Facoltà di Medicina e Chirurgia
Cattedra e Scuola di Specializzazione
in Medicina Interna
Screening dei Pazienti del Network “Aterostop” per la Mutazione
Palermo – I G528D 1646 G-A (Esone 11) del LDL – R
Dr. Vittorio Emanuele
Matricola 68292
Screening dei Pazienti del Network Aterostop per la Mutazione
Palermo – I G528D 1646 G-A (Esone 11) del LDL – R
Premessa
Nonostante i notevoli progressi medico - scientifici degli ultimi anni, ad oggi le
malattie cardiovascolari rimangono la prima causa di morte nei paesi occidentali. Fra
i tanti fattori di rischio individuati uno dei più importanti è l’ipercolesterolemia. Lo
scenario del controllo dell’ipercolesterolemia è completamente cambiato con
l’avvento degli inibitori dell’HMG – Co A reduttasi, enzima di cui recentemente si è
riusciti a risolvere a 2.3 angstroms la struttura spaziale dei siti di legame con il
substrato (1). Tale evoluzione si deve alla potenza ed all’ottima tollerabilità di questi
farmaci, a cui recentemente si stanno affiancando non solo nuove generazioni di
composti noti (Rosuvastatina), ma anche nuove molecole con meccanismo di azione
completamente diverso (Ezetimibe)(2). Notevoli risultati sono stati raggiunti anche sul
fronte dello studio della patogenesi delle ipercolesterolemie: una parte di quest’ultime
sono dovute ad un difetto genetico a trasmissione autosomica dominante, che
colpisce il recettore delle LDL e che si riscontra con una frequenza 1/500 nella sua
forma eterozigote. La malattia è estremamente subdola, dato che decorre in maniera
a-sintomatica e che ha pochi segni: l’aumento dei valori di colesterolemia (questi
classicamente si attestano fra 350 e 550 mg/dl nei soggetti eterozigoti e possono
1
superare anche i 1000 mg/dl nei pazienti omozigoti) e, in alcuni casi, la presenza di
accumuli di colesterolo a livello cutaneo, tendineo e oculare. Questa elevata e
continua ipercolesterolemia produce gravi forme di aterosclerosi. Il gene del recettore
per l’LDL mappa sul cromosoma 19, dove si estende per una lunghezza di circa
45000 paia di basi, ed è costituito da 18 esoni e 18 introni. Il gene codifica per una
proteina di 839 amminoacidi. Il suo peso molecolare, subito dopo la sintesi, è di
120000 dalton ed arriva a 160000 dopo l’aggiunta di carboidrati nell’apparato di
Golgi; acquista, così, la sua definitiva conformazione tridimensionale e giunge (in
media 45 minuti dopo la sintesi) sulla superficie della membrana cellulare, a livello
delle fossette rivestite. L’identificazione del recettore si deve a J.L. Goldstein e M.S.
Brown nel 1974, in seguito alla scoperta che in fibroblasti in coltura la sintesi del
colesterolo era inibita dalle LDL ma non dalle HDL e che questo effetto inibitorio
delle LDL era assente nelle colture fibroblastiche provenienti da pazienti omozigoti
per l’ipercolesterolemia familiare. Dieci anni dopo gli stessi autori definirono la
struttura spaziale del recettore delle LDL (fig. 1), meritandosi il Nobel per la
medicina l’anno seguente(3).
