IMPIEGO DELLA PCR PER LA RICERCA DEL VIRUS DELLA

Large Animals Review, Anno 4, n. 4, Dicembre 1998
55
IMPIEGO DELLA PCR PER LA RICERCA
DEL VIRUS DELLA BORDER DISEASE
NEL LATTE DI PECORA
ANNAMARIA PRATELLI, VALENTINA VOIGT, MARIA TEMPESTA,
DOMENICO BUONAVOGLIA*, MARIA GLORIA DE PALMA
Dipartimento di Sanità e Benessere degli animali - Sezione Malattie Infettive - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Bari
Strada Provinciale per Casamassima Km. 3 - 70010 Valenzano (BA)
*Istituto Malattie Infettive, Profilassi e Polizia Veterinaria - Facoltà di Medicina Veterinaria - Università di Messina
Viene descritto l’impiego della Polymerase Chain Reaction (PCR) per la ricerca del genoma di Border Disease Virus (BDV)
nel latte di pecora.
Le prove sono state eseguite su latte artificialmente contaminato con cellule di polmone di embrione bovino (PEB) infette
con uno stipite non citopatogeno di BDV.
La coppia di primer 324/326 ha fornito la specifica banda di amplificazione di 287bp nei campioni di latte contenenti un numero di cellule infette pari a 3x104 e 3x103, mentre ha dato esito negativo nei campioni di latte con 3x102 e 3x101 cellule infette.
Summary
The use of Polymerase Chain Reaction tecnique for the detection of Border Disease Virus in milk samples of sheep is
described. The test was performed on milk samples artificially contaminated with bovine embryo lung cells (PEB) infected
with a non cytopathogenic BDV strain.
The primers 324/326, as expected, gave an amplification product of 287bp in milk samples containing 3x104 and 3x103
infected cells. PCR was negative in samples containing 3x102 and 3x101 infected cells.
INTRODUZIONE
Il virus della Diarrea Virale Bovina (BVDV) ed il virus
della Border Disease (BDV) degli ovini appartengono al
genere Pestivirus della famiglia Flaviviridae1. Sono considerati fra i patogeni più importanti di queste specie animali, in quanto possono causare gravi perdite economiche2.
BVDV è in grado di determinare tre diverse forme morbose: la diarrea virale bovina, la malattia delle mucose e
l’infezione transplacentare, che può determinare la nascita
di soggetti con infezione persistente (i.p.)3.
Negli ovini BDV causa sterilità, aborti e nascita di
agnelli disvitali, la maggior parte dei quali presenta alterazioni neurologiche, tremori muscolari, abnorme conformazione corporea ed anomalie del vello4. Anche BDV può
causare infezione transplacentare e, quindi, la nascita di
soggetti con i.p.3.
Entrambi i virus, avendo una spiccata attività immunosoppressiva, possono favorire le infezioni opportunistiche.
Gli animali i.p. rappresentano il serbatoio principale
dell’infezione in allevamento poiché eliminano costantemente, attraverso i secreti e gli escreti, elevate quantità di
virus. Questi animali, apparentemente sani, possono morire nei primi mesi di vita o, nel caso di infezione da BVDV,
sviluppare la malattia delle mucose5.
Poiché l’impatto economico delle infezioni da pestivirus
è molto elevato, i veterinari e gli allevatori sono interessati
ad attuare idonei piani di profilassi in grado di bloccare la
trasmissione dell’infezione (identificazione e allontanamento degli animali i.p., prevenzione delle infezioni transplacentari, vaccinazioni, ecc.).
Un punto cruciale nella fase di impostazione dei piani
di profilassi è rappresentato dalla identificazione degli
animali i.p.
Le metodiche correntemente utilizzate per svelare l’infezione da pestivirus, anche se provviste di un buon livello
di sensibilità, richiedono tempi lunghi per l’esecuzione
soprattutto per quanto riguarda la raccolta dei campioni.
