La dopamina perdita neuronale contribuisce alla memoria e

3/4/2017 La dopamina perdita neuronale contribuisce alla memoria e premiare la disfunzione in un modello della malattia di Alzheimer: Nature Communications
Articolo | APERTO
La dopamina perdita neuronale contribuisce alla memoria
e premiare la disfunzione in un modello della malattia di
Alzheimer
Annalisa Nobili, Emanuele Claudio Latagliata, Maria Teresa Viscomi, Virve Cavallucci, Debora Cutuli, Giacomo Giacovazzo, Paraskevi
Krashia, Francesca Romana Rizzo, Ramona Marino, Mauro Federici, Paola De Bartolo, Daniela Aversa, Maria Concetta Dell'Acqua, Alberto
Cordella, Marco Sancandi, Flavio Keller, Laura Petrosini, Stefano Puglisi-Allegra, Nicola Biagio Mercuri, Roberto Coccurello, Nicola
Berretta E Marcello D'Amelio
Nature Communications 8 , Articolo numero: 14727 (2017)
ricevuto: 28 giugno 2016
doi : 10.1038 / ncomms14727
Accettato: 26 gennaio 2017
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Pubblicato online: 3 apr 2017
Il morbo di Alzheimer L'apprendimento e la memoria
Astratto
Alterazioni del sistema dopaminergico (DAergica) sono frequentemente riportati in pazienti con
malattia di Alzheimer (AD) e sono comunemente legati a sintomi cognitivi e non cognitivi. Tuttavia,
la causa della disfunzione del sistema DAergica in AD ancora da chiarire. Abbiamo studiato
alterazioni del sistema DAergica mesencefalo nel modello murino Tg2576 di AD, sovraespressione
di un mutato amiloide umana proteina precursore (APPswe). Qui, abbiamo trovato una perdita
DAergica neurone età-dipendente nella zona ventrale tegmentale (VTA) nelle fasi di pre-placca,
anche se pars compacta della sostanza nera neuroni (SNPC) DAergica erano intatti. Le selettivi
VTA DAergica risultati neurone degenerazione inferiore DA deflusso nello shell ippocampo e
nucleus accumbens (NAC). La progressione della morte cellulare DAergica correla con i danni in
CA1 plasticità sinaptica, le prestazioni della memoria e la ricompensa di prodotti alimentari.
Concludiamo che in questo modello di topo di AD, la degenerazione dei neuroni VTA DAergica
nelle fasi di pre-placca contribuisce al deficit di memoria e disfunzioni del trattamento
ricompensa.
introduzione
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La malattia di Alzheimer (AD) è una malattia neurologica caratterizzata da sintomi cognitivi e non
cognitivi che sono associati con atrofia cerebrale 1 , 2 . L'istopatologia principale accompagna AD
comporta l'accumulo di grovigli neurofibrillari e placche neuritiche, con conseguente perdita
neuronale progressiva e massiccia che colpisce principalmente l'ippocampo e la corteccia 3 , 4 , 5 .
L'ippocampo è una struttura fondamentale del cervello per la formazione della memoria 6 e danni
in quest'area è ritenuta essere la causa principale della perdita di memoria nei pazienti con AD. La
formazione dell'ippocampo riceve entrambi gli ingressi corticali e sub-corticali, quest'ultimo
arrivano principalmente dalla zona ventrale tegmentale (VTA), locus coeruleus (LC), nucleo setto
mediale, complesso rafe e nucleo basale di Meynert, tutte modulare l'attività dell'ippocampo 7 , 8 , 9 ,
10 , 11
. Pionieristiche osservazioni neuropatologiche in post-mortem AD cervello 12 , 13 hanno
dimostrato che la formazione dell'ippocampo ed estrinseca (sia corticale e sub-corticale)
collegamenti sono interrotti a più livelli, suggerendo che le alterazioni strutturali progressive nelle
diverse aree cerebrali possono contribuire al peggioramento della memoria e delle funzioni
cognitive nei pazienti con AD.
Coerentemente con queste osservazioni, diverse alterazioni del sistema dopaminergico (DAergica)
sono stati riportati in pazienti con AD, compresi riduzione dei livelli di dopamina (DA) e suoi
recettori 14 , 15 , 16 . Una delle fonti di DA nell'ippocampo deriva dai neuroni DAergica nel VTA 17 . DA
è un modulatore ben riconosciuta di hippocampal plasticità sinaptica e il suo legame ai recettori
DAergica nell'ippocampo dorsale è un importante determinante della codifica memoria 18 , 19 , 20 .
Neuroni VTA DAergica anche bersaglio nucleus accumbens (NAC) e corteccia cerebrale, mediando
il controllo di motivazione incentivo e premio elaborazione 17 .
Grazie a queste funzioni di DA nell'ippocampo e il sistema mesolimbico, abbiamo cercato di
stabilire la trasmissione come DAergica nell'ippocampo e NAC è influenzato in Tg2576 topi
transgenici che sovraesprimono la proteina APP695 umana con la mutazione 'svedese' (APPswe),
che mostrano comportamentale e le anomalie istopatologiche che strettamente imitare presto AD
21
Testo originale
. Abbiamo ipotizzato che i danni dei neuroni DAergica potrebbe contribuire al deterioramento
The hippocampal formation receives both cortical and sub­cortical
22 , 23 from , 24 , 25
inputs, the latter arriving ilmainly the e,ventral tegmental areaai
della memoria e sintomi non cognitivi osservati
in questi
animali
plausibilmente,
(VTA), locus coeruleus (LC), medial septal nucleus, raphe complex
and the nucleus una
basalis of Meynert, all modulating hippocampal
primi sintomi di pazienti affetti da AD 26 . Abbiamo
trovato
significativa
perdita
di tirosina
activity 7 , 8 , 9 , 10 , 11 .
idrossilasi-positivi (TH + neuroni) DAergica nella VTA di topi Tg2576, con inizio alle 3 mesi di età.
Contribuisci a una traduzione migliore
Degenerazione è selettivo per il VTA come neuroni DAergica nell'adiacente pars compacta della
substantia nigra (SNPC) erano intatte. Inoltre, deflusso basale DA nell'ippocampo e NAC guscio è
ridotta, probabilmente contribuendo al deficit dei sintomi cognitivi e non cognitivi mesolimbico. In
particolare, la stimolazione del sistema DAergica dalla somministrazione del precursore DA
levodopa ( L -dopa) o con selegilina, un inibitore della monoamino ossidasi-B, salva completamente
CA1 plasticità sinaptica e densità delle spine dendritiche, e ripristina hippocampal densità postsinaptica (PSD) composizione, deficit della memoria e perdite di valore nella trasformazione
ricompensa in cibo. I nostri risultati suggeriscono un ruolo nuovo per il VTA nella fisiopatologia
dei sintomi AD-come nelle fasi di pre-placca.
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risultati
DAergica degenerazione dei neuroni nella VTA nelle fasi di pre-placca
Abbiamo usato TH immunocolorazione per identificare i neuroni DAergica in Tg2576 e wild-type
(WT) topi di pari età in età diverse postnatali, ed eseguito il conteggio delle cellule stereologici
nella VTA e SNPC del mesencefalo ( Fig. 1a ). Abbiamo osservato una significativa perdita di neuroni
nei topi DAergica Tg2576, con inizio alle 3 mesi di età ( Fig. 1b ). Questa riduzione TH + numero di
cellule è stata limitata a VTA, come è stata osservata alcuna differenza tra i topi Tg2576 e WT nel
SNPC a qualsiasi età testata ( Fig. 1b ). In contrasto con TH + cellule, il numero di TH - cellule
rimasto costante ( Fig 1b. ), Indicando che la diminuzione di TH + cellule nel VTA di topi Tg2576
riflette una vera perdita di neuroni DAergica e non una semplice perdita di TH immunoreattività o
down-regolazione dell'espressione TH. In accordo con la perdita selettiva dei neuroni VTA
DAergica, abbiamo rilevato aspetto più rattrappito e apoptosi delle cellule TUNEL-positivi nella
VTA di 3 mesi di età topi Tg2576, l'età in cui il TH + numero di cellulare comincia a diminuire ( Fig. 2
bis ). Per esaminare se l'apoptosi neuronale è associata ad un aumento astrociti reattivi, abbiamo
analizzato l'immunoreattività di proteina acida fibrillare gliale (GFAP), un indicatore di cella
astrociti. Coerentemente con maggiore degenerazione neuronale 27 , abbiamo trovato un aumento
significativo del numero di GFAP + cellule nel VTA di 3 mesi di età topi Tg2576, dimostrando un
aumento negli astrociti reattivi in risposta a DAergica perdita neuronale. Invece, GFAP
immunoreattività è rimasto invariato nel SNPC di 3 mesi di età topi Tg2576, in linea con
l'osservazione che i neuroni della sostanza nera DAergica sono intatte ( Fig. 2b ).
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Figura 1: topi Tg2576 mostrano perdita selettiva dei neuroni VTA DAergica a partire da 3
mesi di età.
( Un ) sezione di cervello coronale da un 6 mesi del mouse WT che mostra intensa immunoreattività TH (marrone) nella VTA e
SNPC. Le sezioni sono state Nissl-contrastate (azzurro). La linea tratteggiata indica i limiti anatomici separano VTA dal SNPC
(barra della scala, 500 um). A destra sono immagini maggiore ingrandimento (barra della scala, 10 um) mostrano TH + e neuroni
Nissl-controcolorate nella VTA e SNPC di WT e Tg2576 topi (Tg) ( n = 7 topi per genotipo; 9 sezioni per animale). ( B ) I grafici a
barre mostrano quantificazione stereologica di TH + e TH - numero di cellule nel VTA e SNPC in topi WT e Tg2576 alle età indicate
( n = 7 topi per genotipo per età; 9 sezioni per animale). DAergica perdita neuronale nei topi Tg2576 è selettivo per il VTA con
l'inizio a 3 mesi di età (a due code spaiato t -test: 3 e 4 mesi, * P = 0,003; 6 mesi, ** P = 0,002). I dati rappresentano media ± sem
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Figura 2: VTA DAergica morte neuronale nei topi Tg2576 in fase di pre-placca è associata con
apoptosi e glia infiammazione.
