GLI ENZIMI
Gli enzimi sono (quasi sempre) molecole proteiche che catalizzano
tutte le reazioni chimiche che avvengono negli organismi viventi.
- Sono catalizzatori biologici
non vengono alterati dalla reazione che catalizzano
ACCELERANO reazioni chimiche fino a 1017 volte!!!
(efficienza catalitica)
accelerazione da catalizzatori non enzimatici: 100-10000
Rendono più moderate le condizioni di reazione altrimenti
drastiche per pH, temperatura, pressione…
GLI ENZIMI
.
Possono legare altre molecole (cofattori)
Agiscono abbassando l’energia libera di attivazione
Svolgono il loro ruolo con modalità differenti, ma in tutti i casi la
catalisi procede attraverso la formazione di complessi tra l'enzima
e i reagenti
specificità di substrato
substrati = reagenti su cui gli enzimi agiscono
specificità di reazione (assenza di prodotti secondari)
Possono essere regolati in funzione delle specifiche esigenze
Che cosa gli enzimi NON fanno:
-NON cambiano l’equilibrio di una reazione
- NON rendono possibile una reazione
termodinamicamente impossibile
-Gli enzimi possono avere dimensioni
variabili
-Solo una piccola parte della molecola è
coinvolta nella catalisi (sito catalitico o
sito attivo), ma tutta la molecola è
importante per la funzione
-Alterazioni a siti distanti dal sito
catalitico (anche in un solo aa!!!) possono
ridurre o annullare l’attività dell’enzima
Per svolgere la sua funzione l’enzima DEVE legare il substrato
Formazione di un complesso enzima-substrato (ES)
Nomenclatura degli enzimi
* Nome del substrato su cui agiscono (o del tipo di reazione che
catalizzano) + suffisso –asi
Es: - ureasi
- Alcool deidrogenasi
- glucosio 6-fosfato isomerasi
- DNA ligasi
- esochinasi
* Altri come la tripsina e la chimotripsina sono conosciuti dai loro
nomi “storici”.
REGOLE PER LA CLASSIFICAZIONE DEGLI ENZIMI
La
“International
Union
of
Biochemistry
and
Molecular Biology” (IUBMB) stabilisce che gli enzimi
vengono classificati in base al tipo di reazione
chimica che catalizzano
NOMENCLATURA DEGLI ENZIMI
Classificazione
1. Ossidoreduttasi
2. Trasferasi
3. Idrolasi
4. Liasi
5. Isomerasi
6. Ligasi
Tipo di reazione catalizzata
Reazioni di ossidoriduzione
(deidrogenasi, ossidasi, perossidasi,
reduttasi)
trasferimento di gruppi funzionali
idrolisi
lisi del substrato con formazione di doppi
legami (reazioni di eliminazione)
(nella reazione inversa -reazione di
addizione - agiscono da sintasi)
isomerizzazione
formazione di legami accoppiata all’idrolisi
di ATP (anche denominate “sintetasi”)
Gli enzimi sono classificati in accordo al tipo di reazione. Ci sono sei classi
principali (con sottoclassi che definiscono il substrato o il legame coinvolto)
CLASSI DI ENZIMI
ENZYME CLASSES AND SUBCLASSES
No. Classes
1
Oxidoreductases
dehydrogenases
reductases
hydroxylases
2
Transferases
transaldolases
kinases
3
Hydrolases
esterases
phosphatases
amidases
4
Lyases
decarboxylases
dehydratases
5
Isomerases
racemases
6
Ligases
synthetases
(type of reaction catalyzed)
(oxidation-reduction reactions)
oxidases
peroxidases
oxygenases
catalases
(transfer of functional groups)
transketolases
acyl, methyl, phosphoryl transferases
(hydrolysis reactions)
glycosidases
phospholipases
ribonucleases
peptidases
thiolases
(formation of double bonds)
aldolases
synthases
hydratases
lyases
(isomerization reactions)
epimerases
(formation of covalent bonds)
carboxylases
isomerases
UN ESEMPIO DI NOMENCLATURA
A ciascun enzima vengono assegnati due nomi e un numero di classificazione:
-Nome corrente (es. esochinasi)
-Nome sistematico (es: ATP glucosio fosfotransferasi)
-Numero di classificazione (es: EC 2.7.1.1)
Enzyme Commission
classe
numero di serie
sottoclasse
sotto-sottoclasse
Numero di classificazione [ E C 2.7.1.1.]
