Red Cell EZ Type Rh DI

INSTRUZIONI D’US0
RED CELL EZ TYPE
®
USO
I kit RED CELL Z- type sono destinati alla determinazione molecolare degli antigeni dei gruppi sanguigni, mediante amplificazione del DNA genomico
umano. Questi kit sono destinati come supporto ai test sierologici e non per sostituirli.

ABO Typing (RAB)

Rh: CDE Typing (RRZ)

Rh: Weak D Typing (RWD)

Rh: D Negative Typing (RDN)

Kell-Duffy-Kidd Typing (RKDK)

MNS Typing (RMN)

Rare ID Typing (RRI)

Rare Screen (RRS)

Kell Typing (RKP)

ABO Sub Typing (RABS)

Jk-Fy Typing (RJF)
Per uso Diagnostico in vitro.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST
Il metodo comunemente usato per la determinazione degli antigeni del gruppo sanguigno è la tipizzazione sierologica.
Recentemente è stata chiarita l’organizzazione genetica di diversi geni che codificano per gli antigeni dei gruppi sanguigni ed è stata determinata la
genetica di diversi gruppi sanguigni. Queste conoscenze sono state rese possibili da una tipizzazione dei polimorfismi del DNA che codificano per questi
antigeni.
La tipizzazione del DNA non può sostituire completamente il metodo sierologico. In tutti i sistemi la determinazione genetica di alcuni antigeni resta
indefinita, inoltre varianti genetiche sconosciute possono causare una variazione antigenica prevista, che in effetti è assente o alterata; la tipizzazione
del DNA può risolvere problemi di comprovata difficoltà del metodo sierologico, causata dal legame all’uso di pannelli e antisieri appropriati. Inoltre, la
tipizzazione del DNA può valutare zigosità e varianti nell’ espressione antigenica, entrambi difficili da discriminare con il metodo sierologico.
La tipizzazione dei polimorfismi del DNA dei gruppi sanguigni segue all’amplificazione PCR che può essere eseguita con diversi metodi: RFLP, sonde
SSO, o amplificazione allele specifica (SSP) con rivelazione sul gel. La PCR SSP, metodo utilizzato dal RED CELL EZ TYPE offre l’analisi migliore,
veloce e con il minor numero di passaggi manuali. Il metodo PCR SSP richiede solo 2 fasi di lavoro: amplificazione e rivelazione, perché l’amplificazione
e la discriminazione avvengono durante la PCR, la rivelazione dell’amplificazione della sequenza polimorfica avviene tramite elettroforesi su gel
d’agarosio, facilitata dall’uso di gel pronti all’uso (precast) inclusi nel kit. Il precast gel elimina la preparazione del gel d’agarosio, del buffer e i problemi
associati all’utilizzo di etidio bromuro e dei tamponi per l’elettroforesi agenti mutogeni.
PRINCIPIO DELLA PROCEDURA
I kit RED CELL EZ TYPE sono basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) che consente l’amplificazione di una sequenza target del DNA
genomico. Dopo l’amplificazione, il campione contiene la sequenza target di DNA in quantità sufficiente per la rivelazione.
I primer a sequenza specifica SSP descrivono uno specifico tipo di PCR che si verifica solo se l’allele è presente, campioni carenti del target allele
specifico non produrranno l’amplificazione. Per essere utile la PCR SSP richiede che vengano effettuate in parallelo un certo numero di amplificazioni .
L’amplificazione di primer controllo interno ha come target il gene dell’ormone della crescita (HGH) che mostra una buona reazione in ogni provetta di
PCR. Se dopo la PCR il DNA amplificato non è presente, il controllo interno deve essere chiaramente visibile. Il controllo negativo determina la
presenza di contaminazione da DNA esogeno. Il DNA amplificato è separato in elettroforesi su gel di agarosio pre cast E-Gel, in questa fase i prodotti
della PCR sono evidenziati dall’etidio bromuro in bande ben separate visibili su un trans illuminatore UV. L’ immagine del gel può essere fotografata
da una fotocamera digitale come documentazione del risultato del test. La determinazione degli alleli è realizzata confrontando il pattern delle bande
allele-specifiche con i pattern riportati sul corrispondente foglio di lavoro.
IL SISTEMA ABO E IL RED CELL EZ TYPE®