( A ) cervello coronale emi-sezione delineando VTA e area SNPC (linee tratteggiate; barra della scala, 250 um) e microfotografie
rappresentative di neuroni TUNEL-positivi da 3 mesi di età topi WT e Tg2576 (bar scala, 10 pm). L'intensa colorazione marrone
scuro indica apoptosi delle cellule (punta di freccia). Le sezioni sono state Nissl-contrastate (azzurro). I grafici a barre
rappresentano il numero medio di neuroni apoptotici TUNEL-positivi per girone nelle aree analizzate ( n = 7 topi per genotipo, 9
sezioni per animale; due code per dati non appaiati t -test *** P <1,00 × 10 -4 ) . ( B ) Analisi dei confocale Z-stack doppio
etichettatura dei TH- e GFAP- immunostaining in sezioni del cervello che contengono il VTA e SNPC dai 3 mesi i topi (barra della
scala, 50 micron). Riquadri mostrano cellule GFAP-positive individuali a maggiore ingrandimento (bar scala, 20 um). I diagrammi
a barre rappresentano il numero medio di cellule GFAP-positive per girone nelle zone indicate ( n = 7 topi per genotipo, 9 sezioni
per animale; due code per dati non appaiati t -test ** P = 0,002). ( C ) Fare doppio di etichettatura per TH e Iba1 nelle sezioni del
cervello che contengono il VTA e SNPC dai 3 mesi i topi (barra della scala, 50 micron). I riquadri mostrano esempi di microglia
riposo in topi WT e nel SNPC di topi Tg2576, caratterizzati da cilindriche cellulari e processi lunghi, e una cella leggermente
attivato nella VTA di Tg2576 topi con più intensa fluorescenza, corpo cellulare allargata e processi retratti ( barra della scala, 20
pm). Si noti anche l'aumento della proliferazione delle cellule Iba1-positivi nel Tg2576 VTA. I diagrammi a barre rappresentano il
numero medio di Iba1-positivi riposo e cellule leggermente attivate indicato come percentuale del numero totale di cellule Iba1positivi per sezione ( n = 4 topi per genotipo, 9 sezioni per animale, per il rapporto di riposo / blandamente cellule attivate: due
code per dati non appaiati t -test ** P = 0,003). I dati sono media ± sem
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Abbiamo anche esaminato la risposta delle cellule microgliali utilizzando un calcio ionizzato
vincolante adattatore molecule 1 (Iba1) anticorpo -specific 28 . Esistono cellule microgliali nel
cervello sano in uno stato quiescente (cellule quiescenti) con un corpo cellulare relativamente
rotondo e lunghe, processi sottili, mentre nello stato iniziale di attivazione (moderatamente attivo)
dopo danno cerebrale, proliferano rapidamente, corpi cellulari ingrandire e processi ritraggono o
diventano più spesse 29 , 30 . In accordo con perdita di cellule DAergica nella VTA, in 3 mesi di età
animali Tg2576 abbiamo osservato un cambiamento nella morfologia della microglia e un
significativo aumento nel rapporto di leggermente attivati su cellule quiescenti, mentre microglia
nell'area SNPC rimasto invariato ( fig. 2c ). Così, la degenerazione selettiva nella VTA di topi Tg2576
è associata con apoptosi, aumentato astrociti reattivi e attivazione della microglia.
Al fine di verificare se l'aumento di degenerazione neuronale nei risultati VTA da extracellulare
amiloide-β (Ap) deposizione -plaque, abbiamo esaminato l'accumulo di depositi Ap nei neuroni
DAergica mesencefalo e nelle aree di proiezione come l'ippocampo, striato dorsale e NAC 31 , 32 , 33 .
Abbiamo scoperto che extracellulare deposizione Ap-placca era assente in 6 mesi di età i topi in
tutte le regioni di cui sopra. Tuttavia, abbiamo osservato più intensa colorazione citoplasmatica
per APPswe nell'ippocampo e coperture NAc di topi Tg2576 rispetto ad altre zone ( complementare
Fig. 1a ). Ciò è stato confermato anche mediante analisi western blot dei livelli di proteina APPswe
tutta lunghezza ( Fig complementare. 1b ). È importante sottolineare che i neuroni DAergica
mostrato diffusa colorazione intracellulare, e questo era simile in VTA e SNPC, suggerendo
l'assenza di accumulo intracellulare Ap nei neuroni VTA che potrebbe spiegare la degenerazione
cellulare selettiva ( complementare Fig. 1a ). Extracellulare deposizione Ap-placca è stato rilevato
nell'ippocampo dell'invecchiamento (11 mesi) topi Tg2576, ma non nella VTA ( complementare Fig.
1c ). Questi dati indicano che la morte cellulare per apoptosi osservato nei neuroni VTA DAergica
già dopo 3 mesi si verifica nelle fasi di pre-placca dell'ippocampo in questo modello animale e non
sembra derivare da deposizione Ap-placca locale nella VTA.
Ridotta DA nella shell NAC e deficit di ricompensa alimentare
Neuroni mesencefalo DAergica proiettano al corpo striato e NAC topografico lungo l'asse mediolaterale: subregione shell del NAc è innervato dai neuroni VTA medialmente situati mediano
motivazione, cognizione premio legati e molteplici forme di memoria; il nucleo NAc è innervato dal
VTA laterale e mediale neuroni SNPC influenzano risposte motorie sono collegati premiare stimoli,
mentre striato dorsale è innervato quasi esclusivamente dai neuroni SNPC lateralmente situati
controllano il movimento volontario 32 , 34 , 35 . Per determinare se la perdita selettiva di neuroni
DAergica colpisce il rilascio di DA nel proiettare aree che sono associati con la VTA, ma non con la
SNPC, abbiamo prima misurato DA deflusso nella shell NAC e core e nello striato dorsale,
utilizzando registrazioni amperometrici di rilascio di DA in fettine cerebrali acute ( Fig. 3a ). In 6
mesi di età topi Tg2576, quando la perdita neuronale DAergica nella VTA raggiunge un plateau (
Fig. 1a ), il DA evocato era significativamente diminuito nel guscio NAc ( Fig. 3b ). Invece, nessuna
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differenza è stata osservata nel nucleo NAc o nello striato ( Fig. 3b ). Inoltre, in 2 mesi topi, quando
il numero di neuroni DAergica nel Tg2576 VTA è ancora invariata rispetto agli animali WT, il
rilascio di DA nella shell NAC è simile tra genotipi ( complementare Fig. 2a ). Questi dati
dimostrano che nei topi Tg2576 DA deflusso nella shell NAC è normale prima della comparsa di
morte cellulare DAergica e suggeriscono che la sua riduzione nella shell NAc a 6 mesi deriva dalla
VTA DAergica perdita neuronale. Coerente con i risultati amperometrici, colorazione per il
trasportatore DA (DAT), usato come marcatore specifico di terminali DAergica, è stato ridotto nel
guscio NAc, ma non nel nucleo NAc di 6 mesi di età topi Tg2576 ( Fig. 3c ) .
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Figura 3: Ridotta deflusso DA nella shell NAC e deficit nella lavorazione ricompensa
mesolimbic a 6 mesi di età topi Tg2576.
( Un ) Sintesi di stimolare (frecce nere) e la registrazione elettrodo (frecce bianche) tirocini durante le misure amperometriche di
evocata DA nel NAc (Shell, Core) e striato (Str; Bar scala, 500 micron). ( B ) concentrazione evocati DA nelle zone indicate ( n = 1625 fette di 6-8 topi WT, 18-43 fette da 6-10 topi Tg2576) e tracce esempio da 6 mesi di età WT e Tg2576 topi (verticale barre di
scala: coperture NAC e nucleo, 50 pA; striato, 100 pa; bar scala orizzontale, 250 ms) registrati con un elettrodo di carbonio della
parità di calibrazione (a due code per dati non appaiati t -test ** P = 0,004). In questa ed altre figure, Terreni box-and-whisker le
linee centrali denotano mediane, archi rappresentano quartili superiori ed inferiori e basette mostrano valori minimo e
massimo. I punti sono i singoli esperimenti. ( C ) Z-stack doppia etichettatura immunofluorescenza per NeuroTrace e DAT NAC
sezioni coronali mostrano il guscio NAc (asterisco) e il rullo (freccia; barra della scala, 200 um). Trame Bar mostrano valori
densitometrici dei livelli DAT a 6 mesi di età topi ( n = 3 per il genotipo, 4 sezioni per animale; a due code spaiato t -test *** P =
1.00 × 10 -7 ). ( D , e ) misurazioni di microdialisi DA deflusso nel guscio NAc ( d ) e dorsale striato ( e ) in 6 mesi topi ( d : n = 6 WT e
5 Tg2576; ANOVA: F 1,9 = 5.138, * P = 0.049; e : n = 4 e 5 WT Tg2576; ANOVA: F 1,7 = 13.067, ** P = 0.009). ( F ) di cioccolato indotta
posto privilegiato nei 6 mesi topi ( n = 5 topi per genotipo) che mostra il tempo medio trascorso in camere accoppiati e spaiati in
seduta post-condizionata, meno il tempo trascorso nelle stesse camere durante la pre- condizionata sessione di test CPP
(bidirezionale misure ripetute ANOVA: camera, F 1,8 = 280,76, P <1,00 × 10 -4 ; camera × genotipo, F 1,8 = 231,34, P <1,00 × 10 -4 ;
genotipo, F 1,8 = 0,84, p = 0,380; *** p <1,00 × 10 -4 con di Tukey hoc messaggio di prova). ( G ) Il consumo di cioccolato durante
sessioni di condizionamento CPP ( n = 5 topi per genotipo; due code per dati non appaiati t -test *** P <1,00 × 10 -4 ). I dati in c - g
rappresentano media ± sem
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Esperimenti di microdialisi eseguiti su animali di muoversi liberamente confermato il deflusso
ridotta DA nella shell NAc di 6 mesi di età topi Tg2576 ( Fig. 3d ). Sorprendentemente, in vivo
microdialisi rilevati livelli basali di DA ridotto significativamente anche nello striato ( Fig. 3e ).
Considerando che entrambi i neuroni SNPC DAergica ( Fig. 1b ) e striatale rilascio di DA dall'attività
fasica DAergica ( Fig. 3b ) erano intatte in topi Tg2576, è probabile che i ridotti livelli basali di DA
nello striato potrebbero riflettere alterazioni nel controllo di tonico DA rilascio 36 , 37 .
Data l'importanza del sistema mesolimbico di stimolo e motivazione elaborazione 33 , 38 , abbiamo
esaminato se il deflusso ridotta DA dal VTA al guscio NAc potrebbe essere associato con
mesolimbico elaborazione disfunzionale premio-associata nei topi Tg2576. A tal fine, abbiamo
misurato le risposte di 6 mesi di età i topi in un conditioned place preference (CPP) compito di
cioccolato suscitato ( Fig supplementare. 2b ). Durante la sessione di pre-condizionamento, i topi
sono stati lasciati per esplorare liberamente un apparecchio a due camere. Indipendentemente dal
genotipo, tutti gli animali trascorso uguali periodi di tempo in entrambe le camere, mostrando
alcuna preferenza tra vano ( complementare Fig. 2c ). Esposizione ad alimenti appetibile in topi WT
determinato un significativo aumento del tempo trascorso in camera di cioccolato accoppiato
durante la fase di test ( Fig. 3f ). Al contrario, luogo condizionata era assente nei topi Tg2576: questi
animali hanno speso la stessa quantità di tempo nella camera di cioccolato accoppiato durante la
sessione di pre-condizionamento e test e non è riuscito a sviluppare una preferenza per la camera
con il cibo gratificante ( Fig 3f. ) . Inoltre, i topi Tg2576 consumato meno cioccolato durante la fase
di condizionamento ( Fig. 3g ). La riduzione in atto preferenza durante appetibile cibo-seeking,
insieme con l'ingestione di cioccolato diminuita, sono coerenti con l'esaurimento di DA dal guscio
NAc in cui DA governa ricompensa e sforzi legati decisionale 33 , 38 e sostengono per i deficit
cognitivi ricompensa associata e per i sintomi depressivi-like a 6 mesi di età topi Tg2576. In 2 mesi
di età topi Tg2576, quando il deflusso di DA nella shell NAC è ancora normale, non c'è
compromissione posto preferenza o consumo di cibo ( complementare Fig. 2d, e ).