È indispensabile, quindi, utilizzare una tecnica di screening che sia al contempo rapida, specifica e sensibile,
SPECIE MINORI
Riassunto
56
Impiego della PCR per la ricerca del virus della Border Disease nel latte di pecora
soprattutto quando occorre effettuare il test negli allevamenti ovini che, per ragioni legate alla tipologia di allevamento, risultano particolarmente difficili da gestire da un
punto di vista logistico.
Radwan et al.6 hanno impiegato il test PCR per la ricerca del genoma di BVDV nel latte di massa, proponendolo
come test di elezione per lo screening dell’infezione negli
allevamenti bovini.
Nella presente nota vengono riportati i risultati dell’impiego di un test PCR utilizzato per evidenziare il genoma
di BDV nel latte ovino.
COLTURE CELLULARI
Sono state utilizzate cellule secondarie di polmone di
embrione bovino (PEB), gentilmente fornite dalla dott.ssa
Ferrari dell’Istituto Zooprofilattico di Brescia.
Le cellule sono state coltivate in terreno minimo essenziale di Dulbecco (D-MEM), con l’aggiunta del 10% di
siero fetale bovino, privo di anticorpi per pestivirus.
VIRUS
L’infezione delle cellule è stata effettuata con lo stipite
non citopatogeno 90-1M di BDV7. L’evoluzione dell’infezione nelle colture è stata valutata con l’immunofluorescenza indiretta (IFI) utilizzando anticorpi monoclonali
anti pestivirus.
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI DI LATTE
Le prove sono state condotte su campioni di latte di una
bovina i.p. e su latte di pecora sana artificialmente contaminato con cellule infette con BDV. Allo scopo, monostrati di cellule PEB con circa il 90% di infezione in base al
test IFI, sono stati tripsinizzati. Le cellule sono state quindi raccolte in soluzione fisiologica sterile e poi contate
nella camera di Bürker.
Ad aliquote di 1 ml di latte di pecora sono state aggiunte cellule PEB infette in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 3×10 4 /ml, 3×10 3 /ml, 3×10 2 /ml,
3×101/ml. Come controlli, in tutte le prove, sono stati utilizzati: a) uno stipite non citopatogeno BVDV; b) lo stipite
non citopatogeno 90-1M di BDV; c) campioni di latte
bovino esente da BVDV; d) campioni di latte ovino esente
da BDV.
ESTRAZIONE DELL’RNA DALLE CELLULE
Le prove sono state eseguite su aliquote di latte pari ad
1 ml. I campioni di latte della bovina i.p., i campioni di
latte di pecora artificialmente contaminati con cellule
infette e i campioni di latte di controllo di bovina e di
pecora, sono stati centrifugati a 12000 × g per 15’; ciascun pellet è stato sottoposto alla fase di estrazione
dell’RNA virale utilizzando un kit di estrazione dell’RNA
da tessuti (RNeasy Total RNA Kit-Quiagen GmbHGermany).
PCR
La presenza dell’acido nucleico virale è stata valutata
utilizzando la coppia di primer 324/326 (324: 5’-ATG
CCC WTA GTA GGA CTA GCA-3’; 326: 5’-TCA ACT
CCA TGT GCC ATG TAC-3’) in grado di amplificare un
frammento di 287 bp comune a tutti i pestivirus.
La sintesi di cDNA è stata realizzata in un volume di
reazione totale di 20 µl contenente 2,5 µl di RNA, PCR
buffer 10x (KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,3),
MgCl2 25 mM, 1,25 mM di ciascun oligonucleotide trifosfato, RNasi 20 U/µl, RT 50 U/µl, primer 326 0,6 µg/µl.
L’incubazione è stata di 30’ a 37° C con una fase finale di
5’ a 94° C.