La struttura del recettore si può dividere in cinque regioni o domains: cominciando
dal C-Terminale abbiamo la regione intracitoplasmatica, la regione della transmembrana, la regione legata agli oligosaccaridi, la regione omologa all’Epidermal
Gowth Factor e, infine, la regione ricca in cisteina, dove è presente il sito per il
legame del ligando. Il recettore si localizza a livello della membrana citoplasmatica
nelle zone dove sono presenti le fossette rivestite. Una volta legata l’LDL, il
2
complesso recettore - ligando entra nella cellula come una vescicola di endocitosi,
formando l’endosoma. A questo punto il recettore viene sganciato dall’LDL per
essere restituito alla membrana. L’endosoma subisce, quindi, un processo di
acidificazione che lo trasforma in lisosoma. A questo punto l’apolipoproteina B viene
digerita dagli enzimi lisosomiali, mentre il colesterolo viene liberato all’interno della
cellula, dove rimane disponibile per la costruzione delle membrane cellulari e per le
altre funzioni fisiologiche tessuto - specifiche. Fra l’altro, i livelli di colesterolo
intracellulare influenzano negativamente l’attività enzimatica dell’HMG – Co A
reduttasi, che regola, appunto, la produzione endogena di colesterolo. Sebbene ogni
domain svolga un ruolo nell’economia della struttura recettoriale, le regioni più
importanti sono sicuramente quella deputata al legame con il ligando, quella che
àncora il recettore alla membrana e quella intracitoplasmatica. Quest’ultima risulta
indispensabile per il legame con le strutture delle fossette rivestite e con la clatrina,
per lo svolgimento dell’endocitosi mediata dal recettore e la successiva formazione di
endosomi prima e lisosomi poi. Ovviamente, una mutazione sul gene del recettore,
che causa un’alterazione della sequenza amminoacidica, in alcuni casi produce lo
sconvolgimento dell’architettura tridimensionale del recettore, con conseguente
perdita o diminuzione della funzione della regione interessata. Così si possono avere
recettori che non si agganciano alla membrana o che, pur agganciandosi, non
riescono a legare il ligando o che, pur legando correttamente le LDL, non riescono a
venire internalizzate all’interno della cellula (fig. 2). Recenti studi hanno evidenziato
come le mutazioni del gene del recettore per le lipoproteine a bassa densità (LDL –
3
R) abbiano la tendenza a clusterizzare in determinate aree geografiche, fra cui anche
in Italia (dove sono presenti diversi cluster al Nord, al Sud, nelle Isole (4)) e in
Grecia(5). Nonostante ciò, nessun cluster è stato riscontrato fino ad ora in Calabria
(fig. 3 e 4). Proprio in questa regione da qualche mese è attivo un Network Regionale
per lo studio e la cura delle iperlipidemie familiari denominato “Aterostop”,
approvato dalla Regione Calabria.
Metodi
Dei circa 1000 pazienti, arruolati nei primi sei mesi di attività del Network
“Aterostop”, ne sono stati selezionati 42 appartenenti a 23 famiglie, tutti con diagnosi
fenotipica
di
Ipercolesterolemia
Familiare
Eterozigote,
con
familiarità
per
iperlipidemia, con valori di colesterolo maggiore di 290 mg/dl e trigliceridemia
normale. Sei dei pazienti in esame presentavano anche xantomatosi tendinea. Il DNA
di questi pazienti è stato estratto mediante l’uso del Kit MIDI della Qiagen, archiviato
e conservato a +4C°. Fra le tante mutazioni descritte per questo gene (circa 700), è
stata scelta la G528D 1646 G – A dell’esone 11 a causa della particolare genetica di
popolazione di tale mutazione. Quest’ultima, infatti, in base ai dati della letteratura
risulta essere molto frequente nel Sud – Italia e nelle zone costiere della Grecia. Ci è
sembrato ragionevole cercare in Calabria questa mutazione e non un'altra a causa
dell’elevata omogeneità di popolazione esistente fra queste zone. Nonostante la
4
presenza in letteratura di un protocollo per lo screening della mutazione in questione,
si è preferito, per motivi di costo e di semplicità tecnica, svilupparne uno ex-novo
(l’analisi della regione del gene è riportata nella tavola I):
- Amplificazione
Mix per singola PCR e per 50µl di amplificato:
• 5µl PCR Buffer 10X (Qiagen)
• 4µl dNTP’s
• 2µl Primer F (N543H) 10µM
• 2µl Primer R (Mut. G528D) 10µM
• 0.25µl Super TAQ Polimerasi (Qiagen)
• 33.75µl dH2O
• 3µl DNA
Primer F (F – N543H):
5’ CTC-CCC-CGC-CCT-CCA-GCC-TCA-CAG-C- 3’
Primer R (G528D – mut – R):
5’ CGC-CCG-CCG-CGC-CCC-GCG-CCC-GTC-CCG-CCG-CCC-CCG-CCC-G
AG-TCA-CCA-GCG-AGT-AGA-TGT-CCA-GA- 3’
5
Programma Termico (27 cicli):
• 94°C per 1 minuto
• 65°C per 2 minuti
• 72°C per 1 minuto
- Digestione
Mix per singola digestione con l’uso di 40µl di prodotto di PCR:
• 4µl NEB Buffer Dpn II (BioLabs)
• 0.6µl Dpn II 10000U/ml (BioLabs)
• 40µl Prodotto di PCR
Condizioni di digestione: 37°C /12h.