Tipizzazione ABO

ABO Sub Typing
Gli antigeni ABO del gruppo sanguigno compendono residui di zuccheri trasferiti da catene di carboidrati di glicoproteine o glicolipidi agli zuccheri fucosi
terminali sulle membrane eritrocitarie grazie a specifiche glicosiltransferasi. L’antigene A è prodotto da un N-acetil-galattosamina, l’antigene B da un
galattosio terminale. Il gruppo O è mancante entrambi i residui, lasciando libero un terminale fucose sugar chiamato antigene H.
I carboidrati che formano le varianti antigeniche ABO non sono codificate direttamente dalla sequenza di DNA; comunque la sequenza genetica che
codifica per lo specifico carboidrato glicosiltransferasi può essere identificata con PCR allele specifica.
1
Questi geni glicosiltrasferasi sono localizzati sul cromosoma 9 (9q34). Il kit per tipizzazione ABO ricerca le varianti genetiche che risultano essere le
più frequenti A, A2, B, O1 e O2. In aggiunta a questi alleli comuni il sistema include anche un numero di alleli rari la cui espressione fenotipica reagisce
debolmente con sieri anti-A e anti-B esempi A3, Ax, Ael, B3, Bx, Bv, Bm, Bel
Questi alleli non sono rilevati dai reagenti AB0. Per ulteriori rivelazioni di deboli espressioni di antigeni A- e B-, può essere utilizzato il kit ABO subtype, il
quale rappresenta un kit supplementare al kit ABO che ricerca 11 diversi alleli Adeboli, Ael, A2, A3, B3 e alcuni alleli O in 8 reazioni PCR. Per ulteriori
informazioni sulla nomenclatura vedere su ://www.ncbi.nlm.nih.gov/gv/rbc/xslcgi.fcgi?cmd=bgmut/systems_info&system=abo
ORGANIZZAZIONE DEL GENE RH E RED CELL EZ TYPE®

Rh: CDE Typing

Rh: Weak D Typing

Rh: D Negative Typing
Due geni posizionati sul cromosoma 1 nella regione 1p34 a 1p36, il gene RHD e il gene RHCE sono responsabili per l’espressione dell’antigene D e CE
Rh (Rhesus). Entrambi i geni sono composti da dieci esoni intervallati da regioni introniche. Il termine Rh d descrive l’assenza dell’intera glicoproteina
D, dovuta alla delezione dell’intero gene del D o a mutazioni che prevengono l’espressione della proteina (Rh pseudogene, ψ, o Rh d(C) ces
In aggiunta, risultano anche mutazioni puntiformi del fenotipo DEL dove l’espressione della superficie cellulare delle proteina D è tanto bassa da essere
immunologicamente assente. Gli antigeni CcEe sono codificati da una differenza di sequenze nel gene RHCE, oltre al fenotipo D-positivo e D-negativo,
in rari casi si verificano espressioni chiamate varianti del D (0.2 % nella popolazione europea). Questi possono essere D parziali o D deboli.
CDE
Il kit per tipizzazione CDE è disegnato per distinguere un D “normale” da varianti di D parziale tramite amplificazione gene-specifica di ognuno dei
diversi esoni del gene D. Questi D parziali, chiamati anche ibridi, sono prodotti dal cambio di uno o più esoni nel gene del D corrispondenti agli esoni del
gene CE. La maggior parte di questi ibridi può essere rilevata con il kit Rh CDE. Inoltre, questo kit è progettato per rilevare gli alleli RhCE che risultano
C, c, E, e e antigeni Cw. Infine, il kit è progettato per rilevare pseudo geni Rh-D (psi) e d(C) ces.
D debole
Il fenotipo D debole (weak D) deriva da mutazioni puntiformi nel gene RHD che porta al cambio di un singolo aminoacido nell’espressione della proteina.
Queste situazioni si verificano nei domini intracellulari o transmembrana della proteina RHD, e non alterano la struttura immunogenetica extracellulare
della proteina. Queste mutazioni presentano, invece, dei limiti nell’espressione della proteina D sulla membrana dei globuli rossi. Tutti i tipi di D debole
mostrano una diminuita densità della proteina D sulla superficie cellulare se confrontate con cellule D-positive. Questi risultano scarsamente concentrati
sugli epitopi RHD della membrana eritrocitaria, che variano coi i diversi D deboli, possono portare ad una agglutinazione molto debole nei test classici di
emoagglutinazione. I kit Rh D Weak sono disegnati per determinare queste mutazioni puntiformi. I kit includono reazioni specifiche per gli alleli D deboli
più frequenti ( tipo 1, 2, 3, 4.0, 4.1, 4.2, 5, 11, 14, 15, 17). Almeno il 95% di tutti i fenotipi di D deboli osservati possono essere classificati come D deboli
da tipo 1 a tipo 5.
D Negativo
I kit Rh D negativo sono disegnati per ricercare Rh -/- sierologicamente Rh-d positivi dall’ubicazione dei primer in 5’ (upstream box) e in 3’ (downstream
box) di accompagnamento alle regioni del gene D. Se il gene D è presente D-positivo, i siti dei primers nell’upstream e downstrem box sono troppo
distanti per l’amplificazione con questo metodo. Il fallimento dei primer per l’amplificazione, indica la presenza del gene RHD quando il gene D è deleto.
Parte dell’upstream e downstrem box producono i così chiamati box ibridi. I primer legati ai siti non sono abbastanza vicini tra loro per consentire
l’amplificazione.
delezionne del gene RHD nel Rhesus box
Wagner et al. Blood 2000
Quindi, l’amplificazione di questo set di primer (provetta 1) è un indice positivo della presenza di un “box ibrido” indicando che il gene RHD è assente
(RHD -/-, siero logicamente d). Una seconda valutazione della presenza/assenza del RHD è fornita da un altro set di primer (provetta 2) che ha come
target la sequenza dell’upstrem box. L’amplificazione di questi primer indica la presenza di un upstrem box completo e di conseguenza la presenza del
gene RHD. I set di primer nelle provette 5 e 6 completano questa ricerca di RHD. Questo set di primer ha come target un polimorfismo vicino
all’introne8/esone 9 sito di giuntura del gene RHD. In un vero RH -/- (omozigosi deleto) le reazioni 5 e 6 sono negative, mentre una delle 2 reazioni sarà
positiva con RH – D +/- (eteroziogosi) o D +/+ (omozigosi ).
Nei caucasici l’ RH D-negativo solitamente è il risultato dalla perdita completa del gene RHD. Nella popolazione africana uno pseudo gene non
espresso RH-D (ψ) o RH d (C) ces sono le comuni cause di un fenotipo d. Entrambi le varianti (RH-D (ψ) o RH d (C) ces) possono essere identificate da
una amplificazione positiva nella provetta 4 del kit Rh D negativo.
Studi del sudest asiatico confermano l’aumento dell’incidenza del DEL tra individui RHD negativo in questo gruppo di popolazione. Antigeni DEL sono
debolmente espressi RhD e sono difficili da ricercare siero logicamente. Le basi genetiche per un numero di questi DEL sono stati ora chiarite, e
2
ricercate facilmente usando metodi di tipizzazione sul DNA. Il kit Rh D negativo è realizzato per ricercare gli alleli del RHD (M295I), RHD(IVS3+1G>A),
RHD(K409K).
ANTIGENI KELL, DUFFY E KIDD E RED CELL EZ TYPE®

