tecniche di lab risposta cellulare

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IMMUNOTERAPIA:
TECNICHE DI LABORATORIO
Eleonora Gallerani
25 Febbraio 2013
Sviluppo di un vaccino
FUNZIONA?
INDUCE UNA RISPOSTA IMMUNE?
SE SI, DI CHE TIPO?
1
Pianificazione dell’esperimento
• Che razza/ceppo di topi scegliere?
• In base
a dati di letteratura
Balb/c
C57/BL6
• In base al tipo di MHC (Kb o Kd)
DBA
• Che sesso scegliere?
FVB
Nude
• ♂: problemi di gerarchia
• ♀: più tranquille
più elementi nella stessa gabbia
possibilità di lavaggi vaginali
Studi preclinici sull’animale
2
Pianificazione dell’esperimento
• Quanti topi utilizzare?
• Fino a 7 topi/gabbia
• Come distinguere tra loro gli animali?
• Orecchino numerato (999 topi)
• Foro nelle orecchie/zampe (99 topi)
• Colorazione con acido picrico
5=1+4
6=2+4
7=3+4
8=1+2
9=2+3
20
10
1
40
2
4
3
30
DORSO
Studi preclinici sull’animale
Che tipo di risposta immunitaria
posso studiare?
RISPOSTA UMORALE
RISPOSTA CELLULARE
• Sangue ⇒ siero
• Sangue (⇒ non fattibile)
• Muco ⇒ lavaggi mucose
• Milza ⇒ splenociti
• Linfonodi
Esempio della TimeTime-line di un esperimento in vivo
-7
0
14
7
Immunogeno/vaccino
Stabulazione
Immunogeno/vaccino
28
Sacrificio
Bleeding
Immunogeno/vaccino
Studi preclinici sull’animale
Risposta immune
L’insieme dei meccanismi innescati dalle cellule
del sistema immunitario volti alla difesa ed
eliminazione di organismi patogeni (batteri,
virus, parassiti,…)
RISPOSTA
IMMUNITARIA
INNATA
SPECIFICA
• La prima ad intervenire
• Manca di specificità
• Non induce memoria immunitaria
• A livello di epiteli, complemento,
macrofagi , NK
• Unica presente negli invertebrati
• Antigene specifica
• Induce memoria immunitaria
• A livello di Linfociti T e B
• Caratteristica dei vertebrati
CELLULOMEDIATA
• CTL
• Linfociti Thelper
UMORALE
• Anticorpi secreti
dai Linfociti B
Metodiche
• Citotossicità
– Metodica radioattiva
– Metodica fluorimetrica
• Elispot
• Facs
CITOTOSSICITA’
EFFETTORE
TARGET
CITOTOSSICITA’ – metodica radioattiva
enzimi litici
51Cr
lavaggio
1h a 37°C
cellule
target
cellule
target
marcate
CTL
effettore
Rilascio di cromo
in soluzione
target
TOPI
TOPI
VACCINATI CONTROLLO
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112
campione A
spontaneo B
massimo
C
D
E
F
G
H
spontaneo
massimo
campione
60
50
% lisi specifica
40
30
20
γcounter
10
cpm campione – cpm spontaneo
% lisi specifica =
cpm massimo – cpm spontaneo
x 100
0
vaccinati
controllo
topi
CITOTOSSICITA’ – metodica fluorimetrica
BATDA
enzimi litici
lavaggio
TDA
target
CTL
effettore
target
TOPI
TOPI
VACCINATI CONTROLLO
2-4 ore
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112
campione A
spontaneo B
massimo
C
D
E
F
G
H
20µl supernatante
PIASTRA 1
PIASTRA 2
+ 200 µl EUROPIO
15 minuti RT
LETTURA
FLUORESCENZA
Metodica
Vantaggi
Svantaggi
Radioattiva
Fluorimetrica
Tempo: 1 giornata di lavoro
Tempo: 1 giornata di lavoro
Buona standardizzazione
Maggiore sicurezza dei materiali
Dispositivi di protezione
Smaltimento rifiuto radioattivo
ELISPOT
DAY -1
DAY 0
DAY 1
splenociti
+ Peptide
Coating
granzimi
pozzetto
Campione
di interesse
Anticorpo
anti-granzimi
+ biotina
Controllo
positivo
Streptavidina
+ Perossidasi
Controllo
negativo
Substrato AEC
splenociti
+ ConA
Anticorpo
anti-granzimi
splenociti
+ terreno
sterilità
sterilità
TOPI
TOPI
VACCINATI CONTROLLO
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112
A
ConA
Neg
B
Campione C
D
E
F
G
H
(n° spot campione – n° spot negativo) x … = Spot Forming Unit
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