Ridotta DA nell'ippocampo e deficit di memoria
Le proiezioni DAergica dal VTA al ippocampo formano il braccio verso l'alto di un ciclo funzionale
che controlla la formazione della memoria romanzo 31 , con DA giocano un ruolo importante nella
modulazione hippocampal plasticità sinaptica e la funzione 18 , 19 , 20 , 39 . Alla luce della
degenerazione dei neuroni VTA DAergica nei topi Tg2576, abbiamo studiato una possibile
riduzione di DA deflusso nell'ippocampo e se questo potrebbe essere correlato con menomazioni
prestazioni della memoria in questi topi.
Perché DAergica innervazione dell'ippocampo è rada di quella del NAc, registrazioni
amperometrici di rilascio di DA in fettine di cervello ippocampo acuti non era fattibile. Tuttavia, gli
esperimenti su animali microdialisi liberi di muoversi indicato un ridotto deflusso DA
nell'ippocampo di 6 mesi di età topi Tg2576 rispetto ai controlli di pari età ( Fig. 4a ). D'altra parte,
deflusso noradrenalina nell'ippocampo non differiva tra genotipi ( Fig. 4b ), suggerendo che a
questa età la sporgenza noradrenergico dalla LC è conservato. Considerando che LC TH + neuroni
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possono anche co-rilascio DA insieme con noradrenalina 40 , 41 e che la maggior parte di TH +
proiezioni nell'ippocampo provengono da LC 41 , 42 , abbiamo eseguito un stereologica cella
Numero di TH + neuroni nel LC di 6 mesi di età topi Tg2576. LC stereologica cell-count confermato
che, a questa età, il numero di TH + neuroni in questa regione del cervello non differiva tra
genotipi ( Fig. 4c, d ). Questi dati suggeriscono che la ridotta deflusso DA nell'ippocampo di 6 mesi
topi Tg2576 è principalmente dovuto alla stabilita VTA DAergica degenerazione dei neuroni, anche
se ridotta assonale rilascio di DA dal LC TH + neuroni non si può escludere, soprattutto negli
animali più vecchi 43 , 44 . In linea con questi dati, abbiamo trovato che entrambi i livelli di proteina
TH ( Fig. 4e , Fig complementare. 6a ) e TH immunoreattività ( Fig. 4f ) nell'ippocampo sono ridotti
significativamente nei 6 mesi di età topi Tg2576. Invece, i livelli di proteina TH di Tg2576 erano
identici agli animali WT nello striato ( Fig. 4g , Fig complementare. 6b ), in conformità con i dati
amperometrici in questo settore e l'osservazione che i neuroni SNPC DAergica, proiettando
principalmente al corpo striato, sono ancora intatto a questa età.
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Figura 4: Six-month-old topi Tg2576 mostrano ridotti DA deflusso nell'ippocampo e deficit di
plasticità sinaptica e della memoria.
( A , b ) in vivo microdialisi per DA ( un ) e noradrenalina ( b ) nell'ippocampo di 6 mesi WT ( n = 6) e Tg2576 ( n = 5) topi ( un : F 1,9
= 5.138 , ** P = 0,009; ( b ): F 1,9 = 0,688, P = 0.428, ANOVA). ( C ) TH immunoreattività (marrone) nel LC (barra della scala, 500
micron) di un 6 mesi del mouse WT e le immagini di TH + neuroni in topi WT e Tg2576 (barra della scala, 10 micron). ( D )
Quantificazione dei LC TH + neuroni in 6 mesi di età topi ( n = 6 per genotipo; 9 sezioni per animale). ( E ) Immunoblots di
proteine totali TH dell'ippocampo da 6 mesi topi ( n = 6 per genotipo) e la quantificazione densitometrica delle variazioni di
valori di grigio (a due code spaiato t -test * P = 0.037). ( F ) TH / NeuroTrace doppio etichettatura in sezioni CA1 (bar scala, 50 pm)
e TH livelli densitometriche a 6 mesi topi ( n = 3 per genotipo, 4 sezioni per animale; due code per dati non appaiati t -test * ** P
= 5.00 × 10 -5 ). ( G ) Come e mostrando proteina totale TH dallo striato dorsale ( n = 6 topi per genotipo). ( H ) normalizzato CA3to-CA1 fEPSP media pendenza (± sem ogni 2 min) registrati dalla regione dendritica CA1 in fette da 6 mesi di età topi. Un
condizionata treno ad alta frequenza è stato consegnato (freccia) a seguito di una linea di base 20 min. Tracce (bar scala, 100
mV, 10 ms) sono fEPSPs registrati durante basale (1) e 1 h dopo la stazione (2). La trama indica il grado di potenziamento a 55-60
minuti dopo il treno (WT: n = 6 fette di 4 topi; Tg2576: n = 6 fette da 5 topi, due code spaiato t -test ** P = 0,006). ( I ) Immunoblots
di proteine PSD ippocampo di 6 mesi topi ( n = 8 per genotipo), sondati con gli anticorpi indicati, e quantificazione
densitometrica dei cambiamenti dei valori di grigio espressi come media rapporto Tg / WT (a due code spaiato t -test: D1, ** P =
0,002; GluA1, *** P = 0,001). ( J ) Tempo totale di congelamento durante la prova contesto CFC (6 topi per genotipo; due code per
dati non appaiati t -test ** P = 0.009). Tranne dalla trama box-and-whisker in h , valori rappresentano media ± sem
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Studi precedenti descrivono alterazioni strutturali nelle sinapsi dell'ippocampo e menomazioni
nella plasticità sinaptica in topi Tg2576 che possono essere alla base alcuni dei deficit cognitivi in
questi animali 22 , 23 , 24 . Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che in 3 mesi di età degli
animali, all'età di insorgenza di morte cellulare DAergica, potenziamento a lungo termine (LTP)
nelle sinapsi CA3-to-CA1 di topi Tg2576 è influenzato 24 , 25 mentre la composizione PSD
cambiamenti già avvengono, con ridotti livelli di subunità AMPA GluA1, diminuzione della densità
di CA1 piramidale neuroni spine dendritiche e alterata trasmissione glutamatergica 25 . Qui, al fine
di verificare se alterazioni sinaptiche nelle ippocampo Tg2576 parallelo progresso della perdita di
cellule VTA DAergica, abbiamo misurato LTP nelle sinapsi CA3-to-CA1 in 2 e 6 mesi di età topi
Tg2576. Negli animali 2 mesi di età, quando i numeri DAergica neuroni nella VTA sono ancora
intatte, LTP negli animali Tg2576 non differiva in modo significativo da controlli appaiati per età (
supplementare Fig. 3a ). Invece, LTP magnitudo era significativamente più bassa nei 6 mesi di età
topi Tg2576 ( Fig. 4h ), un'età in cui la morte delle cellule VTA DAergica è pronunciato e DA
deflusso nell'ippocampo è notevolmente ridotta. Così, in Tg2576 topi potenziamento a livello delle
sinapsi CA3-to-CA1 si deteriora con l'età e questo deterioramento sembra seguire l'avanzamento
della morte cellulare VTA DAergica. In contrasto LTP, potenziamento a breve termine è rimasto
invariato in 6 mesi di età topi Tg2576 come il rapporto accoppiato impulsi (PPR) è stato simile tra
genotipi ai diversi intervalli inter testati ( Fig complementare. 3b ). Il rapporto input-output era
simile tra i topi WT e Tg2576, indicando nessun cambiamento nella trasmissione sinaptica basale (
complementare Fig. 3c ).
Come modifiche PSD precedono alterazioni funzionali di sinapsi 25 , abbiamo analizzato
l'espressione della proteina nella frazione PSD dell'ippocampo a 6 mesi di età topi Tg2576. Coerenti
con le nostre precedenti osservazioni a 3 mesi di età degli animali 25 , la superficie espressione
della subunità AMPA GluA1 stato down-regolato a 6 mesi di età topi Tg2576 ( Fig. 4i , figure
complementari 3d, e e 6c ). Al contrario, abbiamo trovato che i livelli di recettori dell'ippocampo D1
aumentati significativamente nel PSD di topi Tg2576, suggerendo lo sviluppo di una risposta
compensatoria a bassi livelli di basale DA. Non abbiamo osservato differenze di altri componenti
post-sinaptici, inclusi i recettori D2 ( Fig. 4i ).
Infine, abbiamo esaminato lo sviluppo di deficit di memoria in un compito contestuale paura
condizionata (CFC). Durante CFC, il tempo di congelamento totale dopo ri-esposizione a un
contesto di avversione declinato in 6 mesi di età topi Tg2576 ( Fig. 4 undecies , Fig supplementare.
3f ). È importante sottolineare che, come riportato in precedenza 23 , 25 , deficit di memoria erano
assenti in 2 mesi di età topi Tg2576 ( supplementare Fig. 3g ), in linea con l'assenza di morte
cellulare DAergica nel VTA prima dei 3 mesi di età.
L
-dopa e selegilina ripristinare deficit di memoria e di ricompensa
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Studi precedenti hanno dimostrato che le manipolazioni farmacologiche volte ad aumentare la
trasmissione DAergica nell'ippocampo e nella corteccia potrebbero migliorare le funzioni
sinaptiche, disturbi cognitivi e deficit di memoria nei pazienti con AD 45 , 46 , 47 , 48 e modelli
sperimentali AD-come 49 , 50 , 51 , 52 , 53 . Spinto dalla constatazione che la progressione DAergica
morte cellulare nel VTA si verifica intorno al periodo del peggioramento del deficit erettile
sinaptiche e della memoria nell'ippocampo Tg2576, abbiamo ipotizzato che la valorizzazione del
tono DAergica potrebbe migliorare le alterazioni dell'ippocampo. A questo scopo abbiamo
esaminato gli effetti del trattamento subcronica con il DA precursore L -dopa a hippocampal
plasticità sinaptica (vedi complementare Fig. 4a per il protocollo somministrazione del farmaco).
Sei mesi di età animali WT sotto-trattati cronicamente con L -dopa ha avuto una lieve, ma non
significativo aumento della grandezza di CA3-to-CA1 LTP rispetto ai controlli trattati con soluzione
salina (sham) ( Fig. 5a ). D'altra parte, L trattamento-dopa salvato deficit LTP nei topi Tg2576
ripristinando LTP ai livelli di animali WT ( Fig. 5a ). L'effetto di salvataggio di L-dopa nei topi
Tg2576 stato riprodotto da acuta, vasca da applicazione di L -dopa (10 uM) durante la registrazione
LTP e fu imitato dal agonista selettivo del recettore D1 / D5 SKF38393 (10 pM; . Complementare
Fig 4b ). D'altra parte, quinpirole (100 nM), un agonista del recettore D2 selettivo, non è riuscito a
cambiare LTP in fettine di topi Tg2576, suggerendo che il salvataggio di LTP seguente L
trattamento-dopa e maggiore disponibilità DA è mediata dai recettori D1 / D5.