Tipizzazione Kell-Duffy-Kidd

Tipizzazione Kell

Tipizzazione Jk-Fy
Kell
Il sistema Kell comprende un totale di 28 alleli in 5 loci genici differenti sul gene KEL (cromosoma 7q33). Il kit di tipizzazione Kell-Duffy-Kidd (KDK)
ricerca alleli KEL1 e KEL2 (nt 698 T>C), che codificano gli antigeni KELL e CELLANO (K/k); KEL3/KEL4 (nt 961 T>C) che codifica gli antigeni Kpa e Kpb
(trp 281 Arg), e KEL 6/KEL7 (nt 1910 C>T) che codifica l’antigene Jsa/Jsb (Pro 597 Leu). Iil kit di tipizzazione KELL ricerca, inoltre, anche quattro dei più
frequenti alleli null KEL*02N.06 (IVS 3+1 G>A) e KEL*02N.12 (IVS8+1 G>A), Entrambi codificano per un codone di stop prematuro.Gli alleli KEL3/KEL4
(Kpa e Kpb) possono anche essere ricercati con i kit Rare Screen e Rare ID. Entrambi siti di mutazioni ; e KEL*02N.02 (nt382C>T, Arg128X) e
KEL*02N.04 (nt1042C>T, Gln348X).
Fy (DUFFY)
Gli antigeni Duffy sono presenti sulla glicoproteina Fy o DARC (Duffy Antigen Receptor for Chemokines) un recettore chemiochina che è codificato dal
gene FY (anche denominato DARC). Gli alleli reciproci Fy*A (o FY*01) e FY*B (o FY*02) derivano da una sostituzione nt 125 G>A, che porta al cambio
aminoacidico a GLY 42 ASP nella glicoproteina DUFFY. L’allele Fy*A codifica l’antigene Fya e il Fy*B l’antigene Fyb. Questi alleli comuni Fy sono
ricercati con i kit Kell-Duffy-Kidd (KDK) e il kit Jk-Fy. Inoltre, entrambi questi kit ricercano gli alleli più comuni Fy null FY*02N.01 (o FY*BES). Questi
alleli sono presenti in circa 1,4% della popolazione dell’europa centrale, ma sono molto più comuni negli individui di origine africana, è una sostituzione
T>C (-67 T>C) in una sequenza consenso GATA (CTTATCT > CTTACCT). La mutazione rompe il legame del fattore di trascrizione e risulta un gene
silente dei globuli rossi. Individui che sono omozigoti per Fy*02N.01 non hanno la glicoproteina DUFFY espressa sulla superficie dei loro eritrociti. Da
quando il Plasmodium vivax richiede il recettore del Duffy per l’infezione da malaria, l’allele FY*null rappresenta un vantaggio selettivo che può spiegare
la sua incidenza così elevata nelle regioni ad alto rischio di malaria (popolazione africana). Infine, le basi genetiche per le espressioni degli alleli deboli
FY*X (FyX) ricercati sierologicamente come Fyb weak ,possono essere identificati con i kit Kell Duffy Kidd e dal kit JkFy.
Jk (Kidd)
Il sistema Kidd consiste di due antigeni alternati Jka e Jkb e molti alleli nulli (lk-) sulla glicoproteina Kidd. Alleli JK*A (o JK*01) e JK*B (o JK*02,
nt838G>A) sul gene JK (anche chiamato SLC14A1) codificano per i corrispondenti antigeni Jka e Jkb (Asp 280Ash). La glicoproteina Kidd appare come
trasportatore funzionale di urea per gli eritrociti. Il kit Kell Duffy Kidd ricerca gli alleli comuni JK*A e JK*B . Il kit Jk-Fy ricerca JK*A e JK*B più due alleli
Jk null JK*02N.01 (IVS5-1G>A) e JK*02N.06 (nt871T>C, Ser291Pro).che eliminano la produzione della glicoproteina Kidd negli eritrociti.
ANTIGENI M/N (GYPA) E S/s (GYPB) E RED CELL EZ TYPE®

