Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR Lavoro di Diploma di: Astrea Rossetti, Formazione Tecnico in Analisi Biomediche Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno 2008 Lavoro svolto presso l’Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona Responsabili: Antonella Demarta AnnaPaola Caminada Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR Indice: 1. Nomenclatura 3 2. Riassunto / Abstract 4 3. Introduzione 5 3.1 Gli enterococchi 5 3.2 Aspetti clinici 5 3.3 Resistenza agli antibiotici 6 3.4 I geni di resistenza van 6 3.5 Obiettivi 7 9 4. Materiali e metodi 4.1 Campioni di Enterococchi 9 4.2 Phoenix 9 4.3 Estrazione 10 4.4 Amplificazione di un frammento del gene 16S rDNA tramite PCR 10 4.5 Multiplex PCR dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis 11 4.6 Multiplex PCR dei geni van 12 4.7 Controlli 13 4.8 Elettroforesi 13 4.9 Purificazione prodotti Multiplex PCR 13 4.10 Reazione di sequenza 14 4.11 Purificazione prodotti Reazione di sequenza 14 4.12 Sequenziamento 15 4.13 Banca dati 15 4.14 Organizzazione del lavoro 15 16 5. Risultati 5.1 Identificazione degli stipiti 16 5.2 Estrazione 17 5.3 PCR 16S rDNA 17 5.4 Multiplex PCR dei geni van 17 5.5 Sequenze 18 Astrea Rossetti TAB 3 - SSMT 1/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 6. Discussioni e conclusioni 19 7. Ringraziamenti 21 8. Bibliografia 22 9. Allegati 23 9.1 Soluzioni 23 9.1.1 Campioni e culture 23 9.1.2 Estrazione 23 9.1.3 Elettroforesi 24 9.2 Risultati Astrea Rossetti 25 TAB 3 - SSMT 2/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 1. Nomenclatura ICM Istituto Cantonale di Microbiologia VRE Vancomycin-Resistant Enterococcus MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus PCR Polimerase Chain Reaction DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid MIC Minimum Inhibitory concentration PYR Pirrolidonylarylamidase ID Identificazione MEGA Molecular Evolution Genetics Analysis BLAST Basic Local Alignement Search Tool NCBI National Center for Biotecnology Information Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 3/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 2. Riassunto Abstract Introduzione: Gli Enterococchi sono batteri molto diffusi in natura e presenti in forma commensale negli essere umani. Da qualche anno a questa parte però sono riconosciuti sempre più come agenti patogeni causanti importanti infezioni nosocomiali. Il problema delle infezioni nosocomiali è aggravato dal fatto che sempre più ceppi diventano resistenti agli antibiotici glicopeptidici (come la vancomicina) e quindi difficili da curare. Pertanto un obiettivo del mio lavoro di diploma era quello di stabilire la ripartizione delle specie di Enterococchi e l’incidenza dei geni di resistenza, in Ticino. Inoltre si è voluto valutare la validità della Multiplex PCR per l’identificazione simultanea della specie e dei geni di resistenza alla vancomicina. Materiale e metodi: Sono stati analizzati 121 ceppi di Enterococchi, la routine ha ritenuto 31 ceppi significativi e 90 non significativi per il caso. Per questi ultimi ceppi sono stati eseguiti dei Phoenix. Per 118 ceppi si è continuato con una PCR 16S, una Multiplex PCR per i geni van ed una Multiplex PCR per i geni ddl E. faecalis ed E. faecium. Dopo ogni PCR è stata eseguita un’elettroforesi. Per i risultati dubbi si è continuato con il sequenziamento del ceppo, poi immesso in una banca dati e confrontato con le sequenze conosciute. 3 ceppi si sono rivelati appartenenti alla famiglia degli Streptococcus, quindi non sono più stati presi in considerazione. Risultati: Entrambe le tecniche d’identificazione (Phoenix, Multiplex ddl) hanno mostrato che la specie più frequente è E. faecalis (90.7%), seguita a molta distanza da E. faecium (6.8%). Dei 118 ceppi analizzati solo 3 hanno mostrato dei geni di resistenza, tutti della classe vanC. Conclusioni: In Ticino come nel resto del mondo le specie più isolate sono E. faecalis ed E. faecium. Si è potuto escludere un incremento di altre specie nei materiali clinici. Inoltre si è constatato che il problema dei VRE in Ticino non è particolarmente diffuso. Con questo lavoro si è notato che la Multiplex per l’identificazione simultanea della specie e dei ceppi di resistenza non è un metodo valido, in quanto non permette di discriminare bene sia la specie che la resistenza (se presente), per questo motivo il lavoro è stato svolto con due Multiplex separate. Introduction: Enterococci are widespread bacteria in nature and present in commensal form in human beings. For some years now they have been increasingly recognized as pathogenes causing important nosocomial infections. The problem of nosocomial infections is compounded because more and more strains become resistant to glycopeptide antibiotics (such as vancomycin) and hence difficult to treat. Therefore one aim of my diploma study was to establish the breakdown of the species of Enterococci and the incidence of the resistance genes, in Ticino. Furthermore we wanted to assess the validity of the Multiplex PCR for the simultaneous identification of the species and the genes of vancomycin resistance. Materials and Methods: 121 strains of Enterococci were analysed, the routine considered 31 significant strains and 90 not significant for the case. For these 90 strains, Phoenix identification was performed. For 118 strains the work continued with a PCR 16S, a Multiplex PCR for the genes van and a Multiplex PCR for the genes ddl E. faecalis and E. faecium. After every PCR an electrophoresis was performed. For the doubtful results we continued with a sequencing of the strains, which were then placed in a database and compared with known sequences. 3 strains were revealed belonging to the family of Streptococcus, hence they were not longer considerated. Results: Both the techniques of identification (Phoenix and Multiplex ddl) showed that the more frequent species is E. faecalis (90.7%), followed at a distance by E. faecium (6.8%). Of 118 strains analysed, only 3 showed resistance genes, all of the vanC class. Conclusion: In Ticino as in the rest of the world the species most often isolated are E. faecalis and E. faecium; we were able to exclude an increase of other species in the clinical materials. Furthermore we saw that the problem of VRE in Ticino is not particularly widespread. With this work, we were able to show that the Multiplex for the simultaneous identification of the species and the resistance is not a valid method, because it does not allow discrimination of the species and the resistance (if it is present), for this reason the work was made with 2 separate Multiplex. Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 4/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 3. Introduzione 3.1 Gli Enterococchi Gli Enterococchi sono dei batteri, quindi organismi unicellulari procarioti che si presentano come cocchi gram positivi, catalasi negativi, disposti singolarmente, a coppia o in corte catene. Sono asporigeni e appartengono al gruppo D nella classificazione di Lancefield, poiché possiedono l’antigene D sulla loro membrana [6]. Dopo un’incubazione di 24 ore a 37° C su una piastra agar sangue, le colonie misurano da 1 a 2 mm di diametro. Generalmente non provocano emolisi su piastre agar sangue, oppure si presentano con α-emolisi. Solo alcuni ceppi come Enterococcus faecalis (tranne su piastre agar con sangue di pecora) ed Enterococcus durans sono in grado di fare β-emolisi [5]. Sono batteri molto diffusi in natura (suolo, vegetali, animali, acque, prodotti alimentari) dove grazie a loro particolari caratteristiche riescono a sopravvivere anche in condizioni difficili. Negli uomini possono presentarsi come forme commensali che colonizzano l’apparato intestinale. Questa flora normale è rappresentata principalmente da Enterococcus faecalis [6]. All’Istituto Cantonale di Microbiologia (ICM) gli Enterococchi sono identificati grazie ad esami fenotipici come: l’aspetto delle colonie, il test della catalasi negativo, la crescita sul terreno selettivo “bile esculina” dove idrolizzano l’esculina formando un complesso bruno-nero ed il test rapido della “pirrolidonylarylamidase” (PYR) sempre positivo per gli Enterococchi. Se i ceppi sono ritenuti significativi per la diagnosi microbiologica, il laboratorio esegue l’identificazione con il Phoenix o con l’Api ed un’antibiogramma. Se da quest’ultimo risulta una resistenza alla vancomicina, vengono ricercati i geni di resistenza vanA, vanB e vanC. Nei campioni in cui la presenza di Enterococchi è giudicata non significativa per la diagnosi, il referto di laboratorio segnalerà la loro presenza, ma non verranno eseguite ulteriori indagini. Le specie più isolate dai campioni biologici sono Enteococcus faecalis ed Enterococcus faecium (riportati anche in letteratura [1]come i più importanti nelle patologie), ma segnalazioni di altri laboratori indicano che anche altre specie (E. durans, E. hirae, E. gallinarum, E. casseliflavus) sono isolate con una frequenza rilevante e in aumento. 3.2 Aspetti clinici Essendo dei batteri commensali, gli Enterococchi infettano in particolare persone deboli, come gli anziani o pazienti immunocompromessi che sono stati ricoverati in ospedale per un lungo periodo sottomettendosi a terapie invasive e quant’altro. Per questo motivo sono considerati dei microrganismi patogeni opportunisti [5]. Da qualche anno a questa parte, gli Enterococchi sono riconosciuti sempre più come agenti patogeni causanti infezioni nosocomiali importanti. Infezioni urinarie, setticemie, infezioni di ferita ed endocarditi sono le malattie più frequenti causate da questi batteri [2,3,5]. Negli Stati Uniti d’America sono la terza causa di batteriemie nosocomiali. [3] Il problema delle infezioni nosocomiali causate da Enterococchi è aggravato dal fatto che sempre più ceppi diventano resistenti agli antibiotici glicopeptidici e quindi difficili da curare. La vancomicina è un antibiotico appartenente a questa classe, ottenuta da Streptomyces orientalis ed è utilizzata per combattere infezioni causate da batteri gram positivi, in caso di resistenza o allergia ad altri antibiotici, è inattiva contro batteri gram negativi e micobatteri [1,2,3,4,8] Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 5/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR È usata in ambiente ospedaliero e si somministra tramite infusioni endovenose. La sua azione è rivolta contro il peptidoglicano, inibendone la sintesi ed impedendo così la normale formazione della cellula [7]. La resistenza alla vancomicina è spesso associata ad una multiresistenza, che rende inefficace qualsiasi terapia antibiotica. Per questo motivo è considerata come un’ultima speranza, perché se questo antibiotico non ha nessun effetto, molto probabilmente anche gli altri sono inefficaci. Inoltre la resistenza a quest’antibiotico potrebbe avere gravi ripercussioni nel campo della sanità pubblica perché è noto che i geni di resistenza alla vancomicina possono essere trasferiti anche ad altri batteri, magari più patogeni, come lo Staphilococcus aureus. Il trasferimento della resistenza è un problema molto importante perché è noto che già dopo pochi anni dall’introduzione della penicillina molti ceppi di Staphilococcus aureus diventarono resistenti a quest’antibiotico. S’iniziò ad usare la meticillina, ma questa specie risultò resistente anche a quest’antibiotico (MRSA) Per questo motivo dagli anni ’80 s’iniziò ad utilizzare la vancomicina che risulta ancora oggi, uno dei pochi farmaci ancora efficaci nella terapia delle infezioni a MRSA. Ecco spiegate le gravi ripercussioni sanitarie se lo Staphilococcus aureus risultasse resistente anche a quest’antibiotico. [7,8] Sebbene il problema dell’antibiotico resistenza sia principalmente ospedaliero, l’origine della diffusione di questo problema sta nell’uso di antibiotici negli animali d’allevamento, per promuoverne la crescita. Purtroppo si sono manifestati meccanismi di resistenza, ottenendo così dei cibi contaminati da batteri resistenti che hanno infettato delle persone. Ne è l’esempio il focolaio europeo di VRE, causato quasi sicuramente da un aumentato uso di avoparcin (antibiotico glicopeptidico) in cibi d’origine animale [7]. 3.3 Resistenza agli antibiotici La resistenza agli antibiotici può essere dovuta da una resistenza naturale grazie alla costituzione stessa del batterio e/o da una resistenza acquisita. Quest’ultima è la conseguenza di modifiche del genoma batterico, quali: • Mutazioni: Le mutazioni spontanee avvengono quando il batterio è sottoposto ad una pressione selettiva da parte dell’antibiotico. I batteri sensibili muoiono lasciando spazio al battere con la mutazione e cioè resistente all’antibiotico che può riprodursi facilmente trasmettendo la resistenza verticalmente ai suoi cloni. • Scambio di geni di resistenza tra specie o ceppi: I plasmidi, (DNA extracromosomale circolare), sono il vettore dei geni di resistenza. Non sono presenti in tutti i batteri perché non sono d’importanza vitale, ma i batteri che li possiedono possono avere caratteristiche vantaggiose di selettività. Lo scambio d’informazioni genetiche della resistenza agli antibiotici avviene principalmente grazie a meccanismi di coniugazione, ossia la trasmissione di DNA tramite processi d’accoppiamento e quindi grazie al contatto diretto fra due cellule. La resistenza ad un antibiotico si manifesta grazie a dei meccanismi biochimici come la modificazione della permeabilità della membrana, l’inattivazione dell’antibiotico grazie ad enzimi inattivanti come ad esempio le β-lattamasi, o la produzione di un bersaglio alternativo [3,7,9]. 3.4 I geni di resistenza van La resistenza alla vancomicina si basa sull’ultimo meccanismo citato. Infatti, il suo bersaglio è la parte terminale del precursore del peptidoglicano (N-acetilmuramico-pentapeptide) D-ALA-DALA. Dimero legato da un enzima (D-ALA-D-ALA ligase) prodotto dal gene ddl. Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 6/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR Le cellule resistenti non hanno il terminale sopra citato, bensì D-ALA-D-LATTATO che riduce di molto la sensibilità della cellula, agli antibiotici glicopeptidici [7]. Le specie che presentano una resistenza alla vancomicina hanno un complesso (operone) di 5 geni van: vanR e vanS sono geni di regolazione, controllano l’espressione degli altri geni van; il gene vanH codifica per un’enzima che trasforma il piruvato in D-LATTATO; il gene vanA codifica per un’enzima che lega D-ALA e D-LATTATO invece di D-ALA e D-ALA e il gene vanX codifica per un’enzima che è in grado di rompere il legame fra D-ALA-D-ALA e non di D-ALA-D-LATTATO. Esistono altri geni van, come vanY e vanZ in grado di amplificare la resistenza ma non implicati nell’espressione di essa. Figura 1: meccanismo di resistenza alla vancomicina Sono stati decritti sei tipi di resistenze agli antibiotici glicopeptidici: La resistenza di tipo vanA ha un alto livello di resistenza sia alla vancomicina che alla teicoplanina, nuovo complesso chimico glicopeptidico simile alla vancomicina, usato in molte nazioni, tranne in USA. [8] La resistenza di tipo vanB ha un livello variabile di resistenza alla vancomicina, ma è sensibile alla teicoplanina. La resistenza di tipo vanD ha una resistenza moderata sia alla vancomicina che alla teicoplanina. Le resistenze di tipo vanC, vanE, vanG hanno un basso livello di resistenza alla vancomicina. Di questi, vanA e vanB sono i tipi maggiormente isolati dai materiali clinici ed in letteratura è riportato che la stragrande maggioranza dei ceppi VRE appartengono alla specie E. faecium [1,7] 3.4 Obiettivi La resistenza agli antibiotici è uno dei problemi sanitari di maggiore importanza, sempre più diffuso a causa di un cattivo ed eccessivo uso di antibiotici che ha causato una selezione di ceppi resistenti. La PCR è usata per fare diagnosi mediche, per identificare specie e per determinare resistenze agli antibiotici. Questa tecnica di biologia molecolare ha tre vantaggi molto importanti: il tempo ridotto nell’avere un risultato, i costi diminuiti ed una maggiore accuratezza rispetto i metodi classici di identificazione (colture, test biochimici, …). Il tempo è un aspetto molto importante quando c’è un infezione in corso causata da batteri multiresistenti, perché una rapida identificazione può prevenire il propagarsi della malattia, somministrando una terapia adeguata, evitando quindi un contagio tra i pazienti ospedalizzati. Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 7/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR Gli obiettivi del mio lavoro di diploma possono essere riassunti in: Stabilire la ripartizione delle specie di Enterococchi, nei materiali clinici che l’ICM riceve, suddividendo gli stipiti tra commensali e potenzialmente patogeni. Valutare l’incidenza dei geni di resistenza alla vancomicina nelle differenti specie analizzate. Valutare la validità di un metodo molecolare che permette l’identificazione simultanea della specie e dei geni di resistenza alla vancomicina tramite PCR. Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 8/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 4. Materiali e metodi 4.1 Campioni di Enterococchi I 121 ceppi di Enterococchi usati in questo lavoro sono stati isolati in routine all’ICM nel 2007 da diversi materiali biologici e provenienti da diversi ospedali ticinesi. Di questi 121 ceppi 31 sono stati ritenuti significativi, cioè responsabili dell’infezione, e 90 sono non significativi per il caso. Sono stati poi congelati a -80 °C nel terreno di coltura Skin Milk, Becton Dickinson (allegato 9.1.1). La coltivazione dei ceppi di Enterococchi è stata effettuata su piastre Agar Sangue (prodotte dall’ICM, allegato 9.1.1) ed incubati a 37 °C per circa 24 ore. Il giorno seguente sono state ripiastrate da una colonia per avere una crescita pura. 4.2 Phoenix È un sistema automatizzato (BD, Becton Dickinson) usato in routine per l’identificazione rapida dei batteri tramite reazioni biochimiche, e per la determinazione della loro sensibilità agli antibiotici, determinandone la concentrazione minima inibitrice (MIC). In questo lavoro è stato usato il Phoenix per determinare la specie dei campioni che in routine sono stati identificati solo come “Enterococchi” in quanto considerati commensali o contaminanti. Figura 2: Phoenix (BD, Becton Dickinson) [10] Metodica per l’uso del sistema automatizzato Phoenix: Inoculare alcune colonie nel brodo ID, fino a raggiungere una torbidità, misurata con un nefelometro, di 0.5 McF. Mettere una goccia di indicatore (sostanza fluorescente), nel brodo AST e aggiungere 25 μl della soluzione ID. Versare le due soluzioni nelle apposite sezioni del pannello, aspettare che scenda tutto il liquido, chiudere e inserirlo nell’apparecchio per la lettura. Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 9/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 4.3 Estrazione L’estrazione del DNA è stata eseguita con un’estrazione classica al fenolo/cloroformio. Le soluzioni utilizzate sono preparate all’ICM (allegato 9.1.2). Il DNA ottenuto è stato utilizzato nelle varie PCR. Metodica usata all’ICM: Prelevare una piccola quantità di batteri (un’ansa da 10 μl riempita bene dai due lati) e risospendere in 508 μl di TE in un Eppendorf. Aggiungere 50 μl di Lisozima (10 mg/mL) ed incubare a 37°C per due ore. Aggiungere 30 μl di SDS 10% e 12 μl di proteinasi K (8,3 mg/mL), miscelare con il vortex ed incubare a 37°C per 1 ora, la soluzione deve essere limpida. Aggiungere 100 μl di NaCl 5 M e miscelare, aggiungere 80 μl di CTAB 10% preriscaldato a 65°C in bagno-Maria, mescolare molto bene ed incubare 10 minuti a 65°C nel termoblock o a bagnoMaria. Aggiungere 700 μl di cloroformio/alcol isoamilico (24:1), mescolare a mano fino a quando non si vedono più le due fasi e centrifugare 10 minuti a 13000 rpm. Trasferire in una nuova Eppendorf 500 μl del sopranatante prestando attenzione a non aspirare lo strato bianco (proteine), pipettando piano. Aggiungere 500 μl (stesso volume di sopranatante) di fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (25:24:1), mescolare a mano (come sopra) e centrifugare 10 minuti a 13000 rpm. Trasferire 200 μl di sopranatante in Eppendorf safe-look, con gli stessi accorgimenti di prima. Aggiungere 120 μl (corrispondenti a: μl di soluzione presente nell’Eppendorf, moltiplicato per 0.6) di isopropanolo freddo -20°C, far precipitare il DNA oscillando la provetta e centrifugare 13 minuti a 4°C a 13000 rpm. Decantare, facendo attenzione a non perdere il precipitato di DNA. Lavare il pellet aggiungendo 300 μl di alcool 70% tenuto a -20°C, far precipitare il DNA come prima fino all’apparizione del precipitato di DNA e centrifugare 5 minuti a 13000 rpm. Decantare come prima e far asciugare il pellet nello speed vac, o lasciando l’Eppendorf aperta e capovolta su un portaprovette per circa 1 ora. Una volta asciutto risospendere il materiale in 80 μl di TE e tenere in frigo. 