Relazione dottorato - Sezione di Farmacologia

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI BRESCIA
Dipartimento di Medicina Molecolare e Translazionale
Sezione di Farmacologia
Relazione di Dottorato in Neuroscienze IV anno
Anno Accademico 2012/2013
Coordinatore: Prof.ssa Cristina Missale
Supervisor: Dott.ssa Arianna Bellucci
Dottaranda: Laura Navarria
Introduzione
La malattia di Parkinson (MP) è il disordine neurodegenerativo a sintomatologia motoria
più diffuso e la sua gestione terapeutica ed assistenziale ha un forte impatto socioeconomico sull’ economia dell’Unione Europea (Olesen et al., 2012). Il cervello dei
pazienti affetti da MP è caratterizzato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici del
siatema nigrostriatale (Hornykiewicz et al., 1998), e dalla presenza di Corpi di Lewy (CL),
inclusioni intracitoplasmatiche insolubili di natura proteica il cui principale componente è
alfa-synucleina (AS) (Spillantini et al., 1998). AS è una proteina solubile di 140 aa con una
struttura “unfolded”, il cui ruolo fisiologico non è ancora del tutto chiaro anche se numerosi
studi indicano che ha un ruolo cruciale nel controllo della funzionalità sinaptica (Bellucci et
al., 2012). L’overespressione o alterazioni post-traduzionali di AS quali fosforilazioni,
nitrosilazioni e taglio della sua porzione carbossi-terminale ne inducono il cambiamento
conformazionale stabilizzandola in una conformazione a β-foglietto con conseguente
formazione di strutture fibrillari aggregate che compongono i CL. La presenza di queste
strutture alterate inducono una perdita della funzionalità della proteina a livello sinaptico
che causano le disfunzioni tipiche della patologia. Dato che mutazioni e moltiplicazioni a
carico del gene che codifica per AS (SNCA) sono responsabili dell’insorgenza di forme
familiari di MP a carattere autosomico dominante è stato ipotizzato che l’aggregazione di
AS possa essere uno dei meccanismi patogenetici più importanti della malattia. A
conferma di questa ipotesi è stato dimostrato che la progressione della MP correla con la
diffusione dei CL a livello dei pazienti affetti da MP (Braak and Braak 2000). La presenza
selettiva dei CL solo in particolari tipologie neuronali delinea uno specifico e caratteristico
“pattern” di lesione bilaterale e simmetrico nei cervelli dei pazienti (Braak and Braak 2000)
anche se non è ancora chiaro il motivo che determina una specifica vulnerabilità di
particolari neuroni alla formazione di CL.
Oltre ad essere presente a livello intracitoplasmatico, AS è una proteina che è presente
solubile anche a livello extracellulare (Emmanouilidou et al., 2010; Lee et al., 2005) e nel
fluido cerebro spinale (CSF) in pazienti sani e affetti da MP (El-Agnaf et al. 2006;
Mollenhauer B et al., 2011). Inoltre, recenti studi indicano che AS in forma “misfolded” è in
grado di passare da cellula a cellula, ed è stato ipotizzato che attraverso meccanismi
similari a quelli adottati dalle proteine prioniche, possa indurre l’aggregazione dell’AS nelle
cellule riceventi (Dunning et al., 2013; Goedert et al., 2010).
Diverse evidenze sperimentali supportano questa ipotesi, infatti, in pazienti che hanno
ricevuto trapianti di cellule staminali è stato osservata la formazione di aggregati di AS e
segni di neurodegenerazione nelle cellule trapiantate (Kordower et al., 2011). Inoltre, topi
trattati con somministrazione intragastrica del pesticida rotenone, una tossina che è nota
indurre parkinsonismo, sviluppano aggregati patologici di AS a livello del sistema nervoso
enterico, nel nucleo motore dorsale del nervo vago e nella sostanza nera (Pan Montojo et
al., 2010) analogamente a quanto è stato osservato in pazienti affetti da MP
(Wakabayashi et al., 1990).