- Separazione
La separazione avverrà tramite elettroforesi orizzontale a immersione convenzionale
per 45 Minuti a 130 Volt in Gel di Agarosio al 5% (250ml di gel-buffer, 12,5g di
Agarosio e 15µl di Ethidium Bromuro), usando i pettini ampi che creano i pozzi per
caricare nel gel 35µl di Prodotto di Digestione e 5µl di Loading Buffer (40µl Tot.).
In uno dei pozzetti centrali verrà caricato il Marker.
- Lettura Gel
Retroilluminatore ad UV
6
Risultati
Il protocollo di screening sviluppato per questa mutazione ci ha permesso di fare
diagnosi genetica grazie alla presenza di ben due bande mutagene, portando a quattro
il loro numero nei pazienti positivi, contro le due dei pazienti negativi. Questo
consente un’agevole diagnosi genetica del difetto. I risultati sono stati davvero
inaspettati, soprattutto dato l’esiguo numero di pazienti screenati (42) e considerato
l’elevato numero di mutazioni fino ad ora descritte per questo gene. Sono risultati
positivi in eterozigosi per la mutazione Palermo I G528D quattro pazienti (fig. 5, 6 e
7-10), di cui tre correlati tra loro (2 famiglie). L’elevata percentuale di positività
(9,5% dei pazienti, 8,7% delle famiglie) farebbe sospettare la presenza di un’elevata
incidenza di questa mutazione in Calabria e, probabilmente, la sua tendenza a
clusterizzare, come avviene in Campania, in Sicilia e nelle zone costiere della Grecia.
Va precisato che una delle famiglie positive aveva origini campane, in linea con
l’elevata omogeneità di popolazione di buona parte del Sud – Italia. Dalle figure è
possibile notare, inoltre, l’assoluta non contaminazione della reazione di
amplificazione testimoniata dal pozzetto “bianco”, oltre l’uguaglianza con il controllo
positivo. Si noti che il primer F usato per le prime reazioni era provvisto anche di
sequenza CG-Clamp, dato che si aveva intenzione di studiare l’esone 11 di questi
pazienti anche con la DGGE. Le reazioni di amplificazione con questo primer, però,
erano molto scadenti e la sostituzione con il primer N543H, senza CG-Clamp, ha
risolto tutti i problemi. È in corso, presso la nostra Unità Operativa, un ampliamento
7
dello screening di questa mutazione col fine di accertare l’eventuale presenza di
questo cluster anche in Calabria. Per dimostrare il cluster, infatti, è necessaria la
presenza di almeno 5 individui positivi per la stessa mutazione, come riportato in
letteratura(4).
Conclusioni
Il 9,5% dei pazienti screenati (8,7% delle famiglie) è risultato essere portatore
eterozigote della mutazione G528D del gene del recettore per le lipoproteine a bassa
densità (LDL – R). Questo risultato suggerisce la presenza di un’elevata prevalenza
di questa mutazione in Calabria, in accordo con i dati del Sud – Italia e della Grecia.
La dimostrazione dell’esistenza di un cluster aprirebbe la strada per studi di genetica
della popolazione anche nella nostra regione, al fine di compilare una mappa delle
mutazioni più frequenti e, quindi, facilmente screenabili. Dato l’elevato numero delle
mutazioni di questo gene, come abbiamo ricordato sopra, avere una mappa della
frequenza delle mutazioni in relazione alle aree geografiche consente di diminuire i
costi e il tempo dello screening nei soggetti con diagnosi fenotipica e nei loro
familiari. E’ inutile, infatti, ricordare il vantaggio di avere una diagnosi genetica in
età giovanile, quando ancora il fenotipo non è manifesto.
8
Bibliografia
1. ISTVAN AND DEISENHOFER, Sterically Stopping Cholestrol Synthesis, Science
292, 5519.