4.4 Amplificazione di un frammento del gene 16S rDNA tramite PCR La PCR utilizzata serve ad amplificare una regione del gene 16S, grazie ai primer rrs (16SrRNA) forward e rrs (16SrRNA) revers (Microsynth, CH), (tabella 1). Questa PCR è stata utilizzata come controllo, per assicurarsi che la quantità di DNA estratto permettesse una buona amplificazione, nelle due Multiplex. Il mix per un campione contiene 50 µl: • 25 μl Taq PCR Master Mix (QIAGEN, CH) • 1.5 μl primer rrs (16SrRNA) F (concentrazione iniziale di 10 μM) • 1.5 μl primer rrs (16SrRNA) R (concentrazione iniziale di 10 μM) • 20 μl H2O sterile RNase-free • 2 μl DNA Le reazioni sono state fatte con un thermal cycler 2720 (Applied Biosystem): 15 minuti a 94°C (prima denaturazione) 30 cicli di amplificazione: Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 10/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR • 1 minuto a 94°C (denaturazione) • 1 minuto a 54°C (ibridazione) • 1 minuto a 72°C (estensione) 7 minuti a 72°C (estensione finale) Tabella 1: Primer utilizzati nella PCR 16S rDNA Primer rrs (16SrRNA)F rrs (16SrRNA)R Sequenza Taglia prodotti PCR Gene 320 pb 16S 5'-GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC C-3' 5'-TCG TTG CGG GAC TTA ACC CAA C-3' 4.5 Multiplex PCR dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis Questa Multiplex serve ad amplificare contemporaneamente i geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis. Primer mix: 10 μl di ogni primer (10 μM), quantità variabile di H2O a dipendenza da quanti primer si utilizzano. Volume totale 500 μl. In questa Multiplex si usano 4 primer (tabella 2) quindi: • 40 μl Primer • 460 μl H2O Il mix per un campione contiene 50µl: • 25 μl 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (QIAGEN, CH) • 5 μl Primer Mix (concentrazione iniziale di ogni primer 10 μM) • 18 μl H2O sterile RNase-free • 2 μl DNA Le reazioni sono state fatte con il thermal cycler 2720 (Applied Biosystem) 15 minuti a 94°C (prima denaturazione) 30 cicli di amplificazione: • 1 minuto a 94°C (denaturazione) • 1 minuto a 54°C (ibridazione) • 1 minuto a 72°C (estensione) 7 minuti a 72°C (estensione finale) Tabella 2: Primer utilizzati nella Multiplex PCR per i geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis Primer DD13 (+) Sequenza 5'-ATG GCT ACT TCA ATT TCA CG-3' FAC1-1 (+) 5'-GAG TAA ATC ACT GAA CGA-3' Astrea Rossetti Gene 475 pb ddl (E. faecalis) 1091pb ddl (E. faecium) 5'-CAC CTG AAG AAA CAG GC-3' DD3-2 (-) FAC2-1 (-) Taglia prodotti PCR 5'-CGC TGA TGG TAT CGA TTC AT-3' TAB 3 – SSMT 11/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 4.6 Multiplex PCR dei geni van Questa Multiplex serve ad amplificare contemporaneamente i geni vanA, vanB, vanC1/2, vanD, vanE, vanG. Primer mix: 10 μl di ogni primer (10 μM), quantità variabile di H2O a dipendenza di quanti primer si utilizzano. Volume totale 500 μl In questa Multiplex si usano 14 primer (tabella 3) quindi: • 140 μl Primer • 360 μl H2O Il mix per un campione contiene 50 µl: • 25 μl 2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (QIAGEN, CH) • 5 μl Primer Mix (concentrazione iniziale di ogni primer 10 μM) • 18 μl H2O sterile RNase-free • 2 μl DNA Le reazioni sono state fatte con il thermal cycler 2720 (Applied Biosystem) 15 minuti a 94°C (prima denaturazione) 30 cicli di amplificazione • 1 minuto a 94°C (denaturazione) • 1 minuto a 54°C (ibridazione) • 1 minuto a 72°C (estensione) 7 minuti a 72°C (estensione finale) Tabella 3: Primer utilizzati nella Multiplex PCR van Primer EA1 (+) Sequenza Taglia prodotti PCR Gene 732 pb VanA 647 pb VanB 815/827 pb VanC1/2 732 pb VanD 5'-GGG AAA ACG ACA ATT GC-3' EA2 (-) 5'-GTA CAA TGC GGC CGT TA-3' EB3 (+) 5'-ACG GAA TGG GAA GCC GA-3' EB4 (-) 5'-TGC ACC CGA TTT CGT TC-3' EC5 (+) 5'-ATG GAT TGG TAY TKG TAT-3' * EC8 (-) 5'-TAG CGG GAG TGM CYM GTA A-3' * ED1 (+) 5'-TGT GGG ATG CGA TAT TCA A-3' ED2 (-) 5'-TGC AGC CAA GTA TCC GGT AA-3' * Y = C/T, K = G/T, M = A/C Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 12/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR Primer EE1 (+) Sequenza Gene 430 pb VanE 941 pb VanG 5'-TGT GGT ATC GGA GCT GCA G-3' EE2 (-) 5'-ATA GTT TAG CTG GTA AC-3' EG1 (+) 5'-CGG CAT CCG CTG TTT TTG A-3' EG2 (-) Misura prodotti PCR 5'-GAA CGA TAG ACC AAT GCC TT-3' 4.7 Controlli Nella Multiplex PCR dei geni van ho utilizzato 7 controlli: E. faecium VanA (3.40, ICM, Bellinzona) E. faecium VanB (3.104, ICM, Bellinzona) E. gallinarum VanC1 (2.130, ICM, Bellinzona) E. casseliflavus VanC2 (3.80, ICM, Bellinzona) E. faecalis VanE (BM 4405, Istituto Pasteur, Paris, France) E. faecium VanD (BM 4339, Istituto Pasteur, Paris, France) E. faecalis VanG (BM 4518, Istituto Pasteur, Paris, France ) Nella Multiplex PCR dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis) ho usato 2 controlli: E. faecalis (1.8, ICM, Bellinzona) E. faecium (2.52, ICM, Bellinzona) 4.8 Elettroforesi Tutti i prodotti di amplificazione della PCR 16S rDNA e delle Multiplex PCR sono stati fatti migrare, in gel d’agarosio (agarose LE, Roche) al 1.5% in tampone TBE. Inoltre sono state eseguite elettroforesi di controllo dell’estrazione al 0.8% in tampone TBE (allegato 9.1.3). Per ogni campione della PCR 16S rDNA sono stati caricati 3 µl di Loading Buffer 6x nelle placche di titolazione, sono stati aggiunti 5 µl di DNA amplificato ed è stato caricato sul gel. Per i campioni delle Multiplex PCR si è usato 2 µl di DNA amplificato e per il controllo dell’estrazione sono stati usati 4 µl di DNA estratto. Il marcatore di taglia è stato caricato con 3 µl di Loading Buffer e 3 µl di Marker XIII 50 pb (Roche) per la PCR 16S rDNA, rispettivamente 3 µl di Marker XIV 100 pb (Roche) per le Multiplex. La migrazione è stata eseguita a 120 Volt/cm2 per circa 1 ora per la PCR 16S e per l’elettroforesi dei controlli dell’estrazione; circa 1 ora e 30 minuti per la Multiplex PCR dei geni van e per la Multiplex dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis. Dopo ogni migrazione sono state realizzate le foto con un transilluminatore UV per evidenziare i frammenti di DNA. 4.9 Purificazione prodotti Multiplex PCR I ceppi che hanno mostrato bande dubbie sono stati purificati mediante colonnine del kit NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel, Germania) per togliere primer, dNTP e Taq Polimerasi liberi ed in eccesso. Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 13/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR Metodica: Aggiungere all’amplificato il volume mancante per arrivare a 100 µl di buffer NT e poi due volumi del campione (100 µl per 2 = 200 µl) di buffer NT, depositare il tutto nella colonnina e centrifugare un minuto a 11000g. Dopo la centrifugazione togliere la soluzione di scarto presente nell’Eppendorf ed aggiungere 600 µl buffer NT3 facendo di nuovo centrifugare il tutto per un minuto a 11000g. Togliere lo scarto e centrifugare due minuti a 11000g. A questo punto aggiungere 15-50 µl di Elution buffer NE, incubare a temperatura ambiente per un minuto e centrifugare ulteriormente un minuto a 11000g. 4.10 Reazione di sequenza Con i ceppi purificati è stata eseguita una reazione di sequenza. Reazione che permette di polimerizzare un solo braccio del DNA batterico. Il mix per un campione contiene 15 µl: • 3 µl Big Dye Terminator v1.1 (Applied Biosystem) • 1.5 µl Loading Buffer, BigDye Terminator v1.1 sequencing Buffer 5x (Applied Biosystem) • 2.4 µl primer (concentrazione iniziale 1 μM) • 6.1 µl H2O sterile RNase-free • 2 µl DNA La quantità di DNA da utilizzare si decide in base alla grandezza del frammento da amplificare ed in base alla concentrazione