Tipizzazione MNS
Il sistema M/N e S/s è un gene complesso che consiste in due loci genici vicini e adiacenti, GYPA e GYPB sul cromosoma 4.
Gli antigeni M e N, scoperti da Landesteiner e Levine nel 1927, sono i risultati degli alleli (MNS1/MNS2) sul gene GYPA, che codifica per la glicoforina
A. Gli antigeni S e s risultano da un polimorfismo di alleli reciproci per un singolo polimorfismo nucleotidico su GYPB (MNS3/MNS4, nt239T>C).
Questi antigeni furono descritti nel 1947 da Walsh e Montgomery. In europa centrale la frequenza dell’aplotipo MNS è il seguente: MS (24,5%), Ms
(29,1%), NS (7,9%), Ns (38,5%).
In aggiunta, un numero di antigeni estremamente rari sono assegnati al sistema MNS. Mg (MNS11) ha una frequenza dello 0,16% in Svizzera e Sicilia,
ma non è stato ancora identificato in gruppi di popolazione anglosassone. L’allele MNS9 codifica per l’antigene VW (VERWEYST) che appartiene al
sistema Miltenberger ed è quindi definito come Miltenberger I (MII). Anticorpi naturali anti VW sono comparsi in circa 1% della popolazione europea. Gli
antigeni Vw sono presenti con una frequenza dello 0,057% nella popolazione caucasica, la frequenza di questo antigene aumenta al 1,43% in regioni
della Svizzera. Anche se rare, queste varianti sono capaci di causare severe reazioni emolitiche.
SCREEN / ID PER ANTIGENI RARI E RED CELL EZ TYPE®

Rare ID Typing

Rare Screen
I kit Rare ID e Rare Screen consentono lo screening e la successiva identificazione degli alleli dei gruppi sanguigni KELL (Kp), Lutheran (Lu), Diego
(Di), Wright (Wr), Cartwright (Yt), Colton (Co), Knops (Kn) e Dombrok (Do). Questi gruppi sanguigni sono biallelici con un allele frequente e uno raro. Il
sistema Dombrock è una eccezione, poiché entrambi gli alleli hanno una frequenza quasi uguale.
Nel kit Rare Screen viene eseguita una sola reazione PCR per campione, un risultato positivo indica la presenza di un allele raro per almeno uno di
questi 5 antigeni: Kpa, Lua, Ytb, Cob, Knb. Gli alleli rari possono essere successivamente identificati utilizzando il kit Rare ID. Questa PCR SSP ricerca
l’omozigosi e l’eterozigosi per tutti gli 8 sistemi KEL3/KEL4 (Kpa/Kpb); Lutheran (Lua/Lub); Diego (Dia/Dib); Wright (Wra/Wrb); Colton (Coa/Cob); Cartwright
(Yta/Ytb); Knops (Kna/Knb); Dombrock (Doa/Dob) con 16 reazioni PCR . La tabella 1 mostra una panoramica dei gruppi sanguigni contenuta in
quest’analisi, I dettagli derivano da “Human Blood Groups” 2002 di Geoff Daniels e si riferiscono al nome del gruppo della popolazione. Le frequenze
alleliche delle varianti rare sono evidenziate in grigio.
3
TAB. 1
Sistema Antigeni Rari
Nome
Abbr.
Cromosoma Sero
Kell
Kp
7q33
Kpa
a
DNA
Freq
Allele
Gruppo
Popolazione
Sero
DNA
Freq
Allele
KEL3
0.0114
Europe
Kpb
KEL4
0.9886
LU1
0.0390
Europe
Lub
LU2
0.9610
Dib
DI2
0.9469
DI4
0.9997
CO2
0.0439
Lutheran
Lu
19q13.2
Lu
Diego
Di
17q12-q21
Dia
DI1
0.0531
Japan
Wright
Wr
17q12-q21
Wra
DI3
0.0003
Colton
Co
7p14
Coa
CO1
0.9561
Cartwright
Yt
7q22.1
Yta
Y1
0.9587
Wrb
Europe
(Switzerland)
Cob
Europe
(Commonwealth)
Ytb
Europe
Y2
0.0413
Knops
Kn
1q32.1-3
Kna
KN1
0.9900
Europe
Knb
KN2
0.0100
Dombrock
Do
a
12p13.2-12.1 Do
DO1
0.4200
Europe
Dob
DO2
0.5800
REAGENTI
Numero Massimo di test per kit:

RAB, RRZ, RWD, RDN, RKDK,:
RMN, RRI, RKP, RABS, RJF
12 tipizzazioni per kit

RRS:
96 test per kit
PP
Piastra Primer: 96-provette PCR con primer allele-specifici e controllo interno (HGH), essicati sulla superficie interna delle provette.
Sigillate con pellicola adesiva. Pronti all’uso.
PT
Provette Primer (Rare Screen): strip provette PCR 1 x 8 (12) con primer allele-specifici (Kpa, Lua, Ytb, Cob, Knb) e controllo interno
(HGH) essicati sulla superficie interna delle provette. Ogni provetta è sigillata da tappi singoli. Pronto all’uso.
PR
Reagenti PCR: tampone contenente magnesio cloride, libero deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), glicerolo, rosso cresolo ed altri
componenti. Diluire prima dell’uso.
RNCT
Provette Controllo Negativo: provette PCR contenenti primer essicati, sigillate con tappi. Pronte all’uso.
E-Gel
E-Gel: Gel agarosio pre seminato (2% 16 pozzetti, 2% 48 pozzetti, o 2% 96 pozzetti) usato per la separazione dell’amplificato PCR.
Pronto all’uso. Fornito separatamente.
AVVERTENZE

Non usare i reagenti o i gel dopo la data di scadenza.

Non usare reagenti torbidi o contaminati.

Non usare gel rotti, essiccati, o con segni evidenti di congelamento

Le provette PCR e i reagenti contenuti nel kit non devono essere usati in unione ad altri sistemi.

A causa della variazione delle performance dei diversi termociclatori, potrebbe essere necessario per i laboratori stabilire i corretti aggiustamenti
per i programmi dello strumento, in modo tale da ottenere risultati corretti. Potrebbe anche essere necessario individuare il copri piastra adatto per
garantire la chiusura completa delle provette durante la PCR.

Si consiglia per il kit ABO Sub la camera elettroforetica E-Gel 16.

Non estrarre DNA da campioni prelevati in eparina. L’eparina può interferire con l’amplificazione.
PCR Pratica di Laboratorio

La PCR è un modo molto potente per amplificare anche in presenza di piccole quantità di DNA. Deve essere usata una estrema precauzione per
evitare contaminazioni da DNA estraneo o prodotti di PCR. E’ di particolare importanza evitare la contaminazione da prodotti PCR di precedenti
amplificazioni Le seguenti avvertenze sono particolarmente importanti:
-
Separare l’area pre-PCR (separazione del DNA e conservazione, preparazione della PCR) dall’area post-PCR (termociclatore, caricamento
del gel ed elettroforesi, analisi). Strumenti e consumabili dell’area post-PCR non devono essere portati nell’area pre-PCR.
-
Usare pipette con filtro (puntali con filtri sterili) in entrambe le aree PCR.
-
Il controllo Negativo è usato per rilevare possibili contaminazioni da DNA e dovrebbe essere sempre testato in parallelo con l’amplificazione
dei campioni.
I risultati di questi test dovrebbero essere sempre interpretati in unione con test sierologici.
4
ATTENZIONE

Alla fine del test, gettare i materiali di rifiuto come materiali potenzialmente infettivi e decontaminare i materiali non monouso con amuchina 10%
come agente disattivante il DNA.

Il transilluminatore UV usato per visualizzare le bande degli amplificati emette potenti raggi ultravioletti che possono danneggiare occhi e pelle.
Indossare sempre abiti protettivi, occhiali UV-bloccanti o visiere quando si opera con il transilluminatore UV.

