Università degli Studi di Perugia
Corso di Laurea Interfacoltà in Biotecnologie
Fondamenti di Bioinformatica e di Biologia dei Sistemi
Proteomica e Metabolomica
Elettroforesi nel laboratorio
di proteomica
Pier Luigi Orvietani
Biotecnologie 2011-2012
LE PROTEINE HANNO FUNZIONI BIOLOGICHE DIVERSE:
ENZIMI
PROTEINE DI TRASPORTO
PROTEINE DI RISERVA
PROTEINE CONTRATTILI O MOTILI
PROTEINE STRUTTURALI
PROTEINE DI DIFESA
PROTEINE REGOLATRICI
ECC.
DALLA SEQUENZA ALLA STRUTTURA:
La funzione di una proteina dipende dalla sua
sequenza aminoacidica
I FOGLIETTI BETA SONO STRUTTURE ESTESE CHE TALVOLTA FORMANO “BARILI”
La condensazione di elementi multipli di struttura secondaria porta alla
STRUTTURA TERZIARIA
Strutture della trioso fosfato isomerasi e dididro folato reduttasi: elementi di struttura
secondaria simili ma diversa struttura terziaria
PROTEINE INTEGRALI DI MEMBRANA
Si tratta di proteine inserite in un
ambiente idrofobico
Le alfa-eliche sono l’elemento
di struttura secondaria più
comune.
DALLA STRUTTURA ALLA FUNZIONE
Esistono molti livelli di funzione delle proteine, che si
articolano dalle semplici riorganizzazioni atomiche fino ai
cambiamenti nello sviluppo di un organismo
Tutti coinvolgono il legame con altre molecole
Il riconoscimento molecolare è alla base del
funzionamento di una proteina
Un esempio è l’attività catalitica
Biologia strutturale: capire la funzione attraverso la
struttura
LE FUNZIONI DI TUTTE LE PROTEINE DIPENDONO DALLA LORO
CAPACITA’ DI LEGARE ALTRE MOLECOLE : LIGANDI
INTERAZIONI LIGANDI-PROTEINE: INTERAZIONI NON COVALENTI TRA
SUPERFICIE PROTEICA E LIGANDO
VARIAZIONI DI CONFORMAZIONE DELLA PROTEINA:
POSSONO CONSENTIRE IL LEGAME
POSSONO FAVORIRLO
POSSONO IMPEDIRLO
IL RICONOSCIMENTO MOLECOLARE DIPENDE DA MICROAMBIENTI
SPECIALIZZATI CHE DERIVANO DALLA STRUTTURA TERZIARIA DELLA
PROTEINA
Espressione genica: il risultato finale della trascrizione + processamento
dell’RNA + sintesi della proteina e suo funzionamento, cioè il fenotipo.
GRANDE FAMIGLIA DEGLI “OMA”
PROTEOMICA: studia tutte le proteine espresse in un certo momento,
incluse le isoforme e le modifiche post-traduzionali
TRASCRITTOMICA: studia l'insieme degli mRNA trascritti nell'intero
organismo, tessuto, cellula
METABOLOMICA: studia la totalità dei metaboliti presenti in un organismo
LIPIDOMICA: studia la totalità dei lipidi
INTERATTOMICA: studia la totalità delle interazioni molecolari che hanno
luogo in un organismo; un nome che comunemente indica la disciplina della
interattomica è quello di biologia dei sistemi (system biology).
SPLICEOMICA: studia la totalità delle isoforme proteiche dovute a splicing
alternativo
Ecc.
LA PROTEOMICA
La proteomica è l’insieme delle tecnologie e degli approcci sviluppati per lo studio
del proteoma
PROTEOMA:
il termine proteoma, ormai universalmente accettato come
equivalente linguistico di genoma, fu coniato da M.R. Wilkins nel
1994 per definire il complemento proteico codificato da un genoma
Oggi la definizione di proteoma può essere ampliata considerando i seguenti
punti:
identifica tutte le proteine prodotte in una determinata cellula, tessuto o organismo;
definisce come queste proteine interagiscono tra loro
descrive la precisa localizzazione delle proteine all’interno della cellula
descrive infine l’esatta struttura tridimensionale di queste proteine (lo scopo è
quello di trovare il loro punto debole, ossia il punto in cui l’azione di un farmaco
potrebbe attivarne o disattivarne la funzione)
PERCHE’ STUDIARE IL PROTEOMA?