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Figura 5: Sub-cronica L -dopa o selegilina trattamento salva deficit di plasticità CA3-to-CA1
a 6 mesi di età topi Tg2576.
( A , b ) mostrano trame correnti normalizzate fEPSP significa pendenza (± sem visualizzata ogni 2 min) registrati dalla regione
dendritica dei neuroni CA1 in fettine ippocampali da 6 mesi salina trattata (sham) e L -DOPA- ( un ) o selegilina (sel) -treated ( b )
topi WT e Tg2576. Le frecce indicano quando un treno ad alta frequenza è stato consegnato stimolando la via collaterale
Scha鸀�er nella regione CA3. Tracce si sovrappongono fEPSPs registrati durante basale (1) e 1 h dopo la stazione (2). I grafici boxand-whisker sotto indicano il grado di potenziamento, misurato come incremento fEPSP pendenza rispetto al basale, 55-60
minuti dopo che il treno ( un , WT: n = 6 fette da 3 sham, 6 fette da 4 L -DOPA- topi trattati; Tg: n = 6 fette da 3 sham, 7 fette da 3 L
topi trattati-dopa; ANOVA a due vie: genotipo × trattamento, F 1,21 = 6.51, p = 0,019; genotipo, F 1,21 = 3.22, p = 0,087; trattamento,
F 1,21 = 26.09, P <1,00 × 10 -4 ; WT sham-Tg sham * P <0,050, Tg sham-Tg L -dopa *** P <0,001 con di Bonferroni alberino hoc . prova
( b ) WT: n = 7 fette di topi 3 sham, 8 fette di 4 topi sel-trattati; Tg2576: n = 6 fette da 3 sham, 6 fette di 4 topi sel trattati; ANOVA a
due vie: genotipo × trattamento, F 1,23 = 16.61, P = 5,00 × 10 -4 ; genotipo, F 1,23 = 2,00, p = 0,171; trattamento, F 1,23 = 5,99, p =
0,022; WT sham-Tg sham ** P <0,010, Tg sham-Tg sel *** P <0,001 con di Bonferroni post hoc test. Sia L -dopa e aumento
selegilina LTP nei topi Tg2576 pur non avendo alcun e鸀�etto sugli animali WT (barre di scala di tracce: 100 mV, 10 ms).
Per confermare questi dati ed esaminare gli effetti a lungo termine della maggiore disponibilità di
endogena DA, abbiamo trattato 6 mesi di età animali con selegilina, un inibitore selettivo
irreversibile della monoamino ossidasi-B (rif. 54 ; . Complementare Fig 4c ). Esperimenti su animali
microdialisi liberi di muoversi confermato che il trattamento subcronico con selegilina aumentato
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DA deflusso nell'ippocampo di topi Tg2576 ( complementare Fig. 4d ). Analogamente a L -dopa, il
trattamento selegilina salvato la grandezza LTP in 6 mesi di età i topi Tg2576, senza influenzare gli
animali WT ( Fig. 5b ). Così, sia esogena ( L -dopa) e endogenamente (selegilina) indotta aumenti DA
disponibilità migliorata plasticità dell'ippocampo, sostenendo la nostra ipotesi che la ridotta
deflusso DA nell'ippocampo AD peggiora disfunzioni sinaptiche in topi Tg2576.
Come previsto, la selegilina non è riuscito a salvare i livelli TH a 6 mesi di età topi Tg2576 ( Fig. 6
bis , supplementare Fig. 7a ). Tuttavia, l'aumento selegilina indotto disponibilità DA ripristinato
livelli GluA1 fosforilazione (Ser845) nei topi Tg2576 mentre non ha effetto nei controlli ( Fig. 6a ).
Questa attività sembrava dipendere dagli effetti della selegilina sull'esposizione D1 perché
innescato la rimozione dei recettori D1 dal PSD sia nei topi WT e Tg2576 ( Fig. 6b , complementare
Fig. 7b ), probabilmente come risposta compensatoria alla disponibilità DA. L'attivazione dei
recettori D1 è seguita l'aumento dell'espressione GluA1 nel PSD ( Fig. 6b ), in linea con le precedenti
relazioni 55 , 56 . Risultati simili sono stati ottenuti anche da L trattamento-dopa subcronica che ha
portato al ripristino di entrambi i recettori D1 e espressione GluA1 nelle frazioni PSD
dell'ippocampo ( Fig. 6c , complementare Fig. 7c ). Il recupero del hippocampal plasticità CA3-toCA1 sinaptica e composizione PSD nei topi Tg2576 di selegilina anche correlata con il ripristino
della densità delle spine in neuroni piramidali dendriti apicali ubicata nella CA1 stratum radiatum (
Fig. 6d, e ).
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Figura 6: selegilina o subcronica L trattamento-dopa salvataggi dell'ippocampo composizione
PSD e densità delle spine dendritiche nei topi Tg2576.
( Un - c ) immunoblot rappresentativi del totale ( un ) e PSD ( b ) le proteine dell'ippocampo da 6 mesi di età topi WT e Tg2576
trattati con selegilina (SEL) o soluzione salina (sham) e proteine PSD ( c ) preparato da L - DOPA o topi trattati con soluzione
salina, sondati con gli anticorpi indicati, e quantificazione densitometrica delle variazioni di valori di grigio. Per le proteine
totali actina è stata utilizzata come controllo di caricamento. Selegilina non salvare proteina livelli TH ma selegilina e L -dopa
ripristino composizione PSD nei topi Tg2576 ( un : 8 topi per gruppo; due code spaiato t -test per pGluA1 / GluA1: WT sham-Tg
sham * P = 0,012, Tg sham-Tg sel * P = 0,027; per TH / actina: WT sham-Tg sham * P = 0,029, WT sham-Tg sel * P = 0.022, WT sel-Tg
sham * P = 0.017, WT sel-Tg sel * P = 0,015; ( b ) 10 topi per gruppo, due code spaiato t -test per GluA1: WT sham-Tg sham *** P =
8.00 × 10 -4 , Tg sham-Tg sel ** P = 0,010; per D1: WT sham-WT sel *** P = 2,00 × 10 -4 , WT sham-Tg sham ** P = 0,009, WT sel-Tg
sham *** P = 3,00 × 10 -4 , Tg sham-Tg sel * P = 0,028; ( c ) 8 topi per gruppo; due code spaiato t -test per GluA1: WT sham-Tg sham
** P = 0.008, WT L -dopa-Tg sham * P = 0,031, Tg sham-Tg L -dopa * P = 0,032; per D1: WT sham-WT L -dopa * P = 0.020, WT shamTg sham * P = 0,028, WT L -dopa-Tg sham ** P = 0,002, Tg sham-Tg L -dopa * P = 0,039). ( D ) Ricostruzione di un neurone WT sham
Golgi macchiate CA1 piramidale (barra della scala, 100 um) e segmenti rappresentativi di dendriti apicali da 6 mesi SEL- e topi
sham trattati (bar scala, 10 pm). Riquadri mostrano micrografie ad alto ingrandimento (bar scala, 2 um). ( E ) densità delle spine
(numero medio rachide a 25 um segmento dendrite) viene aumentata in animali Tg2576 dopo il trattamento selegilina ( d , e : n
= 3 topi per gruppo, 10 neuroni piramidali per topo, due code per dati non appaiati t -test: WT sham-Tg sham *** P <1,00 × 10 -4 ,
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WT sham-Tg sel ** P = 0,010, WT sel-Tg sham *** P <1,00 × 10 -4 , WT sel-Tg sel ** P = 0.010, Tg sham-Tg sel *** P <1,00 × 10 -4 ). I
dati rappresentano media ± sem
In considerazione del fatto che i trattamenti con L -dopa o selegilina migliorare hippocampal
plasticità sinaptica e composizione PSD, abbiamo poi chiesto se la funzione di memoria alterata
nei topi Tg2576 potrebbe essere migliorato con il trattamento. Infatti, sia la selegilina (
complementare Fig. 5a ) e L -dopa ( complementare Fig. 4a ) trattamenti aumentato il tempo totale
di congelamento suscitato da ri-esposizione a stimoli avversi durante un compito CFC in 6 mesi di
età topi Tg2576 ( Fig. 7a , b , complementare Fig. 5b, c ). Inoltre, la selegilina migliorato memoria
spaziale dei topi Tg2576, come indicato dalla maggiore distanza percorsa nel quadrante
destinazione che precedentemente conteneva la piattaforma di fuga durante la fase di sonda di un
test Morris water maze ( Fig. 7c , Fig supplementare. 5d-f ).
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Figura 7: selegilina o subcronica L salvataggi di trattamento-dopa le prestazioni della
memoria e di elaborazione ricompensa nei topi Tg2576.
( Una , b ) il tempo totale di congelamento durante il test contesto CFC in 6 mesi di età verso sham- e topi sel-trattati ( una ; 6
topi per gruppo) e in verso sham- e L -dopa-topi trattati ( b ; 5 topi per gruppo). Entrambi i farmaci ripristinare memoria paura
contestuale nei topi Tg2576 ( un : due code per dati non appaiati t -test: WT sham-Tg sham * P = 0,015, WT sel-Tg sham * P =
0.025, Tg sham-Tg sel ** P = 0.004 , ( b ): due code per dati non appaiati t -test: WT sham-Tg sham * P = 0.018, WT L -dopa-Tg
sham *** P = 1.30 × 10 -4 , Tg sham-Tg L -dopa ** P = 0,007). ( C ) Percentuale di distanza percorsa nel quadrante destinazione
(precedentemente, contenente la piattaforma) durante la fase della sonda della prova MWM per 6 mesi sham- e topi sel-trattati (
n = 5 topi per gruppo). Topi sham tg nuotavano meno nel quadrante bersaglio rispetto ai restanti gruppi, mentre selegilina era in
grado di ripristinare le prestazioni della memoria spaziale (due code per dati non appaiati t -test: WT sham-Tg sham * P = 0.030,
WT sel-Tg sham * * P = 0,008, Tg sham-Tg sel * P = 0,031). ( D ) cioccolato indotta posto preferenza nei topi 6 mesi sham- e SELtrattati ( n = 4 WT sham, 4 WT sel, 4 Tg sham e 6 topi sel Tg) mostra il tempo medio trascorso in camere appaiati e appaiati in
sessione post-condizionamento, meno il tempo trascorso nelle stesse camere durante la sessione di pre-condizionamento di un
test CPP (bidirezionale misure ripetute ANOVA: camera, F 1,14 = 36.97, P <1,00 × 10 -4 ; camera trattamento ×, F 3,14 = 231,34, P
<0,050; trattamento, F 3,14 = 0,50, p = 0,680; WT sham-Tg sham ** P <0,010, WT sel-Tg sham * P <0,050, sham Tg sel -Tg *** P
<0.001 con di Tukey hoc messaggio di prova). ( E ) Il consumo di cioccolato durante sessioni di condizionamento del test CPP
mostrato in d (ANOVA: F 3,14 = 37.10, P <1,00 × 10 -4 ; WT sham-Tg sham * P <0,050, WT sham-Tg sel *** P <0,001, WT sel-Tg sham *
P <0,050, WT sel-Tg sel *** P <0,001, Tg sham-Tg sel *** P <0,001 con Tukey hoc alberino test). Tutti i dati rappresentano media ±
sem
Infine, abbiamo studiato se il trattamento selegilina potrebbe ripristinare i difetti di CPP e
consumo alimentare osservati nei topi Tg2576 durante la prova CPP ( complementare Fig. 5g ).
