tecniche di lab risposta cellulare
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IMMUNOTERAPIA: TECNICHE DI LABORATORIO Eleonora Gallerani 25 Febbraio 2013 Sviluppo di un vaccino FUNZIONA? INDUCE UNA RISPOSTA IMMUNE? SE SI, DI CHE TIPO? 1 Pianificazione dell’esperimento • Che razza/ceppo di topi scegliere? • In base a dati di letteratura Balb/c C57/BL6 • In base al tipo di MHC (Kb o Kd) DBA • Che sesso scegliere? FVB Nude • ♂: problemi di gerarchia • ♀: più tranquille più elementi nella stessa gabbia possibilità di lavaggi vaginali Studi preclinici sull’animale 2 Pianificazione dell’esperimento • Quanti topi utilizzare? • Fino a 7 topi/gabbia • Come distinguere tra loro gli animali? • Orecchino numerato (999 topi) • Foro nelle orecchie/zampe (99 topi) • Colorazione con acido picrico 5=1+4 6=2+4 7=3+4 8=1+2 9=2+3 20 10 1 40 2 4 3 30 DORSO Studi preclinici sull’animale Che tipo di risposta immunitaria posso studiare? RISPOSTA UMORALE RISPOSTA CELLULARE • Sangue ⇒ siero • Sangue (⇒ non fattibile) • Muco ⇒ lavaggi mucose • Milza ⇒ splenociti • Linfonodi Esempio della TimeTime-line di un esperimento in vivo -7 0 14 7 Immunogeno/vaccino Stabulazione Immunogeno/vaccino 28 Sacrificio Bleeding Immunogeno/vaccino Studi preclinici sull’animale Risposta immune L’insieme dei meccanismi innescati dalle cellule del sistema immunitario volti alla difesa ed eliminazione di organismi patogeni (batteri, virus, parassiti,…) RISPOSTA IMMUNITARIA INNATA SPECIFICA • La prima ad intervenire • Manca di specificità • Non induce memoria immunitaria • A livello di epiteli, complemento, macrofagi , NK • Unica presente negli invertebrati • Antigene specifica • Induce memoria immunitaria • A livello di Linfociti T e B • Caratteristica dei vertebrati CELLULOMEDIATA • CTL • Linfociti Thelper UMORALE • Anticorpi secreti dai Linfociti B Metodiche • Citotossicità – Metodica radioattiva – Metodica fluorimetrica • Elispot • Facs CITOTOSSICITA’ EFFETTORE TARGET CITOTOSSICITA’ – metodica radioattiva enzimi litici 51Cr lavaggio 1h a 37°C cellule target cellule target marcate CTL effettore Rilascio di cromo in soluzione target TOPI TOPI VACCINATI CONTROLLO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 campione A spontaneo B massimo C D E F G H spontaneo massimo campione 60 50 % lisi specifica 40 30 20 γcounter 10 cpm campione – cpm spontaneo % lisi specifica = cpm massimo – cpm spontaneo x 100 0 vaccinati controllo topi CITOTOSSICITA’ – metodica fluorimetrica BATDA enzimi litici lavaggio TDA target CTL effettore target TOPI TOPI VACCINATI CONTROLLO 2-4 ore 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 campione A spontaneo B massimo C D E F G H 20µl supernatante PIASTRA 1 PIASTRA 2 + 200 µl EUROPIO 15 minuti RT LETTURA FLUORESCENZA Metodica Vantaggi Svantaggi Radioattiva Fluorimetrica Tempo: 1 giornata di lavoro Tempo: 1 giornata di lavoro Buona standardizzazione Maggiore sicurezza dei materiali Dispositivi di protezione Smaltimento rifiuto radioattivo ELISPOT DAY -1 DAY 0 DAY 1 splenociti + Peptide Coating granzimi pozzetto Campione di interesse Anticorpo anti-granzimi + biotina Controllo positivo Streptavidina + Perossidasi Controllo negativo Substrato AEC splenociti + ConA Anticorpo anti-granzimi splenociti + terreno sterilità sterilità TOPI TOPI VACCINATI CONTROLLO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 A ConA Neg B Campione C D E F G H (n° spot campione – n° spot negativo) x … = Spot Forming Unit
