enzima

FUNZIONI BIOLOGICHE DELLE
PROTEINE
ENZIMI
PROTEINE DI TRASPORTO
PROTEINE DI RISERVA
PROTEINE CONTRATTILI
PROTEINE DI DIFESA
PROTEINE REGOLATRICI
PROTEINE STRUTTURALI
ENERGIA LIBERA (G)
ΔG = ΔH - TΔS
Variazioni di energia libera di un sistema
che sta subendo una trasformazione a
pressione e temperatura costanti
ΔH: variazione di entalpia
ΔS: variazione di entropia
Il ΔG può essere usato per stabilire se un processo può
avvenire spontaneamente
(ΔG negativo)
ΔG=0 equilibrio
Il ΔG dipende dalla differenza di energia libera tra prodotti
e reagenti. E’ indipendente dalla via seguita dalla
trasformazione.
Il ΔG non indica a che velocità avviene la reazione
ΔG° variazioni di Energia Libera Standard
(in cui i reagenti sono 1M)
ΔG°’ variazioni di Energia Libera Standard a pH7
Le BIOMOLECOLE sono stabili a pH 7, a
37°C, in ambiente acquoso
Difficoltà di una reazione:
•Formazione di intermedi instabili
•Collisione tra molecole con un preciso
orientamento
Un ENZIMA supera questi problemi
generando un ambiente specifico in cui una
data reazione avviene
Le reazioni avvengono in una
tasca detta SITO ATTIVO
SITO ATTIVO
• Contiene una regione di specificità che
permette il legame del substrato
• Contiene un sito di reazione in cui il
substrato è trasformato
ENZIMI
•
•
•
•
Sono nella maggior parte proteine
Sono i catalizzatori delle reazioni biologiche
Hanno elevata specificità
Operano in soluzione acquosa in condizioni
blande di temperatura e pH
• La loro attività dipende dall’integrità della
conformazione proteica nativa
• La loro attività può essere regolata
(fosforilazione, glicosilazione, ecc…)
COFATTORI
Alcuni enzimi per essere attivi necessitano
di cofattori
I cofattori possone essere:
• Ioni inorganici (Fe2+; Mg2+; Mn2+; Zn2+)
• Molecole organiche o metallo-organiche
dette coenzimi
Se lo ione inorganico o il coenzima sono
legati covalentemente all’enzima viene
detto “gruppo prostetico”
ENZIMI E SPECIFICITA’
Catalizzano in genere UNA SOLA reazione
chimica perché hanno un sito specifico a
cui si lega il substrato
Esempio: ENZIMI PROTEOLITICI
Alcuni ENZIMI PROTEOLITICI catalizzano
reazioni diverse ma correlate
TRIPSINA
TROMBINA
Il ΔG°’ tra S e P è negativo. L’equilibrio favorisce la
formazione di P. L’enzima non interviene su questo
equilibrio. La velocità della reazione non dipende però dal
ΔG°’ ma dalla barriera energetica che corrisponde
all’energia necessaria ad allineare i gruppi reagenti, a
riorganizzare legami affinché la reazione possa procedere.
Questo punto della reazione è detto STATO DI
TRANSIZIONE
ΔG‡ = ENERGIA DI ATTIVAZIONE
Un enzima aumenta la velocità di reazione abbassando l’energia di
attivazione ΔG‡.
L’enzima non viene consumato durante il processo e il punto di
equilibrio rimane inalterato.
La reazione raggiunge l’equilibrio più velocemente
Gli equilibri di reazioni sono collegati al ΔG°’, mentre la velocità al ΔG‡.
L’energia che si libera dalle interazioni
enzima-substrato viene detta ENERGIA DI
LEGAME.
L’energia di legame è la fonte principale di
energia
libera
usata
dall’enzima
per
abbassare l’energia di attivazione della
reazione.