Come previsto, anche se salina-animali trattati Tg2576 erano in grado di mostrare una maggiore
preferenza per la camera associata con il cibo soddisfacente e consumati meno cioccolato durante
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la fase di condizionamento, questi deficit sono assenti da topi selegilina trattati ( Fig. 7d, e ).
Concludiamo che la maggiore disponibilità di DA nell'ippocampo e NAC può migliorare i deficit
mnesiche e perdite di valore nel settore della trasformazione ricompensa mesolimbico a 6 mesi di
età topi Tg2576.
Discussione
Negli ultimi anni prova accumulando ha dimostrato un legame tra disfunzione e deficit di memoria
AD-correlati nella segnalazione DA nei pazienti e modelli sperimentali di AD (rif 49 , 50 , 51 , 52 , 56
, 57 , 58 , 59 , 60 , 61 ). Qui, in un modello murino di AD, in una fase in cui è ancora verificato alcun
deposizione Ap-targa, grovigli tau hyperphosphorylated o alcun segno di perdita di neuroni in
regioni corticali e dell'ippocampo coinvolti nel deficit di memoria 21 , 23 , 24 , forniamo la prova che
uno specifico processo apoptotico si svolge nel VTA, causando una progressiva degenerazione
della popolazione neuronale DAergica. Questa perdita neuronale è selettivo per i neuroni VTA
DAergica, come dimostrato dalla constatazione che il numero di TH - neuroni rimane
sostanzialmente invariata.
La perdita di neuroni VTA DAergica è accompagnato da un deflusso ridotto di DA nell'ippocampo e
nella regione shell del NAc. Curiosamente, DA deflusso al nucleo NAc (e livelli DAT) è rimasto
invariato nei topi Tg2576, anche se questa regione è fortemente innervato dai neuroni VTA
DAergica 34 . Tuttavia, va notato che il guscio NAC e nucleo sono innervati dal sottopopolazioni
anatomicamente distinti di neuroni VTA altamente eterogenei quanto riguarda le loro proprietà 34 ,
62 , 63
, con la maggior parte dei neuroni guscio sporgenti situati nel nucleo paranigral nella VTA
mediale e la maggior parte dei neuroni centrali sporgenti situati nella zona pigmentata
parabrachiale del laterali VTA 34 , 35 , suggerendo che mediale neuroni VTA DAergica può mostrare
più vulnerabilità nei topi Tg2576.
Il ridotto deflusso DA nell'ippocampo Tg2576 e NAC coperture, aree cerebrali implicato
principalmente nella memoria e rendimento, rispettivamente, potrebbero ampiamente contribuire
ai deficit di memoria ippocampo-dipendente e la plasticità sinaptica, come pure i danni nella
lavorazione premio. Abbiamo scoperto che la progressione di questi deficit nel modello Tg2576 del
mouse segue l'insorgenza di degenerazione neuronale VTA a 3 mesi di età. Di conseguenza,
hippocampal plasticità sinaptica e composizione PSD, piramidale densità neurone colonna
vertebrale, le prestazioni mnesiche ed elaborazione premio, sono tutte migliorate stimolando il
sistema DA con la somministrazione di L -dopa o con riduzione del degrado DA endogena con
selegilina. Vale la pena notare che, sebbene abbiamo confermato che il trattamento selegilina
aumentato DA deflusso nell'ippocampo, non possiamo escludere che il salvataggio del deficit
comportamentali potrebbe coinvolgere regioni cerebrali aggiuntivi. Anche se l'efficacia di
selegilina come agente farmacologico in pazienti umani è controversa 64 , abbiamo usato questo
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inibitore con l'obiettivo specifico di valorizzare il segnale di DAergica. Va notato, tuttavia, che
l'efficacia della selegilina potrebbe dipendere dal grado di VTA neurodegenerazione.
Anche se le presenti osservazioni sono ottenuti in un modello sperimentale di AD, potrebbero
fornire una spiegazione interessante da recenti osservazioni in pazienti affetti da AD 26 che
indicano che la diagnosi clinica di demenza è associata a sintomi non cognitivi iniziali, come la
depressione e apatia. Quindi, è possibile che la degenerazione precoce dei neuroni VTA DAergica
potrebbe spiegare il peggioramento della memoria, nonché per almeno una parte dei sintomi non
cognitivi riportati in pazienti con AD primi. In realtà, forniamo la prova che la morte cellulare per
apoptosi neuronale presto osservato nei neuroni VTA DAergica si verifica nelle fasi di pre-placca
dell'ippocampo nel nostro modello animale, e non sembra essere il risultato di deposizione Applacca locale nella VTA. Anche se non possiamo escludere l'accumulo di altre forme di
aggregazione Ap nei neuroni VTA, non abbiamo osservato alcun modello anomalo nella
distribuzione di APPswe immunofluorescenza che potrebbe suggerire un legame tra intracellulare
di Ap e la degenerazione cellulare.
Qual è il meccanismo alla base della vulnerabilità selettiva dei neuroni VTA DAergica a APPswe
sovraespressione? L'osservazione che i neuroni DAergica si perdono nella VTA, pur essendo
risparmiato nel SNPC, è un quadro in qualche modo simmetrico a quello che i ricercatori coinvolti
nella malattia di Parkinson (PD) sono stati affrontare per molti anni, cercando di spiegare la perdita
selettiva dei neuroni DAergica in lo SNPC, mentre i neuroni sono in gran parte risparmiati nella
VTA. Un'ipotesi allettante è che la selettività della popolazione cellulare mesencefalo subire
perdita neuronale può essere il risultato di un meccanismo di morte-back avviato ai terminali degli
assoni, per cui processi degenerativi originari nell'ippocampo e NAC causano perdita di neuroni
VTA DAergica in AD, mentre in processi analoghi PD in testa striato di perdita selettiva nel SNPC
(rif. 65 ). Per inciso, un meccanismo di morte-back delle fibre monoaminergici senza patologia
amiloide locale è stata descritta in AD (rif 44 , 59 , 66 , 67 , 68 ). In alternativa, diverse linee di
evidenza suggeriscono che la disfunzione mitocondriale è presente sia nel AD e PD. La fisiologia
eterogeneo di neuroni del mesencefalo DAergica potrebbe fornire le risposte necessarie per
comprendere questo mistero 69 rendendo possibile che APPswe sovraespressione potrebbe avere
effetti diversi nelle due aree del cervello.
Sebbene i meccanismi molecolari alla base all'inizio del VTA DAergica degenerazione dei neuroni
restano da chiarire, i nostri risultati suggeriscono VTA come un'importante area del cervello di
prendere in considerazione nel contesto di AD.
metodi
Animali e trattamenti farmacologici
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Topi eterozigoti Tg2576 21 e fratellini WT sono stati utilizzati in età che vanno da 2 a 11 mesi di età,
come descritto nel testo. Solo sono stati utilizzati soggetti di sesso maschile. Gli esperimenti sono
stati effettuati in conformità con le linee guida etiche della direttiva del Consiglio Comunità
europee (2010/63 / UE). Approvazione sperimentale è stato ottenuto dal Ministero della Salute
italiano (protocollo # 1191 / 2015PR).
Animali utilizzati per L esperimenti-dopa sono stati iniettati per via intraperitoneale (ip) con 10 mg
kg -1 L -dopa + 12 mg kg -1 benserazide (sia da Sigma-Aldrich) sciolto in soluzione salina, o 0,9%
soltanto soluzione fisiologica (sham) una volta al giorno per tre sere consecutive e 1 h prima
sessione sperimentale ( complementare Fig. 4a ). Animali impiegati per esperimenti selegilina sono
stati iniettati sottocute con 3 mg kg -1 selegilina (R - (-) - deprenyl cloridrato, Sigma-Aldrich)
preparato in soluzione salina allo 0,9% (SEL) o con 0,9% di soluzione salina solo (sham). Per una
descrizione dettagliata della sequenza temporale di trattamento selegilina per diversi esperimenti
vedere complementare figure 4c e 5a, d, g . Per tutti i trattamenti, volume di iniezione era di 5
microlitri per peso animale in grammi.
Immunoistochimica e immunofluorescenza
I topi sono stati anestetizzati con Rompun (20 mg ml -1 , 0,5 ml kg -1 , ip, Bayer) e Zoletil (100 mg ml
-1
, 0,5 ml kg -1 , Virbac) e perfusi transcardially con 50 ml di soluzione salina seguita da 50 ml del
4% paraformaldeide in tampone fosfato (PB; 0,1 M, pH 7,4). I cervelli sono stati postfissati in
paraformaldeide notte a 4 ° C e poi immersi in una soluzione di saccarosio al 30% a 4 ° C. I cervelli
sono stati tagliati in 30 micron di spessore sezioni coronali utilizzando un microtomo di
congelamento.
Le sezioni selezionate per immunoistochimica (ogni seconda fetta è stato trattato per un totale di
9 sezioni) sono stati trattati con un anticorpo di coniglio anti-TH. La perossidasi endogena è stata
neutralizzata con un 0,3% H 2 O 2 soluzione in PB. Le sezioni sono state incubate overnight a 4 ° C
con l'anticorpo primario diluito in PB contenente 0,3% Triton X-100. Dopo tre lavaggi in PB, le
sezioni sono state incubate con un anticorpo secondario biotinilato (Jackson ImmunoResearch
Laboratories, West Grove, PA, USA) seguito dal metodo avidina-biotina-perossidasi (Kit Vectastain,
ABC, Vector, Burlingame, CA, USA) e utilizzando il cromogeno 3,3-diaminobenzidina (Sigma).
Infine, le sezioni sono state di contrasto con Nissl, disidratate e coprioggetto con Entellan (Sigma).
Per TH / GFAP, TH / Iba1, TH / NeuroTrace colorazione e per TH / APPswe, deposizione
NeuroTrace / APPswe, fette sono state incubate overnight con anticorpi primari in PB contenente
0,3% Triton X-100 e quindi incubate per 2 ore a temperatura ambiente con anticorpi secondari.
Per DAT quantificazione, fettine cerebrali acute coronali (vedi sotto) sono stati fissati in
paraformaldeide al 4% in PB e trasferiti al 30% di saccarosio in PB a 4 ° C. Fette sono state
incubate per 2 giorni con anticorpi primari in PB contenente 1% Triton X-100 e quindi incubate per
2 ore a temperatura ambiente con anticorpi secondari. DAT livelli (F / A) e livelli TH (G / A) sono
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stati quantificati con ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ ) come media intensità del segnale di
fluorescenza (F) su un'area definita (A). La quantificazione è stato fatto su otto campioni per il
mouse.