2. Poster al 78° Congresso dell’EAS.
3. J.L. GOLDSTEIN AND M.S. BROWN, Sci Am 1984; 251:258.
4. S. BERTOLINI, A. CANTAFORA, M. AVERNA, C. CORTESE, C. MOTTI, S.
MARTINI, G. PES, A. POSTIGLIONE, C. STEFANUTTI, I. BLOTTA, L. PISCIOTTA,
M. ROLLERI, S. LANGHEIM, M. GHISELLINI, I. RABBONE, S. CALANDRA,
Clinical Expression of Familial Hypercholesterolemia in Clusters of Mutations
of the LDL Receptor Gene That Cause a Receptor-Defective or ReceptorNegative Phenotype, ATVB 2000; 20:e41-e52.
5. JOANNE TRAEGER, SYNODINOS, NICHOLAS MAVROIDIS, EMMANUEL
KANAVAKIS, EURYDIKI DROGARI, STEVE E. HUMPHRIES, IAN N. M. DAY,
CHRISTOS KATTAMIS, NICHOLAS MATSANIOTIS, Analysis of low density
lipoprotein receptor gene mutations and microsatellite haplotypes in Greek FH
heterozygous children: six independent ancestors account for 60% of
probands, Hum Gen 1998: 102; 343-347.
6. DURRINGTON, Le Iperlipidemie. Diagnosi e trattamento, Manchester 1999.
7. T.R. HARRISON et alii, Principi di Medicina Interna, USA 1999.
8. D. GALTON AND W. KRONE, Le iperlipidemie nella pratica clinica, Milano
1996.
9. J.L. GOLDSTEIN AND M.S. BROWN, A receptor-mediated pathway for
cholesterol homeostasis, Science, 232, 34-47, 1986.
9
Tavole e Figure
10
Fig.1
Struttura del recettore per le LDL
11
FIG. 2
Struttura del Gene LDL - R
12
Fig.3
GRECIA. In rosso
sono segnati i
luoghi dove è stato
possibile
dimostrare
l’esistenza di
cluster per la
mutazione G528D
del LDL - R
13
Fig.4
Cluster Italiani
• G528D
• Altri
Famiglie
individuate nel
corso del
nostro
screening
14
Fig.5
Il gel agli
UV: sono
visibili 3
positivi
oltre il
controllo, il
marker e il
bianco
15
Fig.6
BIANCO
NEGATIVO
NEGATIVO
POSITIVO
Controllo
Positivo
Frammenti DNA
nell’Eterozigote:
• 87 bp
• 88 bp
• 67bp
• 21 bp
16
PCR Product = 172 bp
Frammenti
DNA nel
sano:
• 87 bp
• 88 bp
Frammenti DNA
nell’Eterozigote:
• 87 bp
• 88 bp
• 21 bp
• 67 bp
Primer F
2.5kb
FH122 (e11) T-----------TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGATCCTCCCCCGCCC
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
ACGTCCAGCTGAGATCTCCTAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTAGGAGGGGGCGGG
A
A
FH12(e11) C-----------------------G
------C
#exon11
TCCAGCCTCACAGCTATTCTCTGTCCTCCCACCAGCTTCATGTACTGGACTGACTGGGGA
---------+---------+---------^1587--------^1600 -----+
AGGTCGGAGTGTCGATAAGAGACAGGAGGGTGGTCGAAGTACATGACCTGACTGACCCCT
G
MUTAZIONE
Frammenti DNA
nell’Omozigote:
• 87 bp
• 21 bp
• 67 bp
II Sito di taglio non specifico
21 bp
F
M Y W T D W
510-----------YWTD
27 bp
G
12bp
60bp
-
Primer R
Mutagenico
A C
ACTCCCGCCAAGATCAAGAAAGGGGGCCTGAATGGTGTGGACATCTACTCGCTGGTGACT
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TGAGGGCGGTTCTAGTTCTTTCCCCCGGACTTACCACACCTGTAGATGAGCGACCACTGA+
15 bp
40 bp
TG
T P A K I K K G G L N G V D I Y S L V T Clamp
520
530
528
Tavola I
17
Fig. 7
Confronto fra un
paziente negativo a
sinistra e uno positivo
a destra
18
Fig. 8
Confronto fra
negativo,
positivo e bianco,
rispettivamente
da sinistra verso
destra
19
Fig. 9
Due dei
tre
positivi
rilevati
da questo
gel
20
Fig. 10
Immagine dello
stesso gel a
colori invertiti
21