di DNA amplificato. Per esperienza è stato usato questo volume in tutte le reazioni. In alcuni casi però la prima reazione di sequenza non è riuscita, si è quindi quantificato il DNA ed in base alla concentrazione si è deciso di usare quantità diverse per ogni campione. Le reazioni sono state fatte con il thermal cycler 2720 (Applied Biosystem) 25 cicli di amplificazione: • 10 secondi a 96°C (denaturazione) • 5 secondi a 50°C (ibridazione) • 4 minuti a 60°C (estensione) 4.11 Purificazione prodotti reazione di sequenza I ceppi amplificati con la reazione di sequenza sono stati purificati con due metodi, a dipendenza del tempo a disposizione e dalla quantità di campioni da purificare. Metodica 1: Kit Sephadex Pipettare 900 µl di Sephadex in una colonnina vuota (messa in un’Eppendorf) e centrifugare 3 minuti a 770 g. Gettare la soluzione presente nell’Eppendorf e pipettare sulla colonnina 15 µl di reazione di sequenza. Centrifugare 3 minuti a 770 g, gettare il Sephadex presente nella colonnina e tenere la soluzione presente nell’Eppendorf. Pipettare 8 µl del campione e metterli nelle provettine apposite per il sequenziatore, dove in precedenza sono stati pipettati 12 µl di HI-DI Formamide (Applied Biosystem). Metodica 2: Purificazione con filtro di nitrocellulosa (0.025 µm, Millipore) Mettere in una camera di Petri del TE pH 8. Identificare i campioni sul filtro, poi appoggiarlo nel TE. Pipettare 15 µl del campione ed incubare 2 ore a temperatura ambiente. Aspirare 8 µl del campione e metterli nelle provettine apposite per il sequenziatore, dove in precedenza sono stati pipettati 12 µl di HI-DI Formamide (Applied Biosystem). Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 14/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 4.12 Sequenziamento I ceppi della reazione di sequenza purificati sono stati sequenziati con l’apparecchio ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystem). 4.13 Banca dati Le sequenze ottenute sono state corrette manualmente leggendo l’elettroferogramma e analizzate mediante il programma MEGA 3.0 (Molecular Evolution Genetics Analysis) che permette l’allineamento del frammento con i primer. Le sequenze corrette sono state poi introdotte nella banca dati BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) della NCBI (National Center for Biotecnology Information, USA) per confrontarle con le sequenze conosciute. Questo è servito ad identificare il frammento. 4.14 Organizzazione del lavoro Il lavoro è stato svolto in questo ordine: • Coltivazione dei 121 ceppi • Estrazione di DNA batterico • Identificazione con il Phoenix dei 90 ceppi ritenuti non significativi dalla routine • PCR 16S di 118 ceppi • Multiplex PCR dei geni van di 118 ceppi • Multiplex PCR dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis di 118 ceppi • Purificazione, reazione di sequenza e sequenziamento dei 6 ceppi dubbi Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 15/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 5. Risultati 5.1 Identificazione degli stipiti In totale sono stati analizzati 121 ceppi batterici. Tramite il sistema automatico d’identificazione Phoenix i ceppi E34, E37 ed E44, le cui crescite su piastra erano già risultate anomale, sono stati identificati come Streptococcus spp e non sono più stati presi in considerazione nelle analisi successive. Dei 118 ceppi rimasti il 93% è stato identificato in ugual modo sia dal Phoenix che dalla Multiplex PCR per i geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis. Il 7% invece ha mostrato delle incongruenze (tabella 4): 7 ceppi (E22, E23, E175, E192, E218, E219 ed E242) identificati dal Phoenix come E. casseliflavus/gallinarum, nella Multiplex hanno mostrato una banda a 475 bp, relativa a E. faecalis. Il ceppo E100, identificato dal Phoenix come E. raffinosus, ha mostrato una banda a 1091 bp, relativa a E. faecium. (figura 3) Tabella 4: Confronto ID Phoenix e Multiplex PCR dei geni ddl E. faecium e ddl E. faecalis ID Phoenix ID Multiplex 100 7 10 1 0 118 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus casseliflavus/gallinarum Enterococcus raffinosus Negativi 107 8 0 0 3 118 Figura 3: Migrazione elettroforetica Multiplex PCR geni ddl (E.faecium e faecalis) gel 1.5% 1) DNA Molecular Weight Marker XIV, 100 bp, Roche 2) K+ E. faecalis (1.8, ICM, Bellinzona) 475 bp 3) Campione E1 4) Campione E3 5) Campione E22 6) K+ E. faecium (2.52, ICM, Bellinzona) 1091 bp 7) Campione E4 8) Campione E24 9) Campione E100 10) EN 24/07 11) DNA Molecular Weight Marker XIV, 100 bp, Roche Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 16/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR I ceppi ritenuti significativi dalla routine sono stati suddivisi in 3 gruppi di specie batteriche, mentre quelli ritenuti non significativi appartenevano unicamente alle specie E. faecalis ed E. faecium (tabella 5). Tabella 5: Suddivisione dei ceppi batterici Ceppi ritenuti significativi E. casseliflavus/E.gallinarum E. faecalis E. faecium 3 22 6 31 Ceppi ritenuti non significativi E. faecalis E. faecium 85 2 87 In conclusione i ceppi analizzati appartenevano alle specie indicate nella tabella 6. Tabella 6: Identificazione conclusiva 107 8 2 1 3 121 Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus casseliflavus Enterococcus gallinarum Streptococcus spp 5.2 Estrazione Sono state eseguite 121 estrazioni, le quali sono state controllate con un gel d’agarosio allo 0.8%. Tutte le estrazioni eseguite hanno avuto esito positivo. 5.3 PCR 16 S rDNA Tutti 118 i campioni sono stati amplificati con successo. Controllati con un gel d’agarosio al 1.5%. 5.4 Multiplex PCR dei geni van I 118 ceppi sono stati amplificati con successo. Per 115 ceppi non si sono riscontrati geni di resistenza. Il ceppo EN33/07 ha mostrato un’amplificazione positiva per il gene di resistenza vanC1 e i ceppi EN24/07 ed EN28/07 per il gene vanC2. Per i ceppi E24 ed E29, si è presentata una banda ad un’altezza simile al gene di resistenza vanA (732 bp). Per i ceppi E95 ed E100, si è presentata una banda ad un’altezza simile al gene di resistenza vanG (941 bp). Per i ceppi E158 ed E160 si è presentata una banda ad un’altezza simile al gene di resistenza vanD (500 bp); (figura 4). Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 17/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR Figura 4: Migrazione elettroforetica Multiplex PCR dei geni van gel 1.5%. 