
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(Firma)
L’Assegnista di Ricerca
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(Firma)
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