Il sequenziamento del DNA umano (progetto genoma) e lo studio
dell’espressione dell’mRNA (microarray) non forniscono tutte le informazione
necessarie per lo studio dei processi biologici:
malattie (2% delle malattie dell’essere umano sono caratterizzate dal difetto di
un singolo gene)
differenziamento
invecchiamento
effetti dell’ambiente
La diversità, la funzionalità e l’abbondanza proteica dipendono infatti anche da
altri meccanismi (regolazione della traduzione, folding, modificazioni posttraduzionali e degradazione proteica) che regolano l’espressione genica.
La proteomica permette di studiare l’espressione proteica di una cellula o
tessuto in un determinato momento, perché prende in considerazione il
prodotto finale dell’espressione genica, cioè le proteine.
La Proteomica ha come scopo base lo studio del proteoma.
Obiettivi della Proteomica sono l’identificazione e
l’eventuale sequenziamento delle proteine.
Identificare vuol dire saper riconoscere una proteina , mentre il
sequenziamento è una procedura che ha lo scopo di determinare l’esatta
sequenza peptidica di una proteina
Separare le proteine all’interno del Proteoma
Un metodo di separazione proteica è l’Elettroforesi
2D-Elettroforesi
2-D PAGE o BIDIMENSIONALE
Isoelectric focusing (IEF)
PUNTO ISOELETTRICO
SDS- Page
GRANDEZZA MOLECOLARE
Potenzialita’ della 2-DE
• Grande capacità di separazione e risoluzione di miscele
proteiche(2.000-3.000 proteine)ad elevato ordine di grandezza
• • Risoluzione estremamente alta
• • I gel 2 –DE sono collettori di frazioni proteiche molto efficienti
• • Proteine sono protette all’interno della matrice del gel
• Possibilità di confronto tra i dati
• Riproducibilità e affidabilità dei dati
• Capacità di rilevazione di modificazioni post-traduzionali delle
proteine
•
glicosilazione
•
fosforilazione
•
tagli proteolitici
• Possibilità di costruire o di usufruire di mappe di riferimento
disponibili in rete
campioni da analizzare
- Fluidi biologici (sangue, urine, saliva, CFS ecc.)
- Tessuti
Trattati sempre a 4°C
- Cellule
Congelati in azoto liquido e Stoccati in
aliquote in azoto liquido o tenute a – 80°C
Metodi di distruzione delle cellule e dei tessuti
frullatori : sono utilizzati per sospensioni di
cellule vegetali o animali, o per pezzi di tessuto.
omogenizzatori : il tessuto viene messo in un
provettone di vetro all'interno
del quale agisce un pestello di teflon o di
vetro (Potter).
Le membrane sono lacerate dalle forze
frizionali che il pestello esercita contro le
pareti del cilindro di vetro.
che può essere azionato a mano o mediante un
motore elettrico
Sonicazione: ideale per sospensioni cellulari,
onde sonore ad alta frequenza (> 20KHz) x
30”- 60” > > distruzione cellule per forze
taglianti e cavitazionali (compressione e
rarefazione dovuta a formazione e scoppio
bolle).
Per volumi “piccoli” ( max 100 ml)
aggiungendo ghiaccio (sviluppa calore).
La strumentazione utilizzata può essere di
due tipi:
-Bagnetto sonicatore
-Sonda sonicatrice
Per una buona separazione in 2DE il campione deve
essere il più possibile puro e privo di contaminanti
DNA
Lipidi
Sali
detergenti
polisaccaridi
Disturbano il processo di isoelettrofocalizzazione
e quello di colorazione del gel.
Metodi per diminuire tali interferenze
Precipitazione
Concentrazione con
taglio molecolare(cut-off)
Prepurificazione
cromatografica
PRECIPITAZIONE
La solubilità delle proteine è il risultato di interazioni polari dei loro residui
amminoacidici di superficie con le molecole di solvente acquoso, interazioni ioniche
con i sali presenti e varie forze repulsive tra molecole dotate di identica carica
Sono 5 gli agenti comunemente usati per
far precipitare le proteine:
sali inorganici
pH e temperatura
solventi organici
proteine basiche
polietilenglicole
PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI ORGANICI
La facilità o difficoltà con la quale la proteina viene impossibilitata a interagire col solvente
dipende largamente dalla natura dei residui amminoacidici di superficie. I solventi organici fanno
decrescere fortemente la solubilità proteica. Questo avviene a causa della diminuzione della
costante dielettrica del mezzo e grazie alla "deidratazione" (viene cioè impedita l'interazione con le
molecole d'acqua). Con la diminuzione della costante dielettrica di una soluzione le forze attrattive
tra residui di superficie di carica opposta aumenta e questo comporta la formazione di aggregati che
precipitano.