E’ importante quindi sottolineare che AS ha diverse caratteristiche in comune con le
proteine prioniche: 1) AS può assumere diverse conformazioni; 2) AS può essere
trasmessa da cellula a cellula anche mediante vescicole esosomiali e 3) l’AS aggregata
può propagare “in vivo” nel cervello.
La trasmissione di AS è quindi di fondamentale importanza per la patofisiologia della MP.
La trasmissione può avvenire in due modi: AS puo essere internalizzata con meccanismi
esocitosi dipendente o esocitosi indipendente (Ahn K. J. et al., 2006; Volpicelli-Daley L. A
et al., 2011). Lo scopo di questo studio è stato quello di dimostrare i meccanismi che
mediano la captazione di AS in forma esosomiale o in forma solubile. E’ stato pertanto
valutata la trasmissione sia di AS wt che di una delle sue forme patologiche ossia AS
tronca a livello carbossi-terminale della lunghezza di 120 aa (AS120) in modelli cellulari
immortalizzati e in colture primarie di neuroni. AS120 costituisce il “core” dei CL (Prasad
et al., 2012) in quanto la perdita della porzione carbossi-terminale induce la proteina ad
assumere una conformazione β-sheet responsabile della produzione di strutture fibrillari e
aggregazione (Uversky et al., 2007).
Scopo del lavoro
Questo studio ha avuto lo scopo di caratterizzazione dei meccanismi che mediano la
captazione di AS in forma solubile o mediante vescicole esosomiali.
In particolare i fini specifici delle ricerche effettuate sono stati:
-
Valutare la trasmissione cellula-cellula di AS120, AS140 in cellule HEK 293 e nella
linea di neuroblastoma umano SK-N-SH.
-
Caratterizzare la presenza di AS nella frazione esosomiale derivante da terreni delle
colture primarie di neuroni corticali preparate da topi neonati (P0) del ceppo C57BL6/J
e di topi transgenici per la forma tronca a livello carbossi-terminale di AS della
lunghezza di 120 aa (tgSYN120).
-
Valutare la captazione di AS nella sua forma wt e tronca sia in forma solubile che
esosoma-mediata in colture primarie di neuroni corticali preparate da topi neonati del
ceppo C57BL6/J Ola/Hsd che presenta una delezione spontanea del locus che
codifica per AS.
-
Studiare se AS endocitata possa venire trasmessa in via retrograda al golgi e reticolo
endoplasmatico in cellule prive di AS (SK-N-SH e HEK 293) inoculate con la frazione
esosomiale proveniente da cellule esprimenti AS (SK-N-SH-SYN120 e HEK 293SYN120).
Materiali e metodi
Preparazione colture cellulari
Le colture neuronali primarie sono state preparate mediante dissezione dell’encefalo di
topi C57BL/6J neonati al giorno 0. In breve, i topi neonati sono stati decapitati, il cranio
passato velocemente in etanolo 70% e poi mantenuti in soluzione Dulbecco Phosphate’s
Buffered Saline (D-PBS)(Sigma-Aldrich, Milano, Italia) posta su ghiaccio. I singoli cervelli
sono stati trasferiti in piastre Petri da 3 cm Ø con soluzione D-PBS ghiacciata dove è stata
svolta la dissezione della corteccia. Le diverse porzioni sono state raccolte in terreno di
coltura completo posto su ghiaccio composto da Neurobasal-A medium (Gibco, Milano,
Italia), Penicillina/Streptomicina 100X, glutammina (0.5 mM) e B27 (50X). Il tessuto è stato
raccolto in provette falcon da 15ml contenente 5 ml di terreno di coltura scaldato a 37°C.