E-Gel®s contiene una piccolo quantità di etidio bromuro come colorante del DNA. L’etidio bromuro è un mutageno umano noto. Non aprire la
cassetta del gel. Gettare i gel secondo le normative vigenti.
RACCOLTA CAMPIONI

Estrarre il DNA usando un metodo pubblicato o un kit commercial che può produrre campioni di DNA con una razio a 260 nm/280 nm razio di 1.601.90 e una concentrazione con un range di 25-50 ng/µL.

Risospendere il DNA in acqua sterile o 10 mM Tris, pH 7.0-8.0. I campioni non dovrebbero essere reidratati in una soluzione superiore a 1 mM
EDTA o altri agenti chelanti. Questo può interferire con la PCR.

I campioni DNA dovrebbero essere testati immediatamente dopo l’estrazione o conservati in un freezer non-defrosting ad una temperature uguale
o superiore a -20ºC.

Alcune volte il DNA isolato (ad esempio con estrattore automatico) ha una concentrazione di < 25 ng/µl. I volumi di questi campioni dovrebbero
essere essere aggiustati quando aggiunti alla master mix.

La presenza di proteine contaminanti in eccedenza, RNA, eparina, EDTA, o altri agenti chelanti può interferire con l’amplificazione PCR del DNA
purificato.
PROCEDURA
Materiale Fornito:
Per la PCR (conservare a ≤ -20ºC)
1.
Piastre con primer/ microprovette PCR
Kit
Qty
Kit
Qty
ABO Typing
1 Piastra
ABO Sub Typing
1 Piastra
Kell-Duffy-Kidd
Typing
Kell Typing
Rh: CDE Typing
2 Piastre
MNS Typing
1 Piastra
Rh: Weak D Typing
1 Piastra
Rare ID Typing
2 Piastre
Rh: D Negative Typing
1 Piastra
Rare Screen
96 Microprovette PCR
Jk-Fy Typing
1 Piastra
1 Piastra
1 Piastra
Le microprovette di ogni piastra contengono primer allele specifici e il controllo interno.
2.
Reagenti PCR
a.
b.
RNCT 3.
RSC
4.
1 x 500 µL (RAB, RABS, RWD, RDN, RJF, RKDK, RKP, RMN, RRS)
2 x 500 µL (RRZ, RRI)
12 Microprovette PCR di Controllo Negativo.
12 o 24 file di tappini.
Gel (conservare a 15 - 30°C)
RGEL16 5.
RGEL48 6.
RGEL48-2 7.
RGEL96 8.
2% E-Gel® 16 (6 x 2% double-comb E-Gel® 16)
O
2% E-Gel® 48 (8 x 2% E-Gel® 48)
O
2% E-Gel® 48-2 (2 x 2% E-Gel® 48)
O
2% E-Gel® 96 (3 x 2% E-Gel® 96)
Gli utilizzatori che preferiscono utilizzare l’heat sealer per chiudere le microprovette PCR necessitano dei seguenti due componenti aggiuntivi che
possono essere forniti da GTI Diagnostics
TSF
9.
Fogli copri piastra termici
10. Copri piastra in silicone 1mm
5
Materiale Richiesto (ma non fornito):
A.
Per PCR
1.
Taq Polimerasi, nativa o ricombinante, 5U/ µL. Non usare un’altra polimerasi termostabile o Taq “hot-start” .
I seguenti enzimi sono stati validati per l’uso con RED CELL EZ TYPE®. L’uso di altri enzimi deve essere validato dall’utilizzatore.
TAVOLA 2
Fornitori di Enzima
Fornitore
Prodotto
Applied Biosystems
AmpliTaq (N8080172)
Promega
GoTaq Flexi (M8296)
Inno-Train
AxiTaq
2.
Termociclatore programmabile con porta piastra PCR da 96 pozzetti 0,2 mL.
3.
Micropipette a volume variabile da 0,5 a 1000 µL e puntali sterili con filtro.
4.
Acqua biologicamente pura senza DNA e DNAsi.
5.
Box con ghiaccio e piastra porta piastra fredda.
6.
Porta piastra PCR (0,2 mL).
7.
Vortex.
8.
Provette con tappo in polipropilene per microcentrifuga (0,5 – 2,0 mL), senza DNA e DNAsi.
9.
Candeggina 10% o un altro reagente inattivante il DNA.
Opzionali
10. Pipettatore elettronico con capacità di pipettamento di 10 µL
11. Cap roller (se si usano le file di tappini per microprovette da PCR)
12. Dispositivo di saldatura a caldo.
13. Rullo di chiusura (se si usa la chiusura termica delle microprovette)
B.
Per elettroforesi ed analisi
1.
E-Gel™ iBase™ o Mother E-Base™
2.
Porta piastra PCR (0,2 mL)
3.
Micropipette a volume variabile 1 - 20 µL e puntali sterili con filtro.
4.
Carta assorbente
5.
Transilluminatore UV (EZT-ILLUM)
6.
Candeggina 10% o altro agente inattivante il DNA.
7.
Acqua deionizzata
8.
Sistema di documentazione del gel. (EZT-CAMHOOD)
Opzionali
9.
Marcatore di bande E-Ladder
10. Pipetta multicanale 8-canali da 5-20 µL