La temperatura alla quale avviene la precipitazione è un fattore importante perché in presenza di
solventi organici la solubilità diminuisce marcatamente insieme alla temperatura.
Solventi organici:
TCA
metanolo
acetone
MEZZO APOLARE
AGGREGAZIONE
TCA
Acetone
TCA in acetone
Metanolo-cloroformio
bassa efficienza
buona
bassa efficienza
buona solo per
piccoli volumi
Tributil fosfato-acetone-metanolo buona
CONCENTRATORI CENTRIFUGHI
Molecular Weight Cut-Off
Membrane filtranti con MWCO
Membrana da ultrafiltrazione
(sezione) vista al microscopio
elettronico
3000
5000
10000
30000
50000
100000
Volume in ml
0,5
2
4
6
15
UREA:
è un agente caotropico (denaturante) quindi in grado di portare ogni singola proteina ad avere una
sola ed unica conformazione e quindi migrazioni omogene e di mantenere in soluzione proteine
idrofobiche. Si usa a concentazioni 8-9M (alte)
TIOUREA:
è un agente caotropico più forte dell’Urea ed è in grado di solubilizzare meglio le proteine
idrofobiche. Si usa quindi per aumentare il potere solubilizzante, ma usato in combinazione con
l’UREA (7M UREA- 2M TIOUREA)].
L’azione denaturante aiuta ad inibire eventuali attività enzimatiche presenti in soluzione.
Limitazione
TEMPERATURA DI LAVORO
Non deve superare i 30°C, altrimenti potremmo avere
processi di carbamilazione
L’urea è in equilibrio con l’ammonio cianato, passando
per uno stadio intermedio che forma ammoniaca e acido
isocianico
La carbamilazione delle proteine porta alla modificazione
dei gruppi amminici o dei gruppi sulfidirilici liberi, quindi
NH2 terminale
o arginine , lisine o costeine con
conseguente perdita della possibilità per questi gruppi di
assumere una carica positiva => si ha una alterazione del
pI delle proteina i cui residui aminoacidici hanno subito
tale modificazione!
DETERGENTI
Il detergente viene utilizzato per aumentare la solubilità delle proteine idrofobiche.
In genere vengono utilizzati detergenti non carichi (NP-40, Triton X100, etc) o zwitterionici
(CHAPS, etc). Si usano a concentrazione che variano da 1 al 4%
Anche i detergenti concorrono nella denatuarzione delle proteine e nell’inibizione di attività
enzimatiche presenti nel campione.
Detergenti come NP-40 e Triton X100 sono non ionici e risultano essere abbastanza blandi
attenzione alle attività enzimantiche che vengono mantenute (proteasi attive)
SDS
L’SDS essendo una molecola carica negativamente e legandosi lo stesso alle proteine (forma
delle micelle detergente-proteine) non consente una corretta focalizzazione.
L’SDS risulta compatibile con una isoelettrofocalizzazione qualora esso sia presente nel lisato
finale ad una concentrazione minore dello 0,25% e si trovi in rapporto 1/8 (o ancora minore)
con detergenti nonionici o zwitterionici
RIDUCENTI
Agente riducente è necessario per rompere i ponti disolfuro S-S e mantenere in forma ridotta le
proteina. Generalmente si usa:
DTT – DiTioTreitolo o in alternativa il DTE – DiTio Eritritolo a concentrazioni 20-100mM
TBP a concentrazione 5mM
DTE suo epimero
DTT
LIMITAZIONI
A pH >8 il gruppo sulfidrilico del DTT diventa ionizzato e migra perciò verso l’anodo. Questo fatto
porta ad una perdita di DTT nelle regioni a pH >8 con conseguente perdita delle
caratteristiche riducenti dell’ambiente. Le proteine si ossidano in modo casuale con
formazione di ponti e acquisiscono carica, spostandosi dal loro punto isoelettrico (fenomeno
delle strisciate di proteine a pH >8 - Streaking).
Altre due strategie per evitare la formazione di ponti disolfuro sono:
1)
2)
Ridurre ed alchilare (con iodoacetamide – IAA) la proteina prima della IEF.
Ossidare i gruppi tiolici delle proteine a disulfidi misti => convertire tutti i gruppi tiolici in
una forma ossidata ma stabile (HED –Hydroxyethyldisulphide – DeStreak)
DeStreak
ANFOLINE
a) piccole molecole organiche polimeriche
b) altamente solubili
c) anfoteriche (presenza contemporanea di gruppi basici e acidici => hanno un pI determinato da
questi gruppi)
d) alto potere tamponante al loro pI.