Le cellule sono state poi dissociate meccanicamente e centrifugate a 800 x g. La conta
cellulare e il saggio della vitalità sono stati eseguiti utilizzando il colorante Trypan Blue che
permette di escludere la conta delle cellule morte (Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Per i
protocolli di immunocitochimica (ICC) e western blotting (WB) le cellule sono state
coltivate rispettivamente in piastre multi pozzetto da 24 su vetrini con coating di Poly-Dlisina (14 µg/mL) (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) (70000 cellule/vetrino) o in piastre Petri da
3 cm Ø con coating di Poly-D-lisina (10 µg/mL) (800000 cellule/piastra). Le cellule sono
state mantenute ad una temperatura di 37°C in un’atmosfera contenente dal 5% CO2 e
95% O2 in terreno completo per 11 giorni in vitro (DIV11).
ICC
Al termine degli esperimenti le cellule sono state fissate grazie all’incubazione per 15 min
in 4% paraformaldeide/3% saccarosio preparato in tampone fosfato salino (PBS) 1M pH
7.4 e poi conservate in PBS contenente 0.05% di Na-Azide. I vetrini venivano incubati per
10 min in una soluzione permeabilizzante contenente metanolo al 20% e in seguito
incubati per 30 min a R.T. in soluzione di blocco composta da 3% di albumina serica
bovina (BSA) più 2% Normal Goat Serum (NGS) (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) in PBS 1M
+TritonX-100 0.1%. I vetrini sono stati mantenuti O.N. a 4°C con l’anticorpo primario
opportunamente diluito in soluzione di blocco. Il giorno seguente le cellule sono state
incubate per 1 h a R.T. con l’anticorpo secondario fluorescente diluito alla concentrazione
ottimale in PBS 1M + TritonX-100 0,1% con l’aggiunta di 1% di BSA. Per i protocolli di
doppia marcatura alla fine di questa incubazione le cellule sono sottoposte ad un altro
ciclo di marcatura con un ulteriore anticorpo primario. I nuclei cellulari sono stati infine
contro colorati con HOECHST 2495 (Sigma Aldrich, Milano, Italia). I vetrini sono stati infine
montati su vetrini coprioggetto mediante l’utilizzo del montante specifico per fluorescenza
vectashield (VECTOR Laboratories, Burlingame, CA, USA).
Western blot
Per estrarre le proteine di interesse le cellule o tessuti sono state lisate usando RIPA
buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% Na deossicolato, 0.1% Na
dodecilsolfato, 2 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, 1 mM N-ethylmaleimide, Na Ortovanadato 1
mM, 1% Nonidet P40, NaF 1 mM più un mix completo di inibitori delle proteasi (Roche
Diagnostics, Mannheim, Germany)). La concentrazione proteica dei campioni è stata
misurata grazie alla metodica di Bradford (Pierce, Rockford, IL, USA). Uguali quantità di
proteine (30 µg) sono state caricate e corse su un gel 4-12% Nu-PAGE Novex Bis-Tris
(Invitrogen, Milano, Italia).
Trattamenti con frazione solubile ed esosomiale di AS
In questo studio sono state utilizzate cellule della linea HEK 293 di derivazione renale che
fisiologicamente non esprimono AS e che quindi presentano un fenotipo (AS free). Le
cellule HEK 293 sono state poi trasfettate stabilmente con un plasmide per l’espressione
della forma AS120 (HEK 293-SYN120). Sono state inoltre utilizzate anche cellule della
linea di neuroblastoma umano SK-N-SH che non esprimono fisiologicamente AS. Le
cellule SK-N-SH sono state anche queste transfettate stabilmente con il trangene AS120
(SH-N-SH-SYN120). Per valutare il trasferimento di AS da una cellula all’altra i terreni
condizionati (TC) di cellule transfettate sono stati prelevati, gli esosomi sono stati isolati e
successivamente incubati nei rispettivi modelli AS free.