Per l'analisi di GFAP, Iba1 e marcatori DAT, immagini sono state prese come Z-stack e queste
immagini Z-stack sono stati elaborati mediante proiezione massima intensità. Tutti i campioni
sono stati acquisiti con lo stesso spessore Z-stack e le stesse impostazioni laser. La raccolta dei
dati per la densitometria è stato fatto da un cieco ricercatore al genotipo di ciascun animale.
Gli anticorpi primari: TH (1: 700, Millipore; MAB318; RRID: AB_2201528), GFAP (1: 200, DAKO,
Z0334; RRID: AB_2314535), hAPP695 (APPswe, 1: 500, Biolegend, # 803.001; RRID: AB_2564653) ,
DAT (1: 200, Chemicon, MAB369; RRID: AB_2190413), Iba1 (1: 400, Wako # 019-19.741; RRID:
AB_839504). Anticorpi secondari: Alexa Fluor 488 asino anti-IgG di coniglio (1: 200; RRID:
AB_2535792), Alexa Fluor 555 asino anti-IgG di topo (1: 200; RRID: AB_2536180) e Alexa Fluor 555
asino anti-IgG di coniglio (1: 200; RRID: AB_2536182).
Le sezioni sono state di contrasto con NeuroTrace 640/660 rosso scuro fluorescente Nissl Stain (1:
200, Invitrogen), montato utilizzando un mezzo anti-sbiadimento (Fluoromount, Sigma-Aldrich) ed
esaminato sotto un microscopio confocale a scansione laser (LSM700, Zeiss ). La specificità della
marcatura immunoistochimica è stata confermata dalla omissione di anticorpi primari e l'uso di
siero normale invece (controlli negativi).
Tutte le immagini sono state esportate in formato di file di immagine con tag (TIFF), contrasto e
luminosità sono stati adeguati e lastre finali sono stati composti con Adobe Illustrator CS3.
analisi stereologica
Sezioni trattati per immunoistochimica sono stati usati per ottenere stime imparziali di numero
totale di TH + e TH - neuroni nel SNPC e VTA e TH + neuroni nel LC. I confini di queste aree nel
cervello del mouse sono stati definiti da TH colorazione, e la distinzione zona è stata eseguita in
base alle linee guida pubblicate 70 . Abbiamo applicato un design stereologica di frazionamento di
un ottico (conteggio bilaterale) utilizzando il sistema Investigator Stereo (MicroBrightField Europa
eK). Una pila di MAC 5000 moduli di controllo (Ludl prodotti elettronici, Ltd) è stato interfacciato
con un microscopio Olympus BX50 con un palco motorizzato e una macchina fotografica digitale
HV-C20 Hitachi con una postazione PC Pentium II. Una sonda tridimensionale ottico conteggio
frazionatore ( x , y , z è stato applicato dimensione di 50 × 50 × 25 um). Le aree cerebrali di VTA e
SNPC stati illustrati in base alle 5 × cellule neuronali obiettive e sono stati contrassegnati con un
obiettivo × 100 ad immersione in olio. L'area del cervello di LC è delineato con l'obiettivo × 5 e le
cellule sono stati contrassegnati con un obiettivo × 40 ad immersione in olio. La raccolta dei dati
per il conteggio delle cellule è stato fatto da un cieco ricercatore al genotipo di ciascun animale.
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I neuroni sono stati considerati TH + se hanno mostrato citoplasmatica immunoreattività TH,
mentre erano considerati TH - se il nucleo è stato chiaramente visualizzato ma citoplasmatica TH
colorazione era assente.
Il numero totale dei neuroni (TH + e TH - per VTA e SNPC; TH + per LC) è stato stimato secondo la
formula:
dove SQ rappresenta il numero di neuroni contati in tutti i campi otticamente campione dell'area
di interesse (VTA, SNPC o LC), SSF è la frazione di campionamento sezione, ASF è la frazione di
campionamento area e TSF è la frazione di campionamento spessore.
In situ etichettatura fine della frammentazione del DNA (TUNEL)
Per colorazione TUNEL, cervelli sono stati rimossi come prima e tagliati a fette coronali (spessore
10 um). Ogni decimo fetta è stato elaborato per TUNEL. Dopo la rimozione di paraffina con xilene e
reidratazione in soluzioni di etanolo di concentrazione decrescente, le sezioni sono stati digeriti
con proteinasi K (20 pg ml -1 , 15 min), lavati in acqua distillata ed esposti brevemente al 3% H 2 O 2
. La reazione TUNEL è stata effettuata utilizzando il Plus perossidasi Apoptag In-Situ apoptosi
Detection Kit (Millipore). Cellule TUNEL-positivi sono stati rivelati con diaminobenzidina e H 2 O 2
in base alle istruzioni del fornitore. Fette macchiati erano leggermente Nissl-di contrasto con
violetto cresolo. Le cellule sono state definite come apoptotico se fossero TUNEL-positivi o se
mostrarono nuclei tipici con cromatina condensata o frammentazione nucleare o entrambi. Cellule
TUNEL-positivi entro i confini anatomici del VTA e SNPC (rif. 70 ) sono state contate x 100
ingrandimenti con un microscopio Leitz DMRB.
microdialisi
Topi, anestetizzati con Zoletil e Rompun, sono stati montati su un telaio stereotassico (David Kopf
Instruments) e impiantati unilateralmente con sonde microdialisi 24-36 h prima degli esperimenti.
Le sonde concentriche dialisi (fibre AN69, Hospal DASCO) sono stati impiantati verticalmente a
livello dell'ippocampo (AP -3.0, ML ± 2,7 dal bregma) 70 , shell del NAc (AP +1,6, ML ± 0,2) e striato
(+1,0 AP , ML ± 1.8). Le lunghezze sonda erano 5 mm per dell'ippocampo (3 membrana mm) 5,5 mm
per coperture NAc (1 mm) e il 4,5 mm per striato (2 mm). Ogni sonda è stato fissato e la pelle è
stata suturata. I topi sono stati restituiti al loro gabbie casa e il tubo di uscita e ingresso della
sonda erano protetti da parafilm applicato localmente. Le membrane sono stati testati per in vitro
di recupero prima dell'intervento chirurgico. Il giorno dell'esperimento ciascun animale è stato
posto in una gabbia circolare contenente usate microdialisi: la sonda microdialisi è stato collegato
ad un CMA / 100 pompa (Carnegie Medicine) attraverso PE-20 tubo e un ultra basso girevole
servoassistito multicanale coppia (Modello MCS5, Instech Laboratories) per consentire la libera
circolazione. Fluido cerebrospinale artificiale (aCSF; in mM: NaCl 140; KCl 4; CaCl 2 1.2; MgCl 2 1) è
stata pompata attraverso la sonda di dialisi (2,1 ml min -1 ). Dopo l'inizio della perfusione di dialisi, i
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topi sono stati lasciati indisturbati per ~ 1 ora prima della raccolta di tre campioni di base per
calcolare la concentrazione media basale. Campioni di dializzato sono stati raccolti ogni 20 minuti
per 60 min. Cervelli sono stati poi postfissati in 4% paraformaldeide, tagliato a fette coronali (100
um) e trattati per metilene colorazione blu. Il corretto posizionamento delle sonde è stata
confermata al microscopio. I dati provenienti da animali non mostrano il corretto posizionamento
sono stati scartati.
Ciascun campione dializzato (20 ml) è stato analizzato mediante cromatografia liquida ultraprestazioni. Concentrazioni (pg 20 ml -1 ) non sono stati corretti per il recupero della sonda.
L'apparato cromatografia liquida ultra-prestazioni (ACQUITY, Waters Corporation) è stato
accoppiato ad un rivelatore amperometrico (decennio II, Antec Leyden) contenente un in situ
elettrodo di riferimento Ag / AgCl e un flusso cella elettrochimica (VT-03, Antec Leyden) con un
elettrodo di carbone vetroso 0,7 mm montato con da 25mm distanziatore. Il flusso-cella
elettrochimica, posta ad un potenziale di 400 mV, è stato posizionato immediatamente dopo una
colonna BEH C18 (2,1 × 50 mm, 1.7 micron dimensione delle particelle; Waters Corporation). La
colonna è stata mantenuta a 37 ° C (0,07 ml min -1 portata). La composizione della fase mobile era
(in mM): acido fosforico 50, 8 KCl, 0,1 EDTA, 2,5 1-octanesulfonic sale di sodio dell'acido, 12%
MeOH e pH 6,0 regolato con NaOH. Altezza del picco ottenuto per ossidazione del DA e
noradrenalina è stata confrontata con quella prodotta da una norma. Il limite di rilevamento è
stata di 0,1 pg.
Acuta preparazione fetta cervello per l'elettrofisiologia
Fettine cerebrali acute (250-300 um) sono stati ottenuti applicando alotano anestesia e
decapitazione. Il cervello è stato rapidamente rimosso e fette coronali contenenti striato e NAC
nucleo / guscio o fette parasagittali contenenti dell'ippocampo dorsale sono stati tagliati con un
vibratomo (VT1200S, Leica) in refrigerate gorgogliare (95% O 2 , 5% CO 2 ) aCSF contenente ( in
mM): NaCl 124, KCl 3, NaH 2 PO 4 1.25, NaHCO 3 26, MgCl 2 1, CaCl 2 2, glucosio 10 ( ~ 290 mOsm, pH
7,4). Fette sono stati incubati per 1 h in aCSF a 32 ° C e poi trasferite a temperatura ambiente per
almeno 30 minuti prima registrazioni. Una singola fetta cervello è stato trasferito ad una camera di
registrazione e completamente immerso in aCSF (3-4 ml min -1 ; 32 ° C).
Potenziale costante Amperometria
rivelazione amperometrica di DA in fettine cerebrali acute contenenti striato e NAc è stata
eseguita utilizzando elettrodi in fibra di carbonio (diametro 30 um, lunghezza 100 um, World
Precision Instruments) disposti in prossimità di un elettrodo di stimolazione Ni / Cr bipolare, ad
una profondità di 50-150 micron nella fetta coronale. La tensione imposto (MicroC potenziostato,
Mondo Precision Instruments) tra l'elettrodo di fibra di carbonio e il pellet Ag / AgCl era 0,55 V.