Si usano nel lysis buffer per:
a) aumentare la solubilità delle proteine
b) prevenire interazioni proteine-gel
A seconda dell’intervallo di pH scelto per l’analisi di isolettrofocusing vengono selezionate miscele
di anfoliti su misura (IPG buffer - immobilzed pH gradient buffer).
B
B
B
A
B
H3C
CH3
A
A
B
B
A
B
A: gruppo acidico
B: gruppo basico
INIBITORI DI PROTEASI:
alcuni enzimi proteolitici riescono a rimanere attivi, anche se le condizioni di preparazione sono denaturanti
Per evitare una degradazione proteica durante le fasi che precedono la corsa elettroforetica , si usano:
Può essere utilizzato anche Tris Base fino a 40 mM,
che rende alcalino l’ambiente e neutralizza una
serie di proteasi attive in ambiente acido.
NUCLEASI
BLUE DI BROMOFENOLO
(tracce)
H H O H H O H
COOH
N C C N C C N
C H
R
R
R
catene laterali
COOH
COOH
H2N
acida
C
H2N
H
C
COOH
H
H2N C H
CH2
CH2
COOH
SH
CH2
polare
non dissociabile
CH2
COOH
H2 N
C
H
CH2
+ C NH
CH3
apolare
N H
basica
NH2
La carica netta di una proteina dipende
dal suo pI e dal pH dell’ambiente.
Una proteina mostra carica elettrica = 0 ad un pH = pI
mostra carica elettrica
+
ad un pH < pI
mostra carica elettrica
-
ad un pH > pI
+-
+
pI = 8
-
+-
+
pI = 6
-
+-
+
pI = 5
-
+-
+
3
pI = 4
4
5
6
pH
7
8
9
pI =
4
Elettroforesi nativa
5
Separazione basata sulla Carica
6
8
+
In una Elettroforesi condotta a pH costante,
solo quelle proteine con un pI = pH
non migrano
verso l’anodo o verso il catodo
+
-
pH costante = 6
-
Anfoline in fase liquida
Molecole anfotere a basso peso molecolare
Valori di pI leggermente spaziati con cui
possiamo creare un gradiente di pH
Inizialmente si sviluppavano in gel cilindrici
Sottoposte ad un campo elettrico migrano a
seconda della loro carica fino al pI
Per la loro elevata capacità tamponante in
ogni punto del gel il valore di pH sarà bene
preciso
Limitazioni delle anfoline
Effetto del “drift catodico”
Non buona riproducibilità tra esperimenti
nello stesso laboratorio e tra laboratori
differenti per la diversità dei lotti di
anfoline
Non focalizzazione delle
proteine basiche
Non possibilità di applicare una
quantità di proteine tale da
consentire successive
micronalisi per il
riconoscimento dei polipeptidi
IPG = Immobilized PH Gradient strip
Nel 1993 è stato sviluppato un metodo nel quale la
focalizzazione viene svolta su gradienti
IMMOBILIZZATI
Il gradiente è formato legando covalentemente un
gradiente di molecole cariche (immobiline) nel gel
Le IMMOBILINE sono derivati della acrilammide,
contenenti catene laterali con capacità tamponanti , che
vengono polimerizzate nel gel insieme alla acrilammide.
Il processo di formazione delle IPG è simile a quello di un
gel a gradiente
Nelle due camere vi sono rispettivamente un buffer acido
ed uno basico
La concentrazione dei buffer definisce il range di pH delle
strip che si vogliono formare.
Si versa su un supporto di plastica, si lava per allontanare i
catalizzatori ed i monomeri non polimerizzati,si secca e si
taglia a strip.
Il pH in ogni punto del gel è determinato dalla mistura
di immobiline che si trovano in quel punto.