1) DNA Molecular Weight Marker XIV, 100 bp, Roche, 2) K+ E. faecium vanA (3.40, ICM, Bellinzona) 732 bp, 3) Campione E24, 4) K+ E. faecium vanB (3.104, ICM, Bellinzona) 647 bp, 5) K+ E. gallinarum vanC1 (2.130, ICM, Bellinzona) 815 bp, 6) Campione EN 33/07, 7) K+ E. casseliflavus vanC2 (3.80, ICM, Bellinzona) 827 bp, 8) Campione EN 28/07, 9) K+ E. faecalis vanE (BM 4405, Istituto Pasteur, Paris, France) 430 bp, 10) K+ E. faecium vanD (BM 4339, Istituto Pasteur, Paris, France) 500 bp, 11) Campione E158, 12) K+ E. faecalis vanG (BM 4518, Istituto Pasteur, Paris, France ) 941 bp, 13) Campione E100, 14) Campione E1, 15) Campione E4, 16) Molecular Weight Marker XIV, 100 bp, Roche 5.5 Sequenze I 6 ceppi che hanno dato delle bande dubbie, sono stati sequenziati per identificare il frammento. Tutte le sequenze sono state inserite nella banca dati, ma non hanno mostrato nessuna corrispondenza con i geni di resistenza van. Il sequenziamento dei ceppi E95, E100, E158 ed E160 non ha dato nessun risultato. In conclusione nella tabella 7 è mostrata la suddivisione dei geni di resistenza trovati nei 118 ceppi analizzati. Tabella 7: Frequenza geni di resistenza Neg VanA VanB VanC1 VanC2 VanD VanE VanG Astrea Rossetti 115 0 0 1 2 0 0 0 118 TAB 3 – SSMT 18/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 6. Discussioni e conclusioni I risultati ottenuti mostrano chiaramente che il ceppo isolato con maggior frequenza, da diversi materiali clinici, è Enterococcus faecalis (90.7%), seguito a molta distanza da Enterococcus faecium (6.8%), Enterococcus casseliflavus (1.7%) ed Enterococcus gallinarum (0.8%). Dei 121 ceppi analizzati, 3 non sono più stati considerati dopo identificazione con il Phoenix, perché appartenenti ad un’altra specie (Streptococcus spp.). Esaminando i 118 ceppi si nota che il problema degli Enterococchi resistenti alla vancomicina, in Ticino, non è ancora particolarmente diffuso. Infatti, dei 17/118 ceppi dove il Phoenix ha mostrato una resistenza alla vancomicina, solo 3 ceppi hanno presentato effettivamente un gene di resistenza, tutti della classe vanC. A differenza dell’articolo di F. Depardieu and all [1], in questo lavoro non è stata eseguita una singola Multiplex PCR per identificare contemporaneamente i geni van ed i geni ddl. Questo perchè all’inizio del lavoro i gel ottenuti da questa Multiplex mostravano bande troppo vicine (E. faecalis 475 bp, vanD 500 bp, vanE 430 bp) difficili da separare, con il rischio di ottenere risultati falsati. Si è così deciso di separare l’identificazione del ceppo, dalla determinazione dei geni di resistenza van, perchè il nostro interesse principale era quello di individuare, se presenti, i geni di resistenza; visto che l’identificazione si otteneva già con il Phoenix e la Multiplex ci forniva solo l’ID di E. faecium ed E. faecalis. A questo punto la Multiplex ddl non sarebbe più stata necessaria, ma è stata eseguita per avere un confronto con l’ID del Phoenix. Infatti è stato utile, perché si è osservato che 7 ceppi identificati dal Phoenix come E. casseliflavus/gallinarum, con la Multiplex ddl si sono rivelati E. faecalis; ed un ceppo identificato come E. raffinosus si è rivelato E. faecium. Questa contraddizione si spiega col fatto che alcune reazioni biochimiche per l’ID nel sistema Phoenix, sono simili sia per la specie E. faecalis che E. casseliflavus/gallinarum ed altre sia per E. faecium che E. raffinosus. Può darsi quindi che alcuni tipi di E. faecalis ed E. faecium hanno caratteristiche fenotipiche simili ad altre specie o comunque diverse dai ceppi tipici della stessa; ed il Phoenix ha difficoltà nel riconoscerli. Con la Multiplex queste difficoltà non ci sono perché si lavora specificatamente sui geni ddl presenti su E. faecalis ed E. faecium è quindi difficile che possa dare dei risultati falsi. Essendo la Multiplex più specifica, si può dire con certezza che se si ottiene una banda all’altezza corrispondente ad E. faecalis o E. faecium, si tratta sicuramente di queste 2 specie, perché se fosse un E. casseliflavus/gallinarum, come mostra la figura 3, campione 10, ceppo EN 24/07, non si otterrebbero bande oppure si conseguirebbero bande aspecifiche ad un’altezza che non corrisponde ne ad una ne all’altra specie. Lo stesso discorso vale per E. raffinosus (figura 3, campione 9, ceppo E100). In routine, la microbiologa, non si basa solo sull’ID del Phoenix, ma guarda anche altri aspetti, come la morfologia delle colonie, il tipo di materiale, la casistica, l’antibiogramma, … Quando il sistema Phoenix identifica un E. casseliflavus/gallinarum, esprime automaticamente la resistenza alla vancomicina sul referto cartaceo, senza dare un valore della MIC perché entrambi presentano sempre una resistenza a quest’antibiotico. La microbiologa consulta il referto al computer e se osserva un valore della MIC ≤ 4 µg/ml, quindi sensibile, procede con un altro metodo d’identificazione, se invece il valore della MIC è veramente intermedia o resistente procede con un VancoScreen. Probabilmente anche i 7 ceppi identificati erroneamente dal Phoenix come E. casseliflavus/gallinarum, al computer presentavano una MIC sensibile. Quindi raramente o mai un risultato viene validato in modo incorretto. Infatti con questo lavoro si è anche notato che tutti i ceppi ritenuti “non significativi” dalla routine, quindi senza ID specifiche, non hanno mostrato nessun gene di resistenza, questo consolida quanto affermato sopra, perché dimostra che non esiste un serbatoio di geni di resistenza alla vancomicina in Enterococchi ritenuti commensali/contaminanti. Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 19/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR Se avessimo ottenuto geni di resistenza in questi ceppi, il problema in sanità pubblica sarebbe aumentato, perché se il ceppo non viene identificato come patogeno principale della malattia, non viene neanche eseguito un antibiogramma e se casualmente viene somministrata della vancomicina, il batterio resistente si riprodurebbe facilmente e la possibilità di infettare altri organi od individui aumenterebbe. Personalmente trovo che la Multiplex PCR ddl per determinare la specie sia un buon metodo perché molto specifico, però non proporrei necessariamente la sua introduzione in routine, perché determina solo due specie, ha dei costi elevati ed il Phoenix resta comunque un sistema d’identificazione valido, tant’è vero che dei 121 ceppi esaminati, solo per 8 ha dato un risultato falso, di cui solo 3 erano ceppi ritenuti significativi nella patologia, che sono stati poi identificati con un altro metodo (Api). A differenza della Multiplex ddl, trovo che la Multiplex van è una tecnica che potrebbe migliorare il lavoro in routine in routine, perché oltre ad essere un metodo molto valido e specifico, comprende tutti i geni di resistenza. Questo è molto utile perché è già capitato di ottenere una resistenza alla vancomicina con il Phoenix, ma che la PCR risultasse negativa. Invece ricercando anche i geni vanD, vanE, vanG si avrebbe subito una visione completa del ceppo resistente. Inoltre consiglio l’introduzione della Multiplex rispetto alla PCR utilizzata ora per migliorare aspetti pratici, temporali ed economici. A questo punto si potrebbe provare ad inserire tutti i controlli in una sola provetta di reazione. Se il risultato ottenuto sarà buono come quello con provette separate, l’analisi acquisterebbe ancora più vantaggi pratici e temporali perché basterebbe preparare una sola volta un mix di controlli ed usarne la quantità voluta per ogni PCR che si esegue. Curioso sarebbe testare una Multiplex PCR ddl anche sui 3 ceppi identificati come Streptococcus spp, per vedere se anche queste identificazioni mostrano delle incongruenze o se effettivamente appartengono a questa specie, visto che morfologicamente questi ceppi erano stati identificati dalla routine come Enterococchi. Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 20/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 7. Ringraziamenti In primo luogo ringrazio il direttore dell’Istituto Cantonale di Microbilogia, Dr. Orlando Petrini, per avermi permesso di svolgere il mio lavoro di diploma presso l’Istituto. Ringrazio la dottoressa Antonella Demarta ed AnnaPaola Caminada per la scelta dell’argomento del lavoro di diploma, per avermi seguito durante il suo svolgimento, per il loro supporto tecnico ed i loro consigli. Ringrazio anche tutto il laboratorio di routine dell’ICM, per la raccolta dei campioni e l’aiuto pratico. Inoltre ringrazio il direttore della SSMT Andrea Boffini ed il docente di chimica clinica Giovanni Togni per gli insegnamenti metodologici ricevuti durante tutto il periodo scolastico. Ringrazio le docenti Daniela Marcacci e Sonja Marci per il loro sostegno, il docente Francesco Bezzola per gli insegnamenti informatici e metodologici. Un grazie anche a Sheila Tomasini per la sua disponibilità, i consigli e l’aiuto nella stesura del lavoro. Infine ringrazio Athos e la mia famiglia per il loro supporto morale ed i loro aiuti ricevuti durante tutto il periodo scolastico. Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 21/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 8. Bibliografia 1. Depardieu F., Perichon B. and Courvalin P., Detection of the Van Alphabet and Identification of Enterococci and Staphylococci at the Species Level by Multiplex PCR, J. Clin. Microbiol.,Vol. 42 No.12, p. 5857-5860 2. Eigner U., Fahr A., Weizenegger M. and Witte W., Evaluation of a New Molecular System for Simultaneous Identification of Four Enterococcus Species an Their Glycopeptide Resistance Genotypes, J. Clin. Microbiol., Vol. 43 No. 6, p. 2920-2922 3. Dutka-Malen S., Evers S. and Courvalin P., Detection of Glycopeptide Resistance Genotypes and Identification to the Species Level of Clinically Relevant Enterococci by PCR, J. Clin. Microbiol., Vol. 33 No. 1, p. 24-27 4. Kariyama R., Mitsuhata R., Chow J. W., Clewell D. B. and Kumon H., Simple and Reliable Multiplex PCR Assay for Surveillance Isolates of Vancomycin-Resistant Enterococci, J. Clin. Microbiol., Vol 38 No. 8, p. 3092-3095 5. Martins Teixeira L., Da Gloria Siqueira Carvalho M. and Facklam R. R., Enterococcus, in Manual of Clin. Microbiol. 9th edition, di Murray P. R., Jo Baron E., Jorgensen J. H., Landry M. L., Pfaller M. A., Vol. 1 No. 30, p. 430-439 6. Pelli C., corso di Microbiologia SSMT , Dispense 2005-2006, p. 6-11 7. Rice L. B. and Bonomo R.A., Mechanisms of Resistance to Antibacterial Agents, in Manual of Clin. Microbiol. 9th edition, di Murray P. R., Jo Baron E., Jorgensen J. H., Landry M. L., Pfaller M. A., Vol. 1 No 71, p.1114-1145 8. Yao J. D. C. and Moellering R. C., Antibacterial Agents, in Manual of Clin. Microbiol. 9th edition, di Murray P. R., Jo Baron E., Jorgensen J. H., Landry M. L., Pfaller M. A., Vol. 1, No 70, p. 1077-1113 9. EARSS Annual Report 2006: http://www.rivm.nl/earss/Images/EARSS%202006%20Def_tcm61-44176.pdf 10. http://www.bd.com/ds/productCenter/spotlights/SP6.asp Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 22/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 9. Allegati 9.1 Soluzioni 9.1.1 Campioni e colture: • • Skim Milk: Skim Milk, BBL 10 g 70 ml H2Odem Sterilizzare 15 min a 120°C lasciar raffreddare ed aggiungere Calf serum, Sigma 10 ml Glicerolo, Fluka 20 ml Mescolare bene e conservare in frigo Agar Sangue: Columbia Agar Base, Oxoid 312 g H2Odem 7600 ml Sterilizzare 15 min a 120 °C raffreddare ed aggiungere Sangue montone, Mischler 400 ml Versare 20-25 ml nelle Petri con diametro di 90mm, conservare in frigo 9.1.2 Estrazione: • • • • • • Lisozima 10mg/ml: Lisozima (Roche) 10 mg H2Odem 1 ml Fare fresco ogni volta Tampone Te pH 8 (Tris-HCl 10 mM – EDTA 1mM): Tris base (Fluka) 1.211 g 0.372 g Na2EDTA.2H2O (Fluka) Aggiustare il pH a 8 H2Odem, aggiustare il volume a 1l Aliquotare e sterilizzare 15 min a 120 °C, conservare a TA (temperatura ambiente) SDS 10%: SDS (Fluka, Sigma) 10 g H2O 90 ml Scaldare a 68 °C per far sciogliere Aggiustare a pH 7.2 con HCl concentrato Portare a volume 100 ml Aliquotare e sterilizzare 15 min a 120 °C, conservare a TA Proteinasi K (8,3 mg/mL): Proteinasi K (Sigma) 25 mg H2O sterile 3 ml Aliquotare 200 µl e conservare a -20 °C NaCl 5M: NaCl (Fluka) 29.22 g H2O 80 ml Portare a volume 100 ml Aliquotare e sterilizzare 15 min a 120 °C, conservare a TA CTAB 10%: CTAB (Merck) 10 g NaCl 0.7 M (4.09 g in 100 ml H2O) 100 ml Aliquotare e sterilizzare 15 min a 120 °C, conservara a TA Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 23/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR • • • • Cloroformio/alcool isoamilico (24:1): Cloroformio (Merck) Alcool isoamilico (Fluka) Conservare a TA Fenolo/Cloroformio/Alcool isoamilico (25:24:1): Fenolo saturato in una soluzione TRIS pH 7.9 Cloroformio (Merck) Alcool isoamilico (Fluka) Conservare in frigo Isopropanolo freddo (Fluka) conservare a –20 °C Alcool 70%: Etanolo assoluto (Fluka-Merck) H2Odem Conservare a -20 °C 96 ml 4 ml 50 ml 48 ml 2 ml 70 ml 30 ml 9.1.3 Elettroforesi: • Tampone TBE 10x: Tris base (Fluka) Boric acid (Fluka) EDTA 0.5 M, pH 8 Portare a volume • EDTA 0.5 M, pH 8: Na2EDTA.2H2O (Fluka) H2Odem Aggiustare il pH a 8 Portare a volume • Tampone TBE 1x: Tampone TBE 10x H2Odem • Gel d’agarosio 1.5% (200 ml): Agarose LE (Roche) Tampone TBE 1x Sciogliere con microonde Aggiungere Bromuro d’etidio (1 µl/100 ml) • Bromuro d’etidio (10 mg/ml): Bromuro d’etidio H2O Far sciogliere sull’agitatore a lungo Tenere al buio • Loading Buffer 6x: Blu di bromotimolo (Merck) Xylene Cyanol Glycerol in H2O • PM 50 bp: Proporzione 2+2 Marker 50 bp(Roche) H2Odem • PM 100 bp: Proporzione 2+3 Marker 100 bp (Roche) H2Odem Astrea Rossetti TAB 3 – SSMT 108 g 55 g 40 ml 1l 18.61 g ~ 40 ml 100 ml 100 ml 900 ml 3g 200 ml 0.2 g 200 ml 0.25% 0.25% 30% 2 µl 2 µl 2 µl 3 µl 24/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR 9.2 Risultati Nr. Ceppi E 175 E 192 E 218 E 219 E 22 E 23 E 242 EN 24/07 EN 28/07 EN 33/07 E1 E 10 E 11 E 12 E 126 E 13 E 138 E 139 E 143 E 144 E 145 E 146 E 147 E 148 E 149 E 15 E 150 E 151 E 156 E 157 E 158 Nr. Routine U 48472 U 49335 R 50762 U 51065 VA 41824 VA 41826 VA 52654 EMO 26758 EMO 31673 VA 37995 G 40539 VA 41477 G 41405 G 41515 G 46590 G 41519 VA 46971 VA 46971 VA 47840 VA 47705 VA 47897 VA 46480 VA 47526 VA 47339 U 47964 G 41673 U 47976 G 48104 U 48110 U 48116 U 48135 Astrea Rossetti Provenienza OSG OSG OCL OCL FAI FAI OSG ODL OCL OCL OSG HILDEBRAND OCL Medico privato ODL Medico privato OSG OSG ODL ITA OCL ITA ITA ITA OCL OCL ODL OCL OCL OCL ODL Materiale uricult uricult lavaggio bronchiale uricult (catetere a dimora) st. ulcera sacrale st. ulcera caviglia st. ferita superiore emocolture emocolture catetere st. vaginale st. ferita st. vaginale st. cervicale sperma st. vaginale puntato periepatico puntato periepatico sperma st. ferita st. ferita st. ferita st. ferita profonda st. ferita profonda uricult (catetere) st. vaginale uricult sperma urina uricult uricult TAB 3 – SSMT ID Routine Enterococchi E. faecalis E. faecalis Enterococchi Enterococchi Enterococchi E. faecalis