Per la stimolazione, un singolo impulso elettrico rettangolare è stata applicata usando una DS3
stimolatore (Digitimer) ogni 5 min lungo un intervallo di intensità di stimolazione (20-1,000 uA, 2040 durata ms). In risposta a un protocollo di aumentare la stimolazione, un plateau di rilascio di DA
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è stata raggiunta la massima intensità di stimolazione (1,000 uA, 40 microsiemens). I segnali sono
stati digitalizzati con Digidata 1440A accoppiato ad un computer che esegue pClamp 10 (sia da
Molecular Devices). calibrazione dell'elettrodo è stata eseguita alla fine di ciascun esperimento di
DA vasca perfusi (0,3-10 pM).
registrazioni matrice multielettrodico
Una fetta acuta parasagittale contenente dell'ippocampo dorsale è stata posta su un array di
elettrodi planari 8 × 8, ogni 50 × 50 micron di dimensione, con una distanza interpolar di 150 um
(MED-P5155, Alpha MED Sciences), regolato in modo che l'intero strato piramidale CA1 e stratum
radiatum stati coperti con elettrodi sottostanti. La fetta è stata mantenuta sommersa utilizzando
un anello di platino coperto con rete di nylon. Segnali di tensione sono stati registrati con il
sistema MED64 (Alpha MED Scienze) e digitalizzato a 20 kHz, seguito da un filtro di 0,1-1 Hz con
una scheda di acquisizione dati 6071E (National Instruments), utilizzando il software Mobius (Alpha
MED Sciences). Campo eccitatori potenziali postsinaptici (fEPSPs) sono stati evocati dalla
stimolazione collaterale Schaffer (100 ms durata) attraverso uno dei 64 elettrodi planari poste nella
radiatum falda. Il canale di registrazione con la massima ampiezza fEPSP, ad una distanza di
almeno 300 um dal sito di stimolazione, è stata scelta come sito di registrazione. Curve di ingresso
e uscita sono stati ottenuti misurando la pendenza iniziale fEPSP ad aumentare 5 uA fasi di
stimolazione afferente, consegnati ogni 30 s. PPR è stata valutata con coppie di stimoli, in
ampiezza metà-massimale, separati da 20-500 ms. Per gli esperimenti LTP, dopo almeno 20 min di
stimolazione di prova (shock metà-massimale, ogni 30 s) per valutare fEPSP stabilità del pendio, la
fetta è stata impugnata con un treno condizionata a 100 Hz per 1 s, seguita da stimolazione di
prova per almeno 1 h. Il grado di LTP è stata valutata dal fEPSP pendenza media a 55-60 minuti
dalla stazione di condizionamento, normalizzata alla pendenza media durante basale. Per studiare
l'effetto acuto di L -dopa (Tocris) e del selettivo (recettore D1; Tocris) DA agonisti dei recettori
SKF38393 e quinpirole (D2 recettore; Tocris) su LTP, fette stati continuamente perfuso tutto
l'esperimento con aCSF contenente i farmaci a le concentrazioni finali, preparati dalle scorte
concentrate.
estrazione di proteine totali
Lo striato è stato dissezionato da fettine di cervello coronali acute; l'ippocampo è stato isolato da
tutto il cervello. I tessuti sono stati omogeneizzati in tampone di lisi contenente (in mM) 320
saccarosio, 50 NaCl, 50 Tris-HCl pH 7,5, 1% Triton X-100, 1 ortovanadato di sodio, 5 βglicerofosfato, 5 NaF e cocktail inibitore di proteasi, incubati su ghiaccio per 30 min e centrifugati
a 15.000 g per 10 min. Il contenuto totale di proteine del supernatante è stata determinata
mediante il metodo di Bradford.
Per valutare i livelli APPswe, l'ippocampo è stato dissezionato da fette di cervello parasagittali;
NAC e striato sono stati sezionati da fette di cervello coronali; VTA è stato dissezionato da fettine
di cervello orizzontali. I tessuti sono stati omogeneizzati in tampone RIPA contenente (in mM) 50
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Tris-HCl pH 7,5, 150 NaCl, 5 MgCl 2 , 1 EDTA, 1% Triton X-100, 0,25% desossicolato sodico, 0,1%
SDS, orthovanadate 1 sodio, 5 β -glycerophosphate, 5 NaF e proteasi cocktail inibitore, sonicato e
incubate in ghiaccio per 20 min. I campioni sono stati centrifugati a 15.000 g per 20 minuti e la
concentrazione di proteine del surnatante è stato determinato mediante il metodo di Bradford.
Luogo compito condizionata
Per valutare appetibile CPP indotta dal cibo, abbiamo usato un apparecchio a due camere in due
camere plexiglas (15 × 15 × 20 cm) che differiscono per il modello e il colore della griglia, collegati
da un vano centrale (15 × 5 × 20 cm) con due ante scorrevoli (4 × 20 cm). In ciascuna camera di due
parallelepipedi triangolari (5 × 5 × 20 cm), realizzato in plexiglas nero e disposte in vari modelli,
sono stati utilizzati come stimoli condizionati. Le condizioni di luce (segnali visivi e tattili) sono
stati adeguati per impedire preferenza per una certa camera. Il giorno di pre-condizionamento,
ciascun topo è stato lasciato nel vicolo centrale e lasciato libero accesso e esame delle camere
adiacenti dell'apparato, in assenza di cibo per 15 min. Durante i seguenti 6 giorni (sessione
condizionata), ciascun topo è stata limitata al giorno per 30 min alternativamente in una delle due
camere. Uno dei modelli è stata costantemente accoppiato con il cibo appetibile (0,5 g cioccolato
al latte, cioccolato al latte Milka Alpine fornendo 5,31 kcal g -1 di energia; camera di coppia) e l'altra
con regolare chow (dieta RC, Mucedola 4RF21; camera spaiato). Il pellet RC e la porzione di
cioccolato fornito ogni giorno sono stati progettati per essere isocalorica. Gli animali sono stati
assegnati in modo casuale a consumare o cioccolato o dieta di controllo. Per ogni genotipo sono
stati controbilanciati abbinamenti di gruppo in modo che nella metà del cioccolato gruppo è stato
accoppiato con uno dei modelli e nell'altra metà con l'altro. Il test è stato condotto su postcondizionamento giorno utilizzando la procedura di pre-condizionamento, durante il quale è stato
registrato il tempo totale trascorso in ciascuna camera. Comportamento animale è stato registrato
con una videocamera CCD, il segnale era digitalizzato e trasferito ad un computer. I dati sono stati
analizzati con il software EthoVision XT (Noldus) per ottenere il tempo trascorso durante le
sessioni di pre e post-condizionamento per ciascun soggetto, utilizzati come dati grezzi per i
punteggi di preferenza in ogni settore dell'apparato. Consumo di cioccolato è stata valutata
mediante una media, dopo ponderazione, la quantità residua di cibo al fine di giorni cioccolatoricezione.
Test contestuale paura condizionata
L'apparato costituito da un 21 × 21 × 49 centimetri camera (Ugo Basile) con pareti grigie plexiglas e
soffitto trasparente per consentire registrazioni video. Il piano di griglia (pezzi di acciaio
distanziate di 1,5 cm) è stato collegato ad un generatore scrambler shock. Il test CFC comprendeva
due sessioni: la formazione e la prova di contesto. Durante formazione ogni topo è stato collocato
nella camera per 2 min di esplorazione libera, seguita da tre shock non segnalato piede (1 mA, 2 s,
durata 60 s intervalli) forniti attraverso il pavimento griglia. Dopo 24 h, il soggetto è stato posto
ancora per 5 minuti nella camera di formazione non ricevendo scossa piede (test contesto).
Durante il test di formazione e di contesto è stato registrato il comportamento del mouse. Per
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valutare l'apprendimento repulsivo e la memoria, la durata complessiva del congelamento
(immobilità comportamentale, tranne che per i movimenti respiratori) esposto durante gli
allenamenti e test di contesto è stato segnato manualmente da un cieco osservatore al gruppo
sperimentale del campione, attraverso il software EthoVision XT (Noldus).
preparazione PSD
Frazionamento sub-sinaptica del PSD, ippocampi sono stati omogeneizzati con una smerigliatrice
tessuto Dounce in tampone di omogeneizzazione contenente (in mM) 320 saccarosio, 10 Tris-HCl
pH 7,4, 1 EDTA, 1 NaHCO 3 , 1 PMSF, 1 sodio ortovanadato, 5 NaF , 20 β-glicerofosfato e cocktail di
inibitori delle proteasi. L'omogenato è stato centrifugato a 1000 g (10 minuti) e il supernatante è
stato nuovamente centrifugato a 10.000 g (15 min). Il pellet è stato omogeneizzato in tampone di
omogeneizzazione contenente 0,5% Triton X-100 con una smerigliatrice tessuto Dounce, incubate
40 min in ghiaccio e centrifugati a 32.000 g (20 min). Il pellet risultante contenente PSD è stato
trattato per l'estrazione delle proteine. Brevemente, il pellet è stato risospeso in tampone RIPA
contenente (in mM) 50 Tris-HCl pH 7,5, 150 NaCl, 5 MgCl 2 , 1 EDTA, 1% Triton X-100, 0,25% di
sodio desossicolato, 0,1% SDS, orthovanadate 1 sodio , 5 β-glicerofosfato, 5 NaF e cocktail inibitore
di proteasi, è stato sonicato e incubate su ghiaccio per 20 min. I campioni sono stati centrifugati a
11.500 g per 10 minuti e la concentrazione di proteine del surnatante è stato determinato mediante
il metodo di Bradford.
analisi immunoblotting
Le proteine sono state applicate a SDS-PAGE e electroblotted su una membrana
polivinildenfluoruro. analisi immunoblotting è stata effettuata utilizzando un kit di rilevazione
chemiluminescenza. I livelli relativi di immunoreattività sono stati determinati mediante
densitometria utilizzando il software ImageJ. Gli anticorpi primari: GluA1 (1: 1.000; Millipore, 04855), GluA1p-Ser845 (1: 1.000; Millipore, AB5849; RRID: AB_92079), PSD-95 (1: 1.000; Millipore,
MAB1598; RRID: AB_94278), GluN2A (1: 250; Santa Cruz, SC-1468; RRID: AB_670223), Actina (1:
25.000; Sigma-Aldrich, A5060; RRID: AB_476738), D1 (1: 1.000, Abcam, ab20066; RRID: AB_445306),
D2 (1: 1.000, Millipore, AB5084P; RRID: AB_2094980), αCaMKII (1: 1.000, ThermoFisher, # 13-7300;
RRID: AB_2533032), TH (1: 1.000, Abcam, Ab112; RRID: AB_297840), hAPP695 ( APPswe, 1: 500,
Biolegend, # 803.001; RRID: AB_2564653). anticorpi secondari: capra anti-topo IgG (1: 3.000; BioRad, RRID: AB_11125936), capra anti-IgG di coniglio (1: 3.000; Bio-Rad, RRID: AB_11125142) e
coniglio anti-IgG di capra (1: 3.000 ; Bio-Rad, RRID: AB_11125144).
Le membrane sono state spogliate usando Re-Blot più forte soluzione (Millipore) per 15 minuti a
temperatura ambiente. Macchine complete sono riportate in Informazioni supplementari .