Vantaggi delle immobiline
Gradiente di pH stabile perché è
immobilizzato
Buona separazione anche a pH
basici estremi
Possibilità di caricare grandi
quantitativi di materiale anche fino
a 12 mg
Riproducibilità delle mappe e
confronto dei dati fra diversi
laboratori
4
Proteine con
5
pI =
6
In una elettroforesi con
gradiente di pH immobilizzato,
le proteine migreranno verso il
rispettivo pI
8
IEF
+
3
IsoElectricFocusing
4
5
6
-
Separazione basata sul pI
7
8
9
IPG strip disponibili
Differenze di separazione fra due gradienti
Gradiente 3-10 lineare
Gradiente 3-10 Non lineare
Programma di focalizzazione
Reidratazione passiva
Reidratazione attiva
50V
300V
3h
300- 3500 V
1h
3500V
3h
3500- 9500 V
1h
9500V
fino a voltaggio desiderato
EQUILIBRAMENTO STRIP PER LA 2° DIMENSIONE
Iodoacetamide serve per alchilare
cariche delle
catene laterali
O
S
+
+
-+
--
O
+
+
--
SDS
O
Na
O
- -- -- - - - - - - -
+
Il trattamento con SDS conferisce a tutte le proteine una carica negativa
Esse migreranno in un Gel, sotto l’azione di un campo elettrico,
solo in funzione della loro grandezza (M)
Poliacrylamide gel
Tunnel di
diverso diametro
Campo Elettrico
Grandezze dei pori del gel
Dipende da due grandezze:
%T, %C
%T= (gr. Acrilammide + gr Bis-Acrilammide/ Volume totale) x100
%C= (gr Bis-Acrilammide/ gr. Acrilammide+gr. Bis-Acrillamide) x100
• % di acrilammide
consigliata
8%
10%
12%
16%
I gel possono essere:
%T costante
%T a gradiente
Il Gel
• Dimensioni delle
proteine
50-200 kDa
30-150 kDa
10-100 kDa
5-80 kDa
per es. 8-16%
JpH
4
5
6
7
8
-
kD
40
30
20
10
+
SDS – 2D PAGE
SDS – 2D PAGE
pI
kD
100
50
40
Ogni proteina (spot)
è caratterizzata
da Mr - pI
30
20
10
4
5
6
7
8
Metodi per la rilevazione di spot proteici
Requisiti ideali per un metodo di rilevazione di spot proteici da 2D
Alta sensibilità
Permettere analisi quantitative
Compatibile con MS
Rapido
Economico
Non tossico
... in pratica non esiste il metodo ideale ....
COLORAZIONE DEI GEL
Visibili ad occhio nudo
SILVER
COOMASSIE
Visibili con strumentazione
RUBY
DIGE
silver
E’ il metodo più sensibile per la colorazione dei gel
Silver acido
Sensibilità 1-2 ng
Silver alcalino
Si basa sul legame che l’Ag instaura con le proteine
specialmente sui gruppi amminici liberi e sulfurici
Ag+
SH
Ag
COO-
SH
HCOH
Metodica lunga
Colorazione non lineare se non entro certi limiti
Colorazione non sempre compatibile con la massa
COO-
Coomassie blue
E’ un metodo veloce
Pratico
Economico
Facilmente decolorabile
Compatibile con la massa
Si basa sul legame che la molecola del colorante instaura con le
proteine ed esattamente con i residui di arginina e lisina
La colorazione richiede un mezzo acido per la generazione di un’attrazione
elettrostatica tra le molecole del colorante e i gruppi amminici delle proteine.Questa
attrazione ionica, insieme con le forze di Van Der Waals mi lega il complesso
colorante proteina insieme.
Sensibilità bassa 50-100ng
ruby
E’ un metodo veloce
Pratico
Compatibile con la massa
Facilmente decolorabile
Altamente lineare fino al 3 ordine di magnitudo
Sensibilità 1-10ng
Si basa sul legame che il Rubidio, un metallo chelante, instaura, in
presenza di solventi organici, con i residui amminoacidici basici
E’ un fluoroforo che ha due massimi di eccitazione a 280 e
450nm mentre ha un massimo di emissione a 610nm
Poco economico
Si deve avere una strumentazione adatta per la ripresa delle immagini
silver
coomassie
ruby
Strumentazione per la cattura delle immagini
VERSADOC
Tools del Versadoc tramite software
SVANTAGGI
• metodica lunga
• bassa capacità di risoluzione delle proteine idrofobiche
• difficile separazione delle proteine molto acide o
basiche, con valore del Punto isoelettrico estremo
• scarsa risoluzione di proteine con MW > 150 kDa o
<10kDa
• bassa risoluzione delle proteine a bassa
concentrazione al di sotto del 4°ordine di grandezza
• mancanza di linearità o sensibilità tra abbondanza
della proteina nel campione proteico e capacità di
risoluzione tramite colorazione sul gel
Identificazione
Comparazione
Il confronto e l’analisi dei 2D Gels vengono effettuati mediante
l’uso di opportuni Hardware e Software
Bioinformatica