Infine, sono stati utilizzate colture primarie di neuroni corticali preparati da topi neonati
(P0), provenienti da topi che non esprimono il gene di AS (C57BL6/S), da topi “wild type”
che esprimono “fisiologicamente” AS (C57BL6/J), e da topi transgenici che overesprimono solo la forma patologica tronca di AS (AS120) umana (SYN120). La frazione
esosomiale (Eso) e la frazione extra-esosomiale (Extra-eso) dei terreni provenienti da
colture
primarie
neuronali
corticali
C57BL6/J
e
SYN120
(conteneti
AS/AS120
extracellulare) sono state inoculate in colture neuronali proveninti da C57BL6/S che non
presentano AS. I terreni somministrati sono stati prima processati, in modo tale da
somministrare solo gli Eso o la parte Extra-eso del terreno secondo lo schema riportato in
fig 1. La frazione esosomiale delle colture di C57BL6/J è stata inoltre caratterizzata su
gradiente di saccarosio (0.25-2M) in modo da purificare la frazione 0.95M che è quella
maggiormente ricca in vescicole esosomiali. L’incubazione selettiva della frazione Eso e
della frazione Extra-eso nelle cellule prive di AS ha permesso di discriminare se c’è una
preferenza di meccanismo (esosoma dipendente o indipendente) per la diffusione cellulacellula della forma fisiologica o patologica di AS.
Figura 1 Schematizzazione della separazione della frazione esosomiale (Eso) e extra-esosomiale (Extra-eso) partendo da
colture neuronali primarie da puppies (DIV7) di topi C57BL6/S, C57BL6/J e SYN120.
Risultati
AS era rilasciata nello spazio extra-cellulare e veniva trasmessa da una cellula all’altra.
Come primo esperimento pilota le cellule SK-N-SH sono state incubate per 24h con il
terreno condizionato (TC) di cellule SK-N-SH-SYN120 contenente AS120. Mediante studi
di immunocitochimica è stato possibile osservare che AS120 era presente all’interno delle
cellule SK-N-SH che erano state esposte al TC (Figura 2B) mentre nelle cellule di controllo
non si osservava nessun segnale (Figura 2C). Nel pannello A, invece è mostrata la
marcatura di AS nel controllo positivo di cellule SK-N-SH-SYN120.
Figura 2 Marcatura di AS con fluorocromo CY3 di A) Cellule SK-N-SH-SYN120; B) Cellule SK-N-SH tenute 24h in coltura
con il TC derivato da cellule SK-N-SH-SYN120 C) Cellule SK-N-SH
AS veniva internalizzata con meccanismi esosoma-dipendenti
I terreni delle cellule SK-N-SH-SYN120 sono stati processati per isolare la frazione
esosomiale. La frazione esosomiale è stata poi diluita nel terreno di coltura di cellule SKN-SH. I risultati ottenuti hanno permesso di verificare che AS120 era presente a livello
intracellulare nelle cellule SK-N-SH trattate con la frazione esosomiale derivata dal terreno
di cellule SK-N-SH-SYN120 (Figura 3 E).
Successivamente abbiamo valutato se AS120 fosse localizzata a livello del RE. Con studi
di doppia marcatura in fluorescenza è stato possibile valutare la co-localizzazione di
AS120 in rosso e il marcatore del RE glucose regulated protein 78 (GRP78) in verde
(Figura 3 H).
Esperimenti di WB (Figura 3O) svolti in cellule HEK 293 hanno dimostrato che cellule HEK
293 (lane 2) trattate con la frazione esosomiale derivata da terreno di cellule HEK 293
SYN120 (lane3) incorporavano gli esosomi conteneti AS120 a livello del RE (lane 6).
Figura 3 Immunocitochimica per AS (anticorpo SYN1) con fluorocromo CY3 e GRP78/Bip con fluorocromo FITC in cellule
SK-N-SH (A-D), in cellule SK-N-SH trattate per 24 ore con la frazione esosomiale derivata dal terreno di cellule SK-N-SHSYN120 (E-H) e in cellule SK-N-SH-SYN120 (I-N). WB (anticorpo SYN1) in cellule HEK 293 trattate con esosomi derivati
dal terreno di HEK 293-SYN120 (O). Lane 1: estratto totale di HEK 293 (controllo negativo); Lane 2: estratto totale di HEK
293-SYN120 (controllo positivo); Lane 3: frazione esosomiale derivata da terreno di HEK 293; frazione esosomiale derivata
dal terreno di HEK 293-SYN120; Lane 5: Estratti proteici reticolari di cellule HEK 293 trattate con la frazione esosomiale
derivata dal terreno di HEK 293; Lane 6: Estratti proteici reticolari di cellule HEK 293 inoculate con la frazione esosomiale
derivata dal terreno di HEK 293-SYN120.