Analisi dendritica densità delle spine
Per studiare la morfologia delle spine dendritiche nei neuroni piramidali dell'ippocampo, i cervelli
sono stati rimossi dal cranio e impregnati con una soluzione di Golgi-Cox. Cervelli sono stati
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immersi in un 5% Cr 2 K 2 O 7 , 5% Cl 2 Hg e 5% CRK 2 O 4 soluzione (Sigma-Aldrich) per 6 giorni,
poi spostato in una soluzione di saccarosio al 30% per 3-5 giorni e infine tagliata a 100 micron
sezioni coronali a livello CA1 (-2,3 a -5,8 mm dal bregma). Fette sono stati sequenzialmente lavati
con le seguenti soluzioni: acqua distillata (1 min), H 5 NO (Sigma-Aldrich, 30 minuti al buio), acqua
distillata (1 min), Kodak Fix-pellicola (Sigma-Aldrich, 30 min a buio), acqua distillata (1 minuto), in
sequenza in 50, 70 e 95% di alcool (1 min ognuno), due volte in 100 alcool% (5 min), in una
soluzione di un terzo xilene, un terzo cloroformio e un terzo 100% di alcool (15 min), xilene (15
min). Fette sono stati poi coprioggetto con il Canada Balsam. Le fette colorate sono state
analizzate sotto un × 100 obiettivo ad immersione in olio (Axioskop, Zeiss). Durante l'analisi
morfologica (Neurolucida V11, MicroBrightField) l'identità del campione era sconosciuta. Un
neurone piramidale dell'ippocampo stato elaborato per l'analisi morfologica se l'etichettatura è
uniforme, precipitati di reazione sono assenti, se non sovrapporsi con le cellule vicine, se spine
erano chiaramente visibili, arbours dendritiche erano relativamente parallele al piano di sezione e
arbours in rami dendritici distali erano intatta e visibile. Con questi criteri, 30 neuroni piramidali
CA1 sono stati selezionati per gruppo (WT sham, Tg2576 sham, WT sel e Tg2576 sel). I arbours
dendritiche basali e apicali di ciascuna cella sono stati esaminati separatamente utilizzando
strumento di analisi Sholl del software. Terminale densità delle spine è stato calcolato come
numero di spine (definito come sporgenze della membrana dendritica indipendentemente dalla
forma) lungo un tratto terminale dendritica 25 um.
labirinto acquatico di Morris
I topi sono stati collocati in una piscina bianco circolare (diametro 145 centimetri) riempito con
acqua 23 ° C ± 2 resi opachi con l'aggiunta di colore bianco acrilico atossico (Giotto). Il protocollo
consisteva in una fase di prova 8-Cue (1 giorno) e una fase posto 20-trial seguita da una fase Sonda
1-prova (4 giorni). Durante la fase Cue, una piattaforma visibile (diametro di 5 cm) è emerso 0,5 cm
al di sopra del livello dell'acqua e sormontata da piccoli tappi in plastica rossi (per renderlo più
evidente) è stato collocato nel centro della piscina. Durante la fase Place, la piattaforma di fuga
(diametro di 5 cm) sommerso 0,5 cm sotto il livello dell'acqua è stato posto al centro del nordovest quadrante 20 cm dalle pareti laterali. La piscina è stato posizionato in una stanza illuminata
uniformemente con vari stimoli esterni e sormontato da una telecamera che trasmesso segnali ad
un monitor e l'analizzatore di immagini (EthoVision XT, Noldus). La fase Cue era composto da due
sessioni consecutive (quattro 60 s-prove ciascuno, inter-trial: 20 min; e inter-sessione intervallo: 2
h). La fase posto era composto da quattro sessioni giornaliere (cinque 60 s-prove al giorno; intertrial intervallo: 20 min). Durante gli intervalli tra le prove ed inter-sessione, i topi sono stati
collocati nelle loro gabbie a casa. All'inizio di ogni prova, i topi sono stati messi in piscina presso
diversi quadranti per ogni soggetto e poi recuperate dopo aver trovato la piattaforma visibile o
nascosto. I topi che non è riuscito a trovare la piattaforma entro 60 s, sono stati aiutati dallo
sperimentatore. Quando i topi scalato la piattaforma, sono stati autorizzati a rimanere su di esso
per 20 s. Per valutare la memoria spaziale, 1 h dopo l'ultima prova di topi di fase Luogo sono stati
sottoposti alla fase di sonda, in cui è stata rimossa la piattaforma e il topo (rilasciato dal lato
opposto della piscina) sono stati autorizzati a cercarlo per 30 s . L'analisi dei dati sono state
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effettuate utilizzando i seguenti parametri: tempo impiegato per raggiungere la piattaforma
durante le fasi di Cue e Place; percentuale della distanza swum nel quadrante destinazione
(precedentemente, contenente la piattaforma) durante la fase di sonda.
analisi statistica
CPP: dati sono stati analizzati mediante analisi a due vie della varianza (ANOVA) con il genotipo
(Tg2576 contro WT) e camere (abbinato contro accoppiato) come fattori indipendenti. Dati CPP per
il trattamento selegilina sono stati analizzati mediante ANOVA a due vie per il trattamento (sham
contro sel) e camere (abbinato contro accoppiato). Il consumo di cioccolato dopo selegilina è stata
analizzata con ANOVA. Post hoc confronti sono stati eseguiti con il software STATISTICA (v8.0,
StatSoft, Inc., 2007) utilizzando il test HSD di Tukey.
Microdialisi: dati sono stati analizzati con unidirezionali misure ripetute ANOVA con genotipo
(Tg2576 contro WT) come tra i soggetti factor e tempo (20 min blocchi, 3 livelli) come fattore entro
soggetti. dati di microdialisi in topi Tg2576 seguenti trattamento selegilina sono stati analizzati con
unidirezionali misure ripetute ANOVA per il trattamento (Tg sham contro Tg sel) e tempo (20 min
blocchi, 3 livelli).
LTP: i dati per subcronica L -dopa e selegilina trattamento sono stati analizzati mediante due vie
ANOVA per il genotipo (Tg2576 contro WT) e trattamento (sham vs farmaco). Dati LTP per l'effetto
della somministrazione bagno di L -dopa e agonisti del recettore DA sul topi Tg2576 stati analizzati
con ANOVA. In entrambi i casi post hoc confronti sono stati valutati con il test di Bonferroni.
Tutti gli altri dati sono stati analizzati con due code associato o di Student spaiato t -test, come
descritto in Figura legende. I dati sono presentati come media ± SEM eccezione di CPP, tutte le
analisi statistica è stata effettuata utilizzando GraphPad Prism (v5.00). Valori di P ≤0.05 stati
considerati statisticamente significativa (mostrato nelle figure da * P ≤0.05, ** P ≤0.01 e *** P
≤0.001).
Misura di prova
Il numero di campioni in ogni gruppo per immunoistochimica, immunofluorescenza, stereologica,
microdialisi, elettrofisiologico, valutazioni biochimici, comportamentali e morfologici sono stati
determinati sulla base di studi pubblicati. Gli interventi chirurgici sperimentatore eseguire era
noto per colpire i bersagli utilizzati (NAc shell, striato o ippocampo).
La randomizzazione
Tutti randomizzazione è stata effettuata da uno sperimentatore. Animali utilizzati in tutti gli
esperimenti sono stati selezionati in modo casuale. Per CPP, gli animali sono stati anche
controbilanciato tra i gruppi.
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disponibilità dei dati
I dati che supportano i risultati di questo studio sono disponibili presso l'autore corrispondente
(Marcello D'Amelio; [email protected] ) su richiesta ragionevole.
Informazioni aggiuntive
Come citare questo articolo: Nobili, A. et al . La dopamina perdita neuronale contribuisce alla
memoria e disfunzione ricompensa in un modello della malattia di Alzheimer. Nat. Commun. 8 ,
14727 doi: 10.1038 / ncomms14727 (2017).
Nota dell'editore: Springer Natura rimane neutrale per quanto riguarda i reclami giurisdizionali in
mappe e affiliazioni istituzionali pubblicati.
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Ringraziamenti
MDA è stato sostenuto dal Ministero Italiano della Salute (Progetto Giovani Ricercatori Codice
Progetto GR-2011-02.351.457) e l'Associazione Alzheimer (NIRG-11-204.588). Siamo anche grati a
Associazione CMN Sport (ONLUS) per la borsa di studio offerta da PK Ringraziamo Drs Riviello e
Wirz per l'assistenza con la cura degli animali.
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Informazioni sull'autore
Virve Cavallucci
Presente indirizzo: Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica School of Medicine, 00168
Roma, Italia
affiliazioni
Dipartimento di Neuroscienze Sperimentale, IRCCS Fondazione Santa Lucia, 00143 Roma,
Italia
Annalisa Nobili, Emanuele Claudio Latagliata, Maria Teresa Viscomi, Virve Cavallucci, Debora
Cutuli, Giacomo Giacovazzo, Paraskevi Krashia, Francesca Romana Rizzo, Mauro Federici, Paola
De Bartolo, Daniela Aversa, Maria Concetta Dell'Acqua, Alberto Cordella, Laura Petrosini,
Stefano Puglisi-Allegra, Nicola Biagio Mercuri, Roberto Coccurello, Nicola Berretta E Marcello
D'Amelio
Unità di Neuroscienze Molecolare, Dipartimento di Medicina, Università Campus Biomedico-,
00128 Roma, Italia
Annalisa Nobili, Virve Cavallucci, Ramona Marino, Maria Concetta Dell'Acqua E Marcello
D'Amelio
Istituto di Biologia Cellulare e Neurobiologia (IBCN), Consiglio Nazionale delle Ricerche
(CNR), 00143 Roma, Italia
Giacomo Giacovazzo & Roberto Coccurello
Dipartimento di Systems Medicine, Università di Roma 'Tor Vergata', 00133 Roma, Italia
Paraskevi Krashia, Francesca Romana Rizzo, Daniela Aversa, Alberto Cordella & Nicola Biagio
Mercuri
Laboratorio di Neuroscienze e dello sviluppo neurale Plasticità, Dipartimento di Medicina,
Università Campus Biomedico-, 00128 Roma, Italia
Ramona Marino & Flavio Keller
Dipartimento Tecnologie, Comunicazione e Società (TECOS), Università Guglielmo Marconi,
00193 Roma, Italia
Paola De Bartolo
Dipartimento di Psicologia, Università Sapienza, 00185 Roma, Italia
Marco Sancandi, Laura Petrosini & Stefano Puglisi-Allegra
contributi
MDA ideato e progettato lo studio, supervisionato tutti gli esperimenti. AN, VC e MCDA progettati
ed eseguiti gli esperimenti di biologia molecolare. MTV, AN e RM eseguito il conteggio delle cellule
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e analisi immunoistochimica. FRR e MF effettuati ed analizzati esperimenti amperometrici. DC,
PDB e LP effettuati ed analizzati esperimenti CFC e MWM e conteggi della colonna vertebrale
dendritiche. SPA, ECL e MS effettuati ed analizzati esperimenti di microdialisi. GG eseguito e RC
progettato, analizzato e interpretato esperimenti CPP. NB, DA, CA e PK eseguite registrazioni sul
campo. NB e NBM supervisionato gli esperimenti di elettrofisiologia. MDA, FK, PK, RC, NB e AN ha
scritto il manoscritto. Tutti gli autori hanno discusso i risultati e commentato il manoscritto.
Interessi conflittuali
Gli autori dichiarano alcun interesse finanziario in competizione.
autore Corrispondente
Corrispondenza a Marcello D'Amelio .
Informazione supplementare
i file PDF
1.
Informazione supplementare
figure complementari
2.
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