E. casseliflavus E. casseliflavus E. gallinarum E. faecalis Enterococchi Flora normale Flora normale Enterococchi Flora normale E. faecalis E. faecalis Enterococchi Enterococchi Enterococchi E. faecalis E. faecalis Enterococchi Enterococchi Flora normale Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi vancoscreen routine Van C2 Van C Van C1 ID Phoenix Enterococcus casseliflavus/gallinarum Enterococcus casseliflavus/gallinarum Enterococcus casseliflavus/gallinarum Enterococcus casseliflavus/gallinarum Enterococcus casseliflavus/gallinarum Enterococcus casseliflavus/gallinarum Enterococcus casseliflavus/gallinarum Enterococcus casseliflavus/gallinarum Enterococcus casseliflavus/gallinarum Enterococcus casseliflavus/gallinarum Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Antibiogram ma Phoenix R R R R R R R R R R S S S S S S S S I S S S S S S S S S S S S MULTIPL EX PCR geni Van neg neg neg neg neg neg neg VanC2 VanC2 VanC1 neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg Multiplex PCR faecium/ faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis Neg Neg Neg E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis 25/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR Nr. Ceppi E 159 E 16 E 160 E 164 E 166 E 167 E 168 E 169 E 17 E 170 E 174 E 176 E 177 E 178 E 179 E 18 E 180 E 181 E 182 E 183 E 184 E 185 E 189 E 19 E 190 E 193 E 195 E 196 E2 E 20 E 202 E 208 E 21 Nr. Routine VA 48152 VA 41513 VA 48358 VA 48408 G 48403 G 48508 G 48568 G 48733 VA 41554 G 48741 U 49000 U 49130 G 48974 G 48989 G 48997 VA 41610 U 49136 U 49147 U 49158 U 49179 U 49184 U 49197 U 49194 VA 41617 U 49260 U 49571 VA 49451 VA 49623 G 40556 G 41704 VA 50119 G 50373 G 41769 Astrea Rossetti Provenienza OBV OCL ODL OSG Medico privato ODL Medico privato OSG Medico privato OCL OBV OCL OBV OCL ODL OBV OCL HILDEBRAND OCL ODL ODL OSG OSG OBV OSG OCL ACQ ITA OCL OSG OSG ODL HILDEBRAND Materiale st. ulcera biopsia ossea uricult st. ascesso dorsale st. vaginale st. vaginale st. vaginale st. vaginale st. ulcera st. vaginale uricult uricult st. vaginale st. vaginale st. vaginale biopsia uricult uricult (catetere a dimora) uricult uricult uricult uricult uricult st. ferita uricult uricult st. ferita puntato ascesso epatico sperma st. vaginale puntato addominale sperma st. vaginale TAB 3 – SSMT ID Routine Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi Flora normale Flora normale Flora normale Flora normale E. faecalis Flora normale Enterococchi E. faecalis Flora normale Flora normale Flora normale Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi E. faecalis Enterococchi E. faecalis Enterococchi Flora normale Enterococchi Enterococchi Flora normale vancoscreen routine ID Phoenix Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Van neg Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Antibiogram ma Phoenix S S S S S S S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S MULTIPL EX PCR geni Van neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg Multiplex PCR faecium/ faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis 26/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR Nr. Ceppi E 212 E 213 E 216 E 217 E 220 E 234 E 236 E 238 E 243 E 25 E 26 E 27 E 28 E 286 E3 E 30 E 31 E 32 E 33 E 35 E 36 E 38 E 41 E 42 E 43 E 45 E5 E 51 E 52 E 53 E 54 E 55 E6 Nr. Routine VA 50713 VA 50714 G 50441 G 50709 U 51093 VA 51581 VA 51761 VA 52266 VA 52655 VA 41900 U 41811 U 42060 G 41960 U 982 VA 40435 G 42145 G 42150 G 42156 G 42159 G 42237 G 42243 G 42255 G 42385 G 42557 G 42558 G 42550 Va 41058 U 43297 U 43023 U 43098 U 43180 U 43095 U 41002 Astrea Rossetti Provenienza OSG OSG Medico privato ODL ODL OCL OSG OCL OSG OCL FAI OCL OCL ODL ODL OSG OSG OSG OCL OCL OCL OCL OSG Medico privato OSG Medico privato ITA ODL Medico privato ODL OSG ODL OCL Materiale puntato drenaggio AXION (sup) puntato drenaggio AXION (sup) st. vaginale sperma uricult st. ferita ulcera (arto inf dx) puntato addominale st. ferita profonda st. ferita superiore st. ferita profonda uricult uricult (catetere monouso) st. vaginale uricult (da sacchettino) biopsia ossea st. vaginale st. vaginale st. vaginale st. vaginale st. vaginale st. vaginale st. vaginale st. vaginale st. cervicale st. vaginale st. vaginale st. ferita profonda uricult uricult uricult uricult uricult uricult (catetere monouso) TAB 3 – SSMT ID Routine Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi Enterococchi E. faecalis E. faecalis Enterococchi Enterococchi Enterococchi Flora normale E. faecalis E. faecalis Flora normale Flora normale Flora normale Flora normale Flora normale Flora normale Flora normale Flora normale Flora normale Flora normale Flora normale Enterococchi E. faecalis E. faecalis Enterococchi Enterococchi Flora normale Enterococchi vancoscreen routine ID Phoenix Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Van neg Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Van neg Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Antibiogram ma Phoenix S S S S S S S S S S S S S S I S S S S S S S S S S S S R I S S S S MULTIPL EX PCR geni Van neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg Multiplex PCR faecium/ faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis 27/28 Identificazione degli Enterococchi e dei geni di resistenza Van tramite il sistema Phoenix e PCR Nr. Ceppi E 61 E 62 E 64 E 65 E 67 E7 E 77 E8 E9 E 94 E 96 E 97 EN 34/07 E 162 E 197 E 24 E 29 E4 E 66 E 95 E 100 E 37 E 44 E 34 Nr. Routine U 43462 U 43469 G 43476 G 43485 VA 43448-2 G 41148 G 43621 G 41194 G 41354 VA 45013-1 U 45114 U 45128 VA 40435 VA 48289 VA 49624 VA 41740 VA 41648 Va 40996 VA 43448-1 VA 45013-2 VA 45558 G 42247 G 42604 G 42234 Astrea Rossetti Provenienza OBV OCL ODL ODL OBV OSG ODL OBV OSG OBV OSG OCL ODL OBV ITA OSG OCL OSG OBV OBV OBV OCL OCL ODL Materiale uricult uricult sperma sperma biopsia st. vaginale sperma st. vaginale st. vaginale puntato pleurico uricult uricult biopsia ossea st. ferita profonda puntato ascesso epatico puntato ascesso duglas st. ferita st. bile biopsia puntato pleurico puntato ascesso pelvico st. vaginale st. vaginale st. vaginale TAB 3 – SSMT ID Routine Enterococchi E. faecalis Flora normale Enterococchi E. faecalis Flora normale Enterococchi Flora normale Flora normale E. faecalis Enterococchi Enterococchi E. faecalis E. faecium E. faecium Enterococchi E. faecium E. faecium E. faecium E. faecium Enterococchi Flora normale Flora normale Flora normale vancoscreen routine ID Phoenix Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Enterococcus faecalis Van neg Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Enterococcus faecium Van neg Enterococcus faecium Enterococcus raffinosus Streptococcus agalactiae (gruppo B) Streptococcus bovis II (gruppo D) Streptococcus mitis Antibiogram ma Phoenix S S S S S S S S S S S S I S S S S S S R non determ non determ non determ non determ MULTIPL EX PCR geni Van neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg neg ann ann ann Multiplex PCR faecium/ faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecalis E. faecium E. faecium E. faecium E. faecium E. faecium E. faecium E. faecium E. faecium ann ann ann 28/28