La trasmissione esosoma-dipendente di AS120 è stata studiata anche nelle cellule HEK
293 (Figura 4). I risultati degli esperimenti di WB indicano che cellule HEK 293 trattate per
24 h con la frazione esosomiale derivate dal terreno di cellule HEK 293-SYN120 (Figura 4
D-F) mostravano la presenza di segnale immunopositivo per AS a livello intracellulare.
Questo segnale era molto diverso rispetto a quello che si osservava in cellule HEK293SYN120 (Figura 4G-I) che non era invece presente in cellule HEK-293 non trattate (Figura
4A-C).
A
B
C
HEK 293
D
E
F
HEK 293
+Eso
H
G
I
HEK 293
SYN120
SYN1
Hoecst
Merge
Figura 4 Immunocitochimica per AS in cellule Hek2 93 (A-C), in cellule Hek 293 trattate con la frazione esosomiale del
terreno derivato da cellule Hek 293-SYN120 (D-F), in cellule Hek 293-SYN120
Caratterizzazione della frazione esosomiale
La frazione esosomiale derivata da cellule corticali preparate da topi neonati (P0) e
mantenute in coltura “in vitro” per 7 giorni (DIV7) è stata caratterizzata su gradiente di
saccarosio. Il gradiente di saccarosio (0,25-2M) permette di separare organelli con diversa
densità. In particolare è noto che gli esosomi, per le loro caratteristiche biochimiche,
migrano nel gradiente di saccarosio fino a collocarsi nella frazione con concentrazione
0,95M (Ghidoni et al., 2009). Dall’analisi qualitativa delle bande di WB (figura 5) che
mostra il contenuto proteico di ciascuna frazione del gradiente di saccarosio è possibile
osservare che i marcatori esosomiali Alix e Tsg101 mostravano la presenza predominante
di esosomi nella frazione 0,95M in linea con la letteratura. Analogamente AS il cui segnale
di immunopositività è stato rilevato con l’anticorpo SYN1 era localizzata nel gradiente 0.95
M. Quest’ultima osservazione indica che AS, in linea con precedenti osservazioni derivanti
dalla letteratura (Emmanouilidou et al., 2011; Melachroinou et al., 2013), viene
probabilmente veicolata a livello extracellulare mediante vesciole esosomiali
Figura 5 Frazionamento della porzione esosomiale del terreno di cellule primarie corticali derivati da topi C57BL6/J in
gradiente di saccarosio (0,25-2M).
AS può venire trasmessa da neurone a neurone
Abbiamo infine valutato se AS wt e AS120 potessero essere trasmesse da un neurone
all’altro. A questo scopo, i terreni di coltura di colture primarie di neuroni corticali di topi
C57BL6/J (CXJ), C57BL6/S (CXS) e C57BL6/SYN120 (CXSYN120) sono stati processati
per ottenere la frazione esosomiale (Eso) e il restante terreno privo di esosomi (Extra-Eso)
secondo lo schema previamente rappresentato in Figura 1. Inoculando per 24h la frazione
Eso o la frazione Extra-Eso del terreno dei neuroni CX/J e di CX/SYN120 in cellule CX/S
prive di AS, possiamo valutare la sussistenza del trasporto di AS dallo spazio extracellulare all’interno del neurone. I risultati ottenuti dagli esperimenti di WB hanno
dimostrato che i neuroni CX/S erano in grado di internalizzare AS wt solubile (Figura 6
lane 4) in accordo con altri lavori in letteratura (Ahn et al., 2006), sia quella trasportata
mediante esosomi (Figura 6 lane 5). AS120 invece, veniva unicamente internalizzata nei
neuroni trattati con la frazione esosomiale (Figura 6 lane 6) mentre non è stata osservata
alcuna positività per AS nelle cellule CX/S trattate con la frazione Extra-eso dei topi
CX/SYN120 (Figura 6 lane 7). I risultati ottenuti sono stati schematizzati in figura 7.