L’energia di legame viene utilizzata per
superare le barriere fisiche e
termodinamiche di una reazione:
1. RIDUZIONE ENTROPICA
L’energia di legame mantiene i substrati nella
posizione corretta
2. DESOLVATAZIONE
La formazione di legami tra E e S portano alla
rimozione di H2O del substrato
3. STIRAMENTO O DISTORSIONE DEL
SUBSTRATO
La somma delle interazioni deboli tra E e S
compensano le modifiche termodinamicamente
sfavorite del substrato che nello stato di
transizione può subire distorsioni sia elettroniche
che strutturali
4. ADATTAMENTO DELL’ENZIMA
L’enzima può subire cambi conformazionali,
adattandosi al substrato. La nuova conformazione
esalta le proprietà catalitiche dell’enzima
IL SITO ATTIVO:
• Promuove la prossimità dei reagenti
• Destabilizza lo stato fondamentale
(stabile) con attivazione di alcuni gruppi
che diventano più reattivi
• Stabilizza lo stato di transizione evitando
la formazione di prodotti secondari
TIPI DI REAZIONI CATALIZZATE:
•
•
•
•
Ossido-riduzioni
Addizione/sottrazione di gruppi
Idrolisi
Decarbossilazioni
Per poter catalizzare una reazione un enzima deve
essere complementare allo stato di transizione
1. Nel complesso enzima-substrato si
formano alcune interazioni deboli che
rappresentano la forza trainante della
catalisi
2. Nel complesso enzima-substrato nello
stato di transizione si formano tutte le
interazioni possibile che contribuiscono
alla catalisi
Modello ESOCHINASI:
variazione conformazionale indotta dal
legame con il substrato (glucosio)
CINETICA ENZIMATICA
1
V0
=
Km
Vmax
⋅
1
[S]
+
1
1
y = mx + q
Vmax
Pendenza =
V0
1
Vmax
1
Km
1
[S]
Km
Vmax
• Valori di Km di alcuni enzimi
Enzima
Substrato
Km (mM)
Catalasi
H2O2
25
Esochinasi (cervello)
ATP
D-Glucosio
D-Fruttosio
0,4
0,05
1,5
Anidrasi carbonica
HCO3-
9
Chimotripsina
Gliciltirosinilglicina
N-Benzoiltirosinamide
108
2,5
β-Galattosidasi
D-Lattosio
4,0
Treonina deidradasi
L-Treonina
5,0
• Numero di turnover di alcuni enzimi
Enzima
Substrato
Kcat
Catalasi
H2O2
40’000’000
Anidrasi carbonica
HCO3-
400’000
Acetilcolinesterasi
Acetilcolina
140’000
β-Lattamasi
Benzilpenicillina
2’000
Fumarasi
Fumarato
800
Proteina RecA (ATPasi)
ATP
0,4
Inibizione enzimatica
GLI ENZIMI POSSONO ESSERE INIBITI
Gli INIBITORI enzimatici possono essere
• REVERSIBILI
• IRREVERSIBILI
Hanno importanti applicazioni in campo
farmaceutico
Gli inibitori reversibili possono essere
competitivi e non competitivi
INIBIZIONE
COMPETITIVA
EFFETTO DELL’INIBIZIONE COMPETITIVA
SULLA CINETICA ENZIMATICA
INIBIZIONE
NON COMPETITIVA
EFFETTO DELL’INIBIZIONE NON
COMPETITIVA SULLA CINETICA ENZIMATICA
REGOLAZIONE
DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA
ENZIMI REGOLATORI
1. ENZIMI ALLOSTERICI
Questi enzimi esistono in più di una forma. La
molecola regolatrice può cambiare la conformazione
dell’enzima. Questo gruppo di enzimi può essere
regolato finemente.
2. ENZIMI REGOLATI DA MODIFICAZIONI
COVALENTI REVERSIBILI
Questo gruppi di enzimi o è attivo o inattivo (tutto o
nulla)
Tutte e due le classi di enzimi regolatori hanno più subunità
e i siti regolatori e siti catalitici sono su subunità diverse
ENZIMI Allosterici
• Sono un gruppo di enzimi
che non seguono a cinetica
di Michaelis-Menten
• La loro attività è aumentata
o diminuita da piccole
molecole o cofattori
• Regolano importanti vie
metaboliche
A
E1
B
E2
C
E3
D
E4
E
INTERAZIONI TRA SUBUNITA’ DI UN
ENZIMA ALLOSTERICO
CURVA DI SATURAZIONE DA SUBSTRATO DI
UN ENZIMA ALLOSTERICO
ENZIMI REGOLATI DA
MODIFICAZIONI COVALENTI
• REGOLAZIONE ALLOSTERICA
Controlla enzimi che lavorano in maniera
continua.