•
classe (reazione catalizzata): trasferasi
2
•
sottoclasse (substrato o legame coinvolto): fosfotrasferasi
trasferimento di un gruppo fosfato
sotto-sottoclasse: un gruppo ossidrilico come accettore
numero di serie nell’ambito della sotto-sottoclasse
7
•
•
1
1
Cofattori e coenzimi
Alcuni enzimi esplicano la loro funzione catalitica utilizzando
esclusivamente la reattività chimica dei loro residui aminoacidici.
Molti enzimi richiedono invece la partecipazione di cofattori o
coenzimi che non sono parte della struttura proteica.
Cofattore una piccola molecola organica o inorganica (ioni
metallici Fe2+, Cu2+, Mg2+, Zn2+) che contribuisce al
mantenimento della struttura terziaria dell’enzima ed è dunque
necessaria per l’attività enzimatica.
Gli ioni metallici:
se debolmente legati (K, Mg, o Ca) partecipano al legame del
substrato (enzimi attivati da metallo).
se strettamente legati (Fe, Zn, e Co) partecipano
direttamente alla reazione (metalloenzimi).
Se il cofattore viene rimosso, l’enzima assume il nome di
apoenzima ed è privo di attività.
COFATTORI ORGANICI (COENZIMI)
I coenzimi sono molecole organiche.
Agiscono come reagenti per il trasferimento di
gruppi accettando o donando gruppi funzionali.
Derivano spesso da precursori della dieta (vitamine)
o da metaboliti.
I coenzimi sono chimicamente modificati in seguito
alla reazione enzimatica ovvero funzionano come
cosubstrati.
Oloenzima
(attivo)
Enzima
Enzima
cofattore
cofattore
Apoenzima
(inattivo)
Il coenzima legato saldamente all’enzima attraverso un
legame covalente o un legame di coordinazione viene
detto gruppo prostetico
VITAMINE E COENZIMI
MOLTI COENZIMI SONO DERIVATI DALLE
VITAMINE
Coenzyme
Reaction catalyzed
Vitamin source
Thiamine pyrophosphate
Aldehyde transfersdecarboxilation
Thiamine (Vitamin B1)
Flavin adenine dinucleotide
Oxidation-reduction
reactions (electron transfers)
Riboflavin (Vitamin B2)
Nicotinamide adenine
dinucleotide
Oxidation-reduction
reactions (hydride transfers)
Nicotinamide (niacin)
Coenzyme A
Acyl transfers
Pantothenic acid
Pyridoxal phosphate
Amino group transfers
Pyridoxine (Vitamin B6)
Coenzyme B12
Alkylation reactions
Cobalamin (Vitamin B12)
Biocytin
Carboxylation reactions
Biotin
Tetrahydrofolic acid
One-carbon transfers
Folic acid
Lipoic acid
Acyl transfers
Alcuni importanti coenzimi
Coenzimi NAD+ e NADP+
Nicotinamide adenin dinucleotide (NAD+) e
Nicotinamide adenin dinucleotide fosfato (NADP+)
– Derivano dalla vitamina Niacina
– Svolgono un ruolo nelle reazioni di ossidoriduzione
che implicano trasferimenti di due elettroni.
NAD+
Malato
NADH + H+
Malato Deidrogenasi
NAD+
NADH + H+
Ossalacetato
Coenzimi FMN e FAD
• Flavin mononucleotide (FMN) e flavin adenine
dinucleotide (FAD)
– Derivano dalla vitamina Riboflavina (B2)
– Ruolo nelle reazioni di ossidoriduzione che
implicano il trasferimento di uno o due elettroni
FAD
Succinato
FADH2
Succinato Deidrogenasi
FAD
FADH2
Fumarato
ISOENZIMI
• Gli isoenzimi sono forme distinte di un enzima che
hanno la stessa attività catalitica e sono presenti
in differenti tipi cellulari o compartimenti
subcellulari.