Figura 6 WB per AS (anticorpo SYN1) . Lane 1 Estratto proteico totale di cellule CX/S; Lane 2 Estratto proteico totale di
cellule CX/J; Lane 3 Estratto proteico totale di cellule CX/SYN120; Lane 4 Estratto proteico totale di cellule CX/S trattate
per 24h con la frazione esosomiale di CX/J; Lane 5 Estratto proteico totale di cellule CX/S trattate per 24h con la frazione la
frazione Etra-esosomiale di CX/J; Lane 6 Estratto proteico totale di cellule CX/SYN120 trattate per 24h con la frazione
esosomiale di CX/SYN120; Lane 7 Estratto proteico totale di cellule CX/S trattate per 24h con la frazione la frazione Etraesosomiale di CX/SYN120; Lane 8 Estratto proteico totale di cellule CX/S trattate per 24h con la frazione la frazione Etraesosomiale di CX/S
Figura 7 Schematizzazione dei risultati ottenuti con l’esperimento mostrato in figura 6
Discussione
I dati preliminari ottenuti dalle cellule SK-N-SH ed HEK 293 indicano che AS e in
particolare AS120 può venire trasmessa da una cellula all’altra. Infatti, quando AS viene
introdotta nel terreno di cellule prive di AS, la proteina viene internalizzata a livello
intracellulare. AS viene rilasciata a livello extracellulare sia in forma solubile che all’interno
di vescicole esosomiali. Trattando cellule prive di AS esclusivamente con la frazione
esosomiale è stato possibile osservare che AS viene internalizzata dalla cellula con un
meccanismo esosoma dipendente. Precedenti studi hanno dimostrato che sia la forma wt
che tronca di AS sono in grado di indurre morte cellulare attivando l’ “unfolded protein
response” (UPR), una risposta correlata a meccanismi di stress reticolare che si attiva
quando proteine a struttura terziaria non definita si accumulano nell’ER e legano il sensore
di stress reticolare GRP78 (Bellucci et al., 2011). L’attivazione dell’UPR è uno dei
meccanismi neurotossici che le proteine prioniche possono attivare nelle cellule infettate
(Shi and Dong 2011). I risultati ottenuti indicano che AS internalizzata può venire
trasmessa in via retrograda nel compartimento ER-Golgi. Nonostante siano necessari
ulteriori esperimenti per determinare se AS internalizzata sia in grado di attivare l’UPR
queste osservazioni suggeriscono che la trasmissione di AS potrebbe essere in grado di
attivare l’UPR nei neuroni riceventi e quindi innescare meccanismi proapototici.
Infine i risultati ottenuti dagli esperimenti eseguiti utilizzando colture primarie di neuroni
corticali hanno permesso di valutare se AS in forma wt e tronca vengano rilasciate ed
internalizzate in forma solubile o mediante esosomi. I risultati ottenuti indicano che sia la
foma solubile che la frazione esosomiale di AS wt possono venire trasmesse da neurone a
neurone, mentre AS-SYN120 può venire internalizzata solo mediante vescicole esosomiali
suggerendo un meccanismo di trasporto selettivo per questa forma della proteina che ha
un’elevato potenziale proaggregante.
La determinazione dei meccanismi di trasmissione e di captazione della proteina in forma
patogenica potrebbe essere essenziale per individuare che nuovi bersagli terapeutici per
bloccare la trasmissione e la diffusione di AS e rallentare la progressione della MP.
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system. Acta Neuropathol. 1990;79(6):581-3.