• REGOLAZIONE COVALENTE
Controlla enzimi che …o funzionano …o sono
spenti. Alcune modificazioni sono reversibili,
altre no. Spesso è sotto il controllo ormonale
fine
REGOLAZIONE DI ACTasi
• Lega i substrati in modo cooperativo
(effettori omotropici positivi)
• CTP inibisce l’enzima
(effettore eterotropico negativo)
• ATP è un attivatore allosterico
L’ATP si lega nello stesso sito del CTP
Elevato ATP: la cellula ha energia sufficiente per
dividersi. Eccesso di purine
ASPARTATO
TRANSCARBAMMILASI (ACTasi)
Enzima allosterico che catalizza la prima
tappa nella biosintesi delle pirimidine
ENZIMI ALLOSTERICI
ETEROTROPICI E CINETICA
1. Un modulatore può
aumentare o diminuire
la K0.5
2. Un modulatore può
aumentare o diminuire
la Vmax
ORGANIZZAZIONE DELL’ENZIMA
E’ un eteromultimero del tipo α6β6. Questo enzima
può
essere
dissociato
dal
paraidrossimercurilbenzoato che abolisce le proprietà
allosteriche dell’enzima
ACTasi (α6β6)
Catena C
Ogni subunità è
costituita da 3 catene
C; possiede 3 siti per
aspartato e 3 siti per
carbamilfosfato.
Ogni singola catena è
inattiva ⇒ ognuna
contribuisce ai siti
2 subunità C
+ pHMB
Catena R
3 subunità R
Ogni subunità R puö
legare 2 ATP o 2 CTP
e contiene uno Zn2+ la
cui rimozione fa
perdere l’attivitä
regolatoria.
MODIFICAZIONI
COVALENTI
Gli enzimi possono utilizzare diversi tipi di
catalisi per facilitare la rottura o la
formazione di legami.
I più caratterizzati sono:
1.CATALISI ACIDO-BASICA
2.CATALISI COVALENTE
3.CATALISI DA IONI METALLICI, legati a
gruppi prostetici tipo EME o con legami di
coordinazione ad aminoacidi
PROTEASI A SERINA
• TRIPSINA
• CHIMOTRIPSINA
• ELASTASI
• TROMBINA
• PLASMINA
Enzimi digestivi
sintetizzati nel pancreas
e secreti come proenzimi
nel tratto digerente
Deriva dal plasminogeno
Rompe i polimeri di
fibrina dei coaguli
PROENZIMA O ZIMOGENO
taglio
(tripsinogeno
chimotripsinogeno
elastasi)
ENZIMA ATTIVO
ACETILCOLINESTERASI
Non è una proteasi ma è una serina
esterasi che degrada l’acetilcolina a livello
dello spazio sinaptico.
Stesso meccanismo d’azione.
SPECIFICITA’ DI TAGLIO
• TRIPSINA ⇒ ARG, LYS
• CHIMOTRIPSINA ⇒ PHE, TYR
• ELASTASI ⇒ piccoli residui neutri
Sono enzimi strutturalmente simili:
• residui idrofobici e aromatici all’interno;
• residui carichi sono esposti sulla superficie
Tre residui polari formano la TRIADE CATALITICA
in corrispondenza del sito attivo:
HIS57, ASP102, SER195
CHIMOTRIPSINA
E’ una proteasi specifica per legami
peptidici adiacenti a residui aminoacidici
aromatici o idrofobici
La reazione enzimatica illustra il principio
della
stabilizzazione
dello
stato
di
transizione da parte dell’enzima ed è un
esempio di catalisi acido-basica e di catalisi
covalente
MECCANISMO DI CATALISI
DELLA CHIMOTRIPSINA
MECCANISMO DI CATALISI
DELLA CHIMOTRIPSINA
1.
Posizionamento del substrato
2.
Attacco nucleofilo della serina 195. L’istidina 57
agisce come base, si ha la formazione di un
ossianione
3.
Rottura del legame peptidico e formazione di un acilenzima. L’istidina 57 cede il protone (catalisi acida)
4.