La PCR è stata effettuata in un volume totale di reazione di 100 µl contenente PCR buffer 10x, MgCl2 25 mM, 2
mM di ciascun oligonucleotide trifosfato, Amplitaq DNA
polimerasi 5 U, primer 324 1,2 µg/µl. La reazione di
amplificazione è stata effettuata in un DNA Thermal
Cycler (Perkin Elmer, Norwalk, USA) per 34 cicli: denaturazione a 94° C × 1’, allineamento a 56° C × 1’ e polimerizzazione a 72° C × 1’.
Sette ml di amplificato sono stati sottoposti a corsa elettroforetica a 65 volts per 90’ in gel di agarosio al 2,5% e
visualizzati con transilluminatore a UV dopo colorazione
con etidio bromuro.
SENSIBILITÀ DEL TEST PCR
Il sedimento delle cellule somatiche del campione di
latte della bovina i.p. è stato diluito in D-MEM in modo
da ottenere una concentrazione di cellule pari a 3×106/ml.
Successivamente sono state effettuate ulteriori diluizioni in
base 10 in D-MEM.
Ciascuna diluizione è stata utilizzata, in parallelo, per
l’isolamento del virus su cellule PEB e per il test PCR.
Per l’isolamento del virus, 1 ml di ciascuna diluizione in
base 10 è stato inoculato su monostrati di cellule PEB sviluppati in piastre a 24 pozzetti. Dopo 5 giorni di incubazione le cellule sono state congelate e scongelate 3 volte e
con il criolisato è stato effettuato un secondo passaggio su
cellule sviluppate su vetrino. Trascorsi altri 5 giorni di
incubazione la presenza di BVDV nelle cellule è stata valutata con il test IFI.
RISULTATI
L’impiego dei primer 324/326 sui controlli positivi
(BVDV e BDV) ha fornito, come atteso, una banda di
amplificazione pari a 287 bp.
Anche nel latte della bovina i.p. è stata costantemente
evidenziata la banda di amplificazione di 287 bp, mentre il
latte della bovina esente da BVDV ha fornito esito costantemente negativo.
La PCR effettuata sul latte di pecora al quale erano state
aggiunte cellule PEB infette con BDV, ha permesso di evidenziare la banda di amplificazione di 287 bp nelle aliquote di latte contenenti un numero di cellule pari a 3×104 e
3×10 3 (Fig. 1). Le aliquote di latte contenenti 3×10 2 e
3×101 cellule hanno fornito esito costantemente negativo.
Large Animals Review, Anno 4, n. 4, Dicembre 1998
DISCUSSIONE
I risultati dello studio effettuato hanno dimostrato che
la PCR è un valido test per evidenziare il genoma di BDV
nel latte di pecora. In un precedente studio la PCR è stata
utilizzata per la ricerca del genoma di BVDV nel latte
bovino evidenziando una spiccata sensibilità. In effetti, in
base ai risultati ottenuti, il test si è dimostrato potenzialmente in grado di svelare, sul latte di massa, la presenza di
un animale i.p. in un allevamento di 5000 soggetti. Inoltre,
ai fini della evidenziazione di BVDV nelle cellule somatiche del latte, la PCR è risultata 14,6 volte più sensibile
della prova di isolamento su cellule6.
Anche se nel presente studio le prove non sono state
eseguite su latte di pecore i.p. bensì su latte artificialmente
infettato con BDV, la PCR è risultata essere un test sensibile e di rapida esecuzione idoneo quindi, se applicato al
latte di massa, per identificare gli allevamenti ovini infetti
da BDV da sottoporre, successivamente, alle opportune
strategie di eradicazione dell’infezione.
Il dato relativo alla maggiore sensibilità della PCR applicata su latte ovino (positività fino a 3.000 cellule/ml),
rispetto alla PCR effettuata su latte della bovina i.p. (positività fino a 30.000 cellule/ml), è certamente da attribuire
al fatto che nelle prove su latte ovino il 90% delle cellule
PEB aggiunte erano infette con BDV.