Metodica
A.
Prima del test
1.
Isolare il DNA genomico da tutti i campioni da testare. Ogni campione deve avere una concentrazione di DNA nel range 25 - 50 ng/µL e
assorbanza 260 nm/280 nm ratio 1,60 – 1,90. Campioni con una concentrazione >50 ng/µL dovrebbero essere diluiti e portati a concentrazione
25 – 50 ng/µL. Nei campioni con una concentrazione <25 ng/µL aggiungere un volume maggiore di DNA campione per una corretta
amplificazione.
2.
®
Programmare il termociclatore con il programma per PCR RED CELL EZ TYPE . I kit utilizzano un comune ciclo di amplificazione tranne il Rare ID
Typing e il Rare Screen che richiedono un programma unico. Il programma è il seguente:
6
TAVOLA 3
Programma per Termociclatore
(RAB, RABS, RRZ, RWD, RDN, RJF, RKDK, RKP, RMN)
Inizio
5 Cicli
10 Cicli
20 Cicli
72°C Hold
Fine
94°C 2 min.
94°C 20 sec.
94°C 20 sec.
94°C 20 sec.
72°C 5 min.
10°C Hold
70°C 60 sec.
65°C 60 sec.
61°C 50 sec.
72°C 45 sec.
72°C 45 sec.
NOTA:
Questo programma è stato testato con termociclatori Applied Biosystems (PE9600, PE9700, Veriti), Biometra (T Professional), BioRad (PTC-100, PTC-200, C1000) e Analytik Jena (Flexcycler). Non limitare l’amplificazione a ~1°C/second (PE9600 mode).
TAVOLA 4
Programma per Termociclatore (RRI, RRS)
Inizio
10 Cicli
94°C 2 min.
20 Cicli
72°C Hold
Fine
94°C 20 sec.
94°C 20 sec.
72°C 5 min.
10°C Hold
65°C 60 sec.
61°C 60 sec.
72°C 30 sec.
NOTA:
B.
Questo programma è stato testato con termociclatori Applied Biosystems (PE9700, PE9600) e Bio-Rad (PTC-100, PTC-200). Per
PE9700 la velocità di rampa dovrebbe essere limitata a ~1°C/second (9600 mode); comunque, nel PTC-200 non si deve controllare la
velocità di rampa. L’amplificazione su un altro termociclatore deve essere ottimizzato.
PCR
3.
Prima di iniziare il test accendere il termociclatore e accertarsi che venga raggiunta la temperatura richiesta.
4.
Preparare il piano di lavoro e le pipette. Pulire prima con candeggina 10% o altro agente inattivante il DNA.
5.
Se si utilizzerà l’heat sealer, accendere il dispositivo di chiusura a caldo e attendere il raggiungimento della temperatura operativa (~ 5 – 7
min).
6.
Determinare il numero di campioni da testare. Prendere il numero delle microprovette necessarie, Taq Polimerasi, il controllo negativo, la
master mix dal congelatore e portarle (Reagenti PCR) a temperatura ambiente. Tenere la Taq polimerasi e i Reagenti PCR su ghiaccio Porre
la piastra dei Primer e la provetta del controllo Negativo nel porta provette.
NOTA:
Se si testa più di un DNA campione è richiesto solo un controllo negativo. Anche, se si testa un solo DNA campione con più kit è
richiesto un solo controllo negativo.
7.
Compilare l’appropriato protocollo per la PCR. Il protocollo indicherà i volumi richiesti dei reagenti per il numero di analisi da eseguire.
8.
Identificare le microprovette da PCR con tappo da 0.6 mL o 1.5 mL per ogni campione di DNA da testare, più uno da 1.5- 2.0 mL se devono
essere testati multipli dello stesso campione. Preparare le Master Mix come calcolato sul protocollo di preparazione della PCR. Porre le
mastrer Mix in ghiaccio o box freddo.
9.
Scrivere il numero del lotto e la scadenza su una copia del foglio di lavoro. Rimuovere ed eliminare il foglio copri piastra delle provette
contenenti il primer. Identificare ogni serie di microprovette per ogni campione da testare. Pipettare 10 µL di ogni DNA appropriatamente
diluito in ogni microprovetta contenente i primer.
NOTA:
E’ un punto critico mantenere il corretto orientamento di ogni fila di microprovette. Per ogni fila di microprovette con primer la
microprovetta n°1 è segnata con un puntino nero.
10. Chiudere le microprovette premendo il tappino e procedure al punto 12. Nel punto 11 viene descritta la chiusura con Heat sealer.
11. Se si usa la chiusura a caldo, porre la serie delle microprovette con primer nel rack porta campione dell’ heat sealer. Tagliare la porzione del
