Il progetto Sma – Relazione del gruppo di ricerca 2009

DIPARTIMENTO DI SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMEDICHE
Istituto di Genetica
Address:
UNIVERSITA’
DEGLI STUDI
DI UDINE
AGGIORNAMENTO
Tel:
Fax:
DEL
Istituto di Genetica
DSTB - Università degli Studi di Udine
P.le Kolbe,1 - 33100 Udine - ITALIA
+39-0432-494370
+39-0432-494379
PROGETTO
BIOTECNOLOGICO
RIGUARDANTE
ASPETTI DIAGNOSTICI E PROGNOSTICI NELL’AMBITO DELL’ATROFIA
MUSCOLARE SPINALE
Il progetto di ricerca di cui sopra consente attualmente di poter offrire ai soggetti appartenenti a
famiglie SMA, le seguenti valutazioni diagnostiche / prognostiche:
1.
Diagnosi molecolare di affetto SMA, mediante ricerca di delezione dell’esone n. 7 e/o
dell’esone n. 8 di entrambe le copie del gene SMN1.
2.
Diagnosi molecolare di portatore sano di delezione dell’ esone n. 7 e/o dell’esone n. 8
del gene SMN1.
3.
Valutazione del numero di copie del gene SMN2, modulatore del fenotipo patologico
(Wirth et al 2006) .
4.
Valutazione quantitativa dell’espressione totale dei geni SMN e del messaggero
produttore di proteina full-length , ossia intera che include l’esone n. 7 (Lorson and
Androphy, 2000) .
5.
Valutazione dei livelli di espressione della plastina 3 (PLS3), a possibile ruolo
neuroprotettivo, per i soggetti asintomatici con delezione di entrambe le copie del gene
SMN1 (Oprea et al. 2008) .
Nessuno dei tests molecolari di cui sopra viene effettuato senza che il soggetto richiedente
abbia ricevuto una appropriata consulenza genetica pre-test, ne abbia compreso le implicazioni
ed abbia elaborato un autonomo consenso all’esecuzione degli stessi.
Consulenza genetica pre e post-test
In accordo con lo statuto della “European Convention on Human Rights and Biomedicine”
(Council of Europe, 1997) la consulenza genetica viene effettuata come parte integrante
dell’intero processo di test genetico. La consulenza pre-test è volta a valutare e a comunicare
all’individuo e/o ai familiari i meccanismi ereditari della patologia ed il rischio di ricorrenza
della stessa in base al grado di parentela con l’affetto. Molti pazienti affetti SMA sono in età
pediatrica ed ai genitori degli stessi viene offerta la possibilità di un follow-up post-test da
parte dell’unità di consulenza genetica attraverso l’assistenza di uno psicologo.
Per i soggetti appartenenti a famiglie SMA, a rischio quindi
di essere portatori sani di
mutazione, i tests molecolari vengono effettuati solo dopo aver accertato:
-
la ricezione di una informazione corretta da parte del consultando
-
la volontà autonoma di procedere all’indagine dopo aver valutato le implicazioni
personali della stessa
-
la possibilità di un follow-up post-test per l’elaborazione del risultato dello stesso
non sempre scontata.
Metodiche di indagine molecolare messe a punto nell’ambito del progetto
Multiplex Real-time PCR
Consente di valutare sia lo stato di affetto SMA che lo stato di portatore sano di delezione
attraverso valutazione quantitativa dell’esone n. 7 del gene SMN1.
La messa a punto di questo metodo è stata oggetto di pubblicazione (Passon et. al. 2009)
di cui copia è allegata alla presente.
Consente le valutazioni di espressione genica di cui ai punti 4 e 5.
MLPA
Consente di valutare sia lo stato di affetto SMA che lo stato di portatore sano di delezione
attraverso una visualizzazione completa e contemporanea di tutti i geni presenti al locus SMA:
-
numero totali dei geni SMN (1+2)
-
numero di copie dell’esone n. 7 e dell’esone n. 8 del gene SMN1
-
numero di copie dell’esone n. 7 e dell’esone n. 8 del gene modulatore SMN2.
La metodica MLPA messa a punto nell’ambito del progetto è stata oggetto di 2 comunicazioni
a congressi (vedi allegati 1 e 2) e argomento di prossima pubblicazione.
Incremento del numero di indagini molecolari effettuate
Nel periodo 2001-2008 sono state effettuate 45 diagnosi di affetto SMA di cui 19 sono risultate
positive per delezione di entrambe le copie del gene SMN1.