È opportuno, tuttavia, sottolineare un aspetto legato
alla scelta dei primer, i quali, sebbene diretti verso la porzione del genoma molto conservata (5’ untranslated region,
5’ UTR), potrebbero fornire risultati falsi negativi dovuti a
probabili diversità del genoma degli stipiti pestivirus di
campo. In effetti, come riportato da altri Autori8,9, la capacità di amplificazione della PCR può essere condizionata
dalle variazioni genomiche di BVDV.
Questi dati, se da una parte suggeriscono di valutare
preliminarmente le caratteristiche genomiche degli stipiti
pestivirus che circolano in un particolare territorio, ai fini
della costruzione di primer più specifici, dall’altro impongono cautela nell’interpretazione dei risultati negativi forniti dalla PCR durante la fase di screening dell’infezione
negli allevamenti.
Parole chiave
Border disease virus, latte, Polymerase chain reaction.
Key words
Border disease virus, milk, Polymerase chain reaction.
Abbreviazioni
BVDV: virus della diarrea virale bovina. BDV: border
disease virus. PCR: Polymerase Chain Reaction. PEB: cellule di polmone di embrione bovino. D-MEM: DulbeccoMinimal Essential Medium. IFI: Immunofluorescenza
Indiretta.
Bibliografia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
FIGURA 1 - Polymerase chain reaction per la ricerca di BDV in campioni di latte ovino. A: marker; B: BVDV; C: BDV; D: latte con 3 ×104 cellule
infette; E: latte con 3×103 cellule infette; F: latte con 3 ×102 cellule infette; G: latte con 3×101 cellule infette.
9.
Wengler G. Flaviviridae. In: Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson
D.L., Brown F. (eds) Classification and Nomenclature of Viruses. Fifth
Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.
Springer, Wien New York, 1991, pp 223-233 (Arch. Virol. [Suppl] 2).
Moennig V. and Plagemann P.G.W. The pestiviruses. Adv. Vir. Res.,
1992, 41:53-98.
Westbury H.A., Napthine D.V., Straube E. Border disease: persistent
infection with the virus. Vet. Rec., 1979, 104:406-409.
Nettleton P.F. Pestivirus infections in ruminants other than cattle.
Revue Scientifique et Technique, Office internationales des Epizooties,
1990, 9:131-150.
Baker J.C. Bovine viral diarrhea virus: a review. J. Am. Vet. Med.
Assoc., 1987, 190:1449-1458.
Radwan G.S., Brock K.V., Hogan J.S., Smith K.L. Development of a
PCR amplification assay as a screening test using bulk milk samples
for identifying dairy herds infected with bovine viral diarrhea virus.
Vet. Microbiol., 1995, 44:77-92.
Buonavoglia C., Tempesta M., Marsilio F., Buonavoglia D., Gatti A.,
Sands J.J., Compagnucci M. Border disease degli ovi-caprini: nota
sull’isolamento e caratterizzazione del virus in Italia. OdV, 1991,
12:47-49.
Boye M., Kamstrup S., Dalsgaard K. Specific sequence amplification
of bovine virus diarrhea virus (BVDV) and hog cholera virus and
sequencing of BVDV nucleic acid. Vet. Microbiol., 1991, 29:1-13.
Herting C., Pauli V., Zanoni R., Peterhans E. Detection of bovine viral
diarrhea (BVD) virus using polymerase chain reaction. Vet. Microbiol.,
1991, 26:65-76.
SPECIE MINORI
Anche il latte di pecora esente da BDV ha fornito esito
negativo alla prova PCR.
Nelle prove di sensibilità del test PCR il virus è stato
isolato fino alla diluizione 10-2 (circa 30.000 cellule/ml) del
sedimento di cellule somatiche del latte della bovina i.p.
Sugli stessi campioni la PCR ha fornito risultati sovrapponibili evidenziando il genoma di BVDV fino alla diluizione 10-2 del sedimento.
57