• Differiscono in:
• Parametri cinetici;
• Specificità;
• pH ottimale;
• Caratteristiche di carica (pI);
• Sensibilità all’inibizione;
• Sensibilità al calore (termostabilità).
• Sono distinguibili elettroforeticamente a causa di
una o più sostituzioni amminoacidiche in porzioni
non critiche della proteina.
Separazione elettroforetica di
isoenzimi della lattico deidrogenasi
estratti da tessuti diversi
+
LDH 1
LDH 2
LDH 3
LDH 4
LDH 5
Cuore
Rene
Fegato
Muscolo Siero
Origine
•Per la classificazione degli isoenzimi si inizia dalle specie che
hanno la maggiore mobilità elettroforetica verso l’anodo.
Isoenzimi
lattico deidrogenasi LDH
NADH + piruvato
lattato + NAD
LDH-1 (H4) miocardio, eritrociti, rene...
LDH-2 (H3M) miocardio, eritrociti, rene, pancreas, polmoni..
LDH-3 (H2M2) polmoni, placenta, pancreas, muscolo scheletrico
LDH-4 (HM3) muscolo scheletrico, polmone
LDH-5 (M4) fegato, muscolo scheletrico...
•
•
•
•
Differenze tra H M
1aa
differenti KM e Vmax
stabilità termica
µ elettroforetica
Complessi multienzimatici
I complessi multienzimatici sono gruppi di enzimi associati
mediante legami non covalenti, che catalizzano due o più passaggi
successivi lungo una via metabolica.
Essi rappresentano un miglioramento dell’efficienza catalitica da
un punto di vista evolutivo.
• Migliore catalisi. Riduzione dei tempi di diffusione di un
intermedio da un enzima all’altro.
• “Channelling” del substrato.
Permette di trasferire un
intemedio di una via biosintetica direttamente ad un’altra
subunità evitando competizione.
•Sequestro di intermedi reattivi. Protezione di specie che
sarebbero chimicamente instabili in soluzioni acquose.
• Servicing. Una subunità può trasferire un reagente a differenti
altre subunità.
•Regolazione ed espressione coordinate.
COMPLESSO DELLA PIRUVATO DEIDROGENASI
E1 piruvato deidrogenasi (24) E2 diidrolipoiltransacetilasi (24) E3
diidrolipoildeidrogenasi (12)
In E.coli PM 4600 KDa;negli eucarioti (mitocondri) 10000 KDa
Come funzionano gli enzimi??
Il meccanismo d’azione degli enzimi può essere
trattato da tre punti di vista:
-analizzando i cambiamenti energetici che si
verificano nel corso della reazione
- esaminando il modo in cui il sito attivo
favorisce la catalisi dal punto di vista chimico
-Studiando la cinetica della reazione catalizzata
Cambiamenti energetici che si verificano
durante una reazione
∆G = ∆H – T∆S
∆G = variazione dell’energia libera. ∆H = variazione dell’entalpia
∆S = variazione dell’entropia. T= temperatura assoluta.
∆G < 0 (reazione spontanea)
∆G > 0 (reazione non spontanea)
∆G = 0 (reazione in equilibrio)
Per avere ∆G < 0:
1) ∆H < 0; ∆S > 0 I due fattori vanno nella stessa direzione.
2) ∆H < 0 ; ∆S < 0 Il fattore entalpico deve prevalere sul quello entropico.
3) ∆H > 0 ; ∆S > 0 Il fattore entropico deve prevalere sul quello entalpico.
CENNI DI TERMODINAMICA CHIMICA
A + B
C + D
Quando la reazione è all’equilibrio
∆G = 0
Ke = [C]c [D]d
[A]a [B]b
Quando un sistema non è all’equilibrio, la forza trainante che lo spinge
all’equilibrio è la variazione di energia libera standard, ∆G’°.