Nello stesso periodo di tempo sono state effettuate 136 analisi molecolari di portatore sano di
delezione del gene SMN1. Di queste indagini molecolari, 58 sono state effettuate nel solo anno
2008. Quindi, l’innovazione tecnologica apportata nell’ambito delle problematiche riguardanti
la SMA ha consentito un deciso incremento del numero di soggetti analizzati per la condizione
di portatore sano di mutazione, a cui poter offrire una risposta diagnostica (vedi istogramma
sotto riportato).
Inoltre, i tempi di attesa per l’utenza si sono grandemente ridotti.
SOGGETTI ANALIZZATI
VARIAZIONE ANNUALE DELLE ANALISI DI
PORTATORI SMA EFFETTUATE
70
60
50
40
30
20
10
0
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
ANNI
.
Tipologia dei soggetti che hanno usufruito delle metodiche innovative messe a punto
nell’ambito del progetto
Dei 136 individui che hanno richiesto di sottoporsi al test molecolare per accertare l’eventuale
condizione di portatore SMA:
•
21 sono genitori di soggetti affetti SMA, quindi obbligati portatori di delezione del
gene SMN1. Di questi, 19 sono risultati positivi al test molecolare mentre 2 sono
risultatì con un genotipo 2/0, ossia con 2 copie del gene SMN1 sullo stesso cromosoma.
•
38 individui non presentano storia familiare per SMA ma sono stati analizzati per la
valutazione del rischio riproduttivo in quanto coniugi di appartenenti a famiglie SMA.
Uno di questi è risultato portatore di delezione.
Se questi 38 individui vengono considerati come appartenenti alla popolazione
generale, questo risultato porrebbe la frequenza di portatori sani di delezione in
regione pari a 1/38, più alto quindi di quello normalmente attribuito in consulenza
genetica alla popolazione generale (1/50 circa).
•
79 individui presentano una storia familiare per SMA e 25 di questi sono risultati
portatori di delezione, di cui 2, di sesso femminile, pur presentando la delezione di
entrambe le copie del gene SMN1 risultano asintomatici.
Su questa corte di soggetti (familiari di affetti SMA) la frequenza dei portatori
sani di delezione risulta quindi pari a circa 1/3.
Aggiornamento scientifico e ricerca
Oltre all’implemento del numero e della qualità diagnostica, Il perfezionamento biotecnologico
delle metodiche di indagine molecolare, da noi apportato nell’ambito della SMA, ha permesso
nel corso del 2008 l’identificazione di alcuni genotipi particolari:
-
due portatori sani di delezione con genotipo 2/0 (2 copie del gene SMN1 sullo
stesso cromosoma) genitori di affetti SMA. Questa condizione ha imposto uno
studio di segregazione cromosomica nelle due famiglie atto ad identificare o ad
escludere la presenza di un tale genotipo nel DNA dei familiari richiedenti il test di
portatore.
-
2 soggetti di sesso femminile, appartenenti a famiglie SMA che, pur presentando la
delezione di entrambe le copie del gene SMN1, risultano asintomatiche. Queste si
inquadrano in una minoranza di casi, descritti in letteratura, in cui l’assenza
completa di copie del gene SMN1 non si accompagna ad un fenotipo patologico
(Cobben et al. 1995; Helmken et al. 2003; Prior et al. 2004; drzejowska et al. 2008;
Oprea et al. 2008) neppure ad insorgenza tardiva (tipo IV). La particolarità di questi
soggetti asintomatici potrebbe essere dovuta o ad un elevato numero di copie del
gene SMN2 (Prior et al 2004; drzejowska et al. 2008) (rispettivamente 4 e 5 copie di
SMN2 nei soggetti femminili da noi individuati) o ad alti livelli di espressione della
Plastina 3, a cui recentemente è stato assegnato un ruolo neuroprotettivo (Oprea et
al 2008).
L’individuazione dei meccanismi molecolari che rendono asintomatici soggetti con delezione
in omozigosi del gene SMN1 ha delle importanti ricadute per ciò che è un futuro disegno di
interventi terapeutici per gli affetti SMA.
In definitiva, da quanto esposto in questa breve relazione, si evince l’importanza diagnostica e
prognostica, nell’ambito della SMA, di un informazione integrata derivante dallo studio
contemporaneo di tutti i target molecolari menzionati.
Dr. Passon Nadia
Responsabile della Neurogenetica
Dr. Lonigro Renata
Direttore dell’Istituto di Genetica
Prof. Giuseppe Damante
Udine 18-02-2009