Lezioni-Seminari
• Brescia, 15 Aprile 2013, Dott. Luca Mollica-Francia: “NMR-spectroscopy and computer
simulations of biomolecules: an essential handshake between two disciplines.”
• Brescia, 31 Maggio 2013, Prof.Bruce Yu-University of Maryland: “Development of Novel
Imaging Agents and Biomaterials.”
• Brescia, 20 Giugno “Dalla micologia alle nanotecnologie” Emanuela Gobbi, sez
Biotecnologie unità agroalimentare
• Brescia, 25 giugno “Non-coding-RNAs, epigenetics and transgenerational inheritance” G.
De Petro, Università di Brescia
• Brescia, 27 giugno” Role of microRNAs in the pathogenesis of and susceptibility to
Mendelian and complex disorders “ R. Asselta, Università di Milano
• Brescia, 19 settembre “Dopamine-glutamate receptor interplay modulates striatal
signaling and responses to cocaine” Dr Peter Vanhoutte, Universitè Pierre et Marie Curie Paris
Corsi e aggiornamenti
• Brescia, 9-10/20-21 Maggio 2013, Prof. Adrian Wallwork: “CORSO DI INGLESE
SCIENTIFICO”.
• Brescia, 2-6 Settembre “SUMMER SCHOOL: comunicare la scienza”
• Brescia, 16,18,(20,23,25) Settembre 2013: “DESIGN OF EXPERIMENTS-DOE.”
Elenco delle pubblicazioni
•
Bellucci A., Zaltieri M., Navarria L., Grigoletto J., Missale C. and Spano PF. From
alpha-synuclein to synaptic dysfunctions: new insights into the pathophysiology of
Parkinson's disease. Brain Res, 2012 Oct 2;1476:183-202. doi:
10.1016/j.brainres.2012.04.014. Epub 2012 Apr 17.
•
Bellucci A., Navarria L., Zaltieri M., Missale C. and Spano PF. Alpha-synuclein
synaptic pathology and its implications in the development of novel therapeutic
approaches to cure Parkinson's disease. Brain Res. 2012 Jan 13;1432:95-113
•
Bellucci A., Navarria L., Falarti E., Zaltieri M., Missale C., Spillantini MG. and
Spano PF. Redistribution of DAT/α-synuclein complexes visualized by "in situ" proximity
ligation assay in transgenic mice modelling early Parkinson's disease. PLoS One.
2011;6(12):e27959.
•
Bellucci A., Navarria L., Zaltieri M., Falarti E., Bodei S., Sigala S., Battistin L.,
Spillantini MG., Missale C. and Spano PF.Induction of the unfolded protein response by
alpha-synuclein
in
experimental
model
of
Parkinson’s
disease.
Journal
of
Neurochemistry 2011 Feb;116(4):588-605.
Abstracts presentati a congressi nazionali e internazionali
• Alpha-synuclein regulates dopaminergic synapse arrangement and functionality
by modulating synapsin III and the dopamine transporter
Michela Zaltieri1, Jessica Grigoletto1, Laura Navarria1, Cristina Missale1, PierFranco
Spano1,2 and Arianna Bellucci1
1
Division of Pharmacology, Department of Molecular and Translational Medicine and
National Institute of Neuroscience, University of Brescia, Brescia, Italy; 2 IRCCS S. Camillo
Hospital, Venice, Italy
Dopamine 2013, Alghero, Italy, May 24-28, 2013.
• Reciprocal modulation of alpha-synuclein, synapsins and dopamine transporter in
developing and mature dopaminergic neurons.
Grigoletto J.1, Zaltieri M. 1, Navarria L. 1, Missale C. 1, Spano PF. 1,2 and Bellucci A. 1
1
Division of Pharmacology, Department of Molecular and Translational Medicine and
National Institute of Neuroscience, University of Brescia, Brescia, Italy; 2 IRCCS S. Camillo
Hospital, Venice, Italy
11th AD/PD, International Conference on Alzheimer’s and Parkinson’s Diseases.
Florence, Italy, March 6-10, 2013.