L’istidina 57 prende un protone dall’H2O (catalisi
basica). Intermedio tetraedrico.
5.
L’istidina 57 cede un protone alla serina 195. Si
ottiene enzima libero e prodotto
1. POSIZINAMENTO DEL SUBSTRATO
NEL SITO ATTIVO
• Legami idrogeno con serina
195 e glicina 193 (sito attivo)
• Inserimento dell’anello
aromatico nell’incavo
idrofobico (adiacente al sito
attivo)
2. FORMAZIONE DI UN INTERMEDIO
TETRAEDRICO PER ATTACCO NUCLEOFILO
DELL’OH DELLA SERINA AL C CARBONILICO
DEL PEPTIDE
• L’-OH della serina 195
diventa reattivo (nucleofilo)
• L’isitidina 57 può accettare
un protone della serina 195.
L’aspartato 102 stabilizza
l’istidina carica, che agisce
come base.
L’ossianione è
stabilizzato da legami
idrogeno con
Serina 195
Glicina 193
OSSIANIONE: INTERMEDIO
TETRAEDRICO CARICO
ROTTURA
LEGAME
PEPTIDICO
ACIL-ENZIMA
DEACILAZIONE CON INTERVENTO DI UNA
MOLECOLA DI ACQUA
La rete Asp 102 e His 57
strappa in protone all’acqua
L’OH- attacca immediatamente
il C carbossilico del gruppo
acilico legato alla serina 195.
Intermedio tetraedrico
temporaneo.
L’istidina 57 dona poi un protone
alla serina 195 che rilascia il
substrato modificato
CATALISI DA IONI METALLICI
Il metallo dell’enzima può fare legami ionici
con il substrato
I metalli possono anche mediare reazioni di
ossido-riduzione variando reversibilmente il
loro stato di ossidazione
CARBOSSIPEPTIDASI A:
un metallo enzima
CINETICA ENZIMATICA
• La concentrazione del substrato
modifica la velocità di reazione.
Per semplicità si studia la velocità
iniziale V0 in condizioni in cui [S]>>[E]
E+S
K1
K-1
ES
K2
K-2
E+P
• Quando si raggiunge Vmax tutto
l’enzima è saturato e si trova nella
forma ES. Aggiunte di substrato non
modificano la Vmax
• A basse concentrazioni si S, l’enzima si trova nella forma libera
E. Aumentando la [S] aumenta la forma ES e la V0
E+S
K1
K-1
ES
K2
K-2
E+P
La relazione tra concentrazione del substrato e
velocità della reazione enzimatica può essere
espressa in modo quantitativo dell’equazione
di MICHAELIS-MENTENV [S]
V0 =
Km =
K2 + K-1
K1
max
Km + [S]
TRASFORMAZIONE DELL’EQUAZIONE DI
MICHAELIS-MENTEN
Facendo il reciproco di entrambi i termini dell’equazione
Vmax[S]
V0 =
Km + [S]
1
V0
1
V0
=
=
Km + [S]
1
Vmax[S]
V0
Km
Vmax
⋅
1
[S]
+
1
Vmax
=
Km
Vmax[S]
+
[S]
Vmax[S]
y = mx + q
K2 + K-1
Km =
K1
K2 è la costante che limita la velocità.
Se K2 << K-1
K-1
Km =
K1
che rappresenta la costante di dissociazione del
complesso ES. Solo in queste condizioni Km
rappresenta l’affinità dell’enzima per il substrato.
Kcat
Le reazioni enzimatiche possono avvenire a 2 o più tappe. Kcat
descrive la tappa che limita la velocità di una reazione
enzimatica in condizioni di saturazione.
Kcat = K2
reazione a 2 tappe
Kcat = K3
reazione a 3 tappe
Se le tappe limitanti sono più di una Kcat diventa una funzione
complessa contenente le costanti di velocità delle varie tappe
della reazione
Kcat è una costante espressa in S-1 e viene detta numero di
turnover (molecole di substrato convertite in prodotto nell’unità
di tempo da una singola molecola di enzima)
Il modo migliore per confrontare l’efficienza
catalitica di un enzima per diversi substrati
o di enzimi diversi è di paragonare il
rapporto
Kcat
Km
detto COSTANTE DI SPECIFICITA’