∆G’° = - RT ln [C] [D]
[A] [B]
..correlata alla costante di equilibrio dalla relazione:
∆G’° = − RT ln Ke
Il ∆G’° ’di una reazione è un modo matematico alternativo di
esprimere la costante di equilibrio, ma non dà informazioni sulla
velocità di una reazione
∆G’o = variazione di energia libera in condizioni
standard
•
•
•
•
Concentrazione: 1 M di reagenti e prodotti
Pressione: 1 Atm
Temperatura : 298 °K (25 °C)
pH 7
Per capire cosa determina la velocità di
una reazione bisogna capire cosa accade
durante la transizione da reagenti a
prodotti
Teoria dello stato di transizione: Reazione non catalizzata
La teoria dello stato di transizione non prende in considerazione i
meccanismi di reazione, ma permette di correlare la velocità di una
reazione con la differenza di energia libera di attivazione tra lo stato
fondamentale e lo stato di transizione.
Lo stato di transizione corrisponde ad una specie chimica instabile con legami non
completamente formati e si situa, nel diagramma di reazione, nel picco a più alta
energia libera.
L’energia di attivazione, ∆G°±, rappresenta l’energia libera supplementare che le
molecole devono possedere per raggiungere lo stato di transizione.
La velocità della reazione dipende dal superamento della barriera
energetica per il raggiungimento dello stato di transizione
…in una reazione non catalizzata solo un piccolo numero di molecole
possiede energia sufficiente per raggiungere lo stato di transizione
Diagramma dell’energia libera per una reazione semplice A
B.
Studio all’equilibrio
Differenza in energia libera tra lo stato iniziale e
quello finale GA e GB rappresentano le energie
libere medie per mole delle molecole di A e B. ∆G°
rappresenta la variazione di energia libera
standard della reazione
Diagramma dell’energia libera esteso a
comprendere lo stato di transizione (±) attraverso
cui le molecole devono passare per andare da A a B
e viceversa. ∆G°1 ± indica l’energia di attivazione per
±
la transizione A B; ∆G°
-1 indica l’energia di
attivazione per la transizione B A ∆G° è proprio
la differenza tra le variazioni di energia libera dei
due stati di attivazione.
Una probabile via di transizione di un piranosio
(come il glucosio) dalla forma a barca a quella a
sedia. Lo stato energetico più elevato (stato di
transizione) assomiglierà alla struttura a
semisedia
Teoria dello stato di transizione
Reazione catalizzata
Reazione catalizzata
Gli enzimi provocano una diminuzione dell’energia libera di attivazione (∆G#)
dello stato di transizione consentendo che una frazione più ampia di molecole
reagenti disponga di sufficiente energia per raggiungere questo più basso stato
di transizione.
Il catalizzatore abbassa l’energia libera dello stato di transizione (ovvero
stabilizza lo stato di transizione della reazione catalizzata) in modo che si
raggiunga l’equilibrio più rapidamente senza alterare l’equilibrio della reazione.
L’effettiva velocità con cui i reagenti sono convertiti in
prodotti dipende dalla cinetica
Interazione
E-S
Stato di
transizione
formazione
del prodotto
rilascio
del prodotto
E + S <====> E S ====> E + P
Legame di uno o più substrati
Abbassamento dell’energia dello stato di transizione
Promozione dell’evento catalitico
Come fanno gli enzimi ad abbassare l’energia di
attivazione?..…meccanismo???...
EFFETTI DI LEGAME
energia di legame
stabilizzazione dello stato di transizione
prossimità e tensione
EFFETTI CHIMICI
catalisi acido-base
catalisi covalente
Due modelli per spiegare l’interazione enzima-substrato
MODELLO CHIAVE-SERRATURA. In questo modello il sito attivo dell’enzima si adatta
al substrato come una chiave in una serratura (Fisher, 1894).
MODELLO DELL’ADATTAMENTO INDOTTO. In questa elaborazione del modello
precedente sia l’enzima sia il substrato vengono distorti quando si legano tra loro. Il
substrato viene forzato ad assumere una conformazione vicina allo stato di transizione;
l’enzima mantiene il substrato in tensione (Koshland, 1958)
Il cambio conformazionale indotto nell’esochinasi
L’enzima induce la molecola del substrato ad adottare una conformazione simile allo
stato di transizione
EFFETTI DI LEGAME: Energia di legame
Energia di legame = energia che si libera dall’interazione enzima-substrato
Il numero di interazioni deboli è massimo allo stato di transizione
- Massima energia liberataLe interazioni deboli sono ottimali allo stato di transizione
Abbassamento dell’energia di attivazione
Stabilizzazione dello stato di transizione
Specificità di substrato
Importanza dello stato di transizione
In alcuni casi un catalizzatore lega il substrato in una conformazione che è un
intermedio obbligato della reazione, ma che possiede una energia minore grazie al
favorevole stato energetico dovuto al legame con il catalizzatore. Il risultato è che due
barriere più basse sostituiscono una singola barriera di valore elevato.
Lo stato intermedio (di transizione) è uno stato semistabile della molecola
Postulato di Hammond: se c’e un intermedio instabile, lo stato di transizione gli
rassomiglierà e quanto più lo stato di transizione assomiglia al prodotto, tanto più veloce
è la reazione.
EFFETTI DI LEGAME: Energia di legame; prossimità e orientamento
Fattori entropici ed entalpici nella catalisi
Un enzima lega due reagenti
assicurando un corretto
orientamento reciproco,
o una distanza opportuna e
unendoli più saldamente
nello stato di transizione
Gruppi funzionali vicini e nel corretto orientamento
Come leggere un meccanismo di reazione…
Punti = elettroni non condivisi
Frecce ricurve = movimento della coppia
di elettroni (direzione: nucleofilo
elettrofilo)
Se la freccia va da un atomo a un altro
atomo: si forma un nuovo legame tra i due
atomi
Se la freccia va da un legame a un atomo:
rottura del legame; gli elettroni
compaiono come doppietto non condiviso
(o carica negativa) sull’atomo indicato
dalla freccia
Se la freccia va da un legame singolo a un
altro legame singolo: si forma un doppio
legame
..
C
C
C
C
C
C
GRUPPI NUCLEOFILI ED ELETTROFILI DI RILEVANZA BIOLOGICA
EFFETTI CHIMICI
Catalisi acido-base
il pKa della catena laterale degli aa può variare in una proteina
Catalisi acido-base
EFFETTI CHIMICI
Catalisi covalente
(Ser, Cys, Glu, Asp, Tyr, His)
H2O
R1-COOH
EFFETTI CHIMICI
Catalisi covalente
Triade catalitica: Asp – His - Ser
His57: posiziona correttamente il gruppo OH della Ser e ne aumenta
la nucleofilicità
Asp102: posiziona correttamente His57 e ne aumenta la capacità di
accettare protoni
Triade catalitica: Asp – His – Ser presente anche in altre
proteasi
Es: tripsina (specificità: Lys, Arg)
elastasi (specificità: amminoacidi con catene laterali piccole (es: Ala, Ser
chimotripsina (specificità amminoacidi aromatici, idrofobici voluminosi)
Che cosa conferisce specificità?...........
ENZIMI CHE RICHIEDONO COFATTORI
Catalisi da ioni metallici
- orientamento del substrato nel sito attivo
- stabilizzazione dello stato di transizione
- ossidoriduzione
Enzimi che richiedono cofattori
MECCANISMI GENERALI DI CATALISI IMPIEGATI
DAGLI ENZIMI: riepilogo
Effetti di legame:
1. Effetti di vicinanza e orientamento
2. Legame preferenziale dell’enzima allo stato di transizione rispetto a
reagenti e prodotti
Effetti chimici:
3. Catalisi acido-base
(trasferimento di protoni da un acido o accettazione di protoni da una base)
4. Catalisi covalente
(formazione transiente di un legame covalente tra l’enzima e il substrato)
5. Catalisi da metalli
(favoriscono il corretto orientamento dei substrati, mediano reazioni redox e
stabilizzano/schermano cariche opposte)