fogli adesivi in maniera da chiudere le serie di microprovette incluso il controllo negativo. Abbassare l’elemento riscaldato del dispositivo e
premere per 3-5 secondi. Rilasciare ed utilizzare un roller o le dita per agevolare la chiusura passando sopra ogni microprovetta. Rimuovere la
piastra dal sealer.
NOTA:
Nell’ utilizzo dell’ heat sealing device, fare attenzione a non esercitare una forza eccessiva o lasciare la piastra per oltre 5 secondi a
contatto con l’elemento riscaldato perchè potrebbe causare la deformazione delle provette PCR nella piastra rendendo difficile l’
aspirazione del prodotto amplificato.
12. Esaminare la piastra PCR dopo la chiusura. Verificando la presenza di bolle o di residui sulle pareti della provette, se presenti, eliminarle
mediante una breve centrifugazione o picchiettando con le dita le singole provette.
13. Far partire il programma appropriato nel termociclatore. Trasferire la piastra tipizzante dall’apposito porta campione al termociclatore.
14. Se le microprovette sono state chiuse tramite l’heat saeler porre il cuscinetto di silicone sulla piastra precedentemente chiusa con il foglio
copri piastra. Se il termociclatore non è completamente occupato, porre delle microprovette vuote agli angoli come supporto al silicone.
Chiudere il coperchio del termociclatore facendo attenzione che il silicone non si muova.
NOTA:
Il silicone non dovrebbe essere usato con
termociclatore.
microprovette chiuse con tappini. Potrebbe essere danneggiato il coperchio del
15. Alla fine dei cicli quando il termociclatore raggiunge i 10°C togliere la piastra e controllare che il volume di ogni provetta non sia variato.
Volumi ridotti potrebbero indicare una scarsa amplificazione in queste provette PCR e dare risultati incerti. Se la fase di elettroforesi non viene
eseguita immediatamente si possono conservare gli amplificati a 2-8°C fino a 3 gg. o a – 20°C fino a una settimana.
7
C.
Rivelazione
NOTA:
La fase di rivelazione deve avvenire in un’area separata da quella usata per la pre-PCR. La strumentazione non deve essere
trasportata tra le due aree per evitare contaminazioni.
NOTA:
La rivelazione deve essere effettuata in ogni E-Gel® disponibile. Ogni E-Gel®16 pozzetti può contenere 1-2 tipizzazioni. E-Gel®48 o
E-Gel®96 pozzetti può rendere possibile caricare più campioni su un unico gel.
16. Se le provette tipizzanti sono conservate in freezer, prendere la piastra, scongelarla e portarla a temperatura ambiente prima dell’uso.
17. Preparare il piano di lavoro utilizzando carta assorbente da laboratorio, la camera gel (i-BaseTM/Mother E-BaseTM), acqua deionizzata e
pipette. Prendere il numero di gel necessari per l’elettroforesi dei campioni da testare.
NOTA:
Caricamento e corsa del E-Gel®16 pozzetti è descritto nei punti 18-26. Caricamento e corsa del E-Gel®48 pozzetti è descritto nei
punti 27-35. Caricamento e corsa del E-Gel®96 pozzetti è descritto nei punti 36-45.
Caricamento e corsa di unE-Gel® 2% 16 pozzetti
18. Aprire una confezione di un E-Gel® 16 pozzetti e rimuovere il gel. Inserire il gel, prima a destra nella gel chamber iBase™. Premere a sinistra
negli angoli per incastrare il gel. Inserire la spina del dispositivo.
19. Pre-corsa del gel. Premere e tenere premuto il tasto Mode (M, il secondo da destra) fino a quando il programma lampeggia. Utilizzare i tasti
su e giù per selezionare il programma pre-corsa (programma 0). Premere il tasto GO per far iniziare il pre-corsa. La luce rossa indica che il gel
è stato inserito correttamente e diventa verde quando inizia la corsa. La fine della pre-corsa è indicata da una luce rossa lampeggiante e da
un beep. Premere il tasto GO per fermare l’allarme.
20. Annotare sulla superficie del gel i dati identificativi.
21. Rimuovere il pettine dal gel. Dispensare 16 µL di acqua deionizzata in ogni pozzetto del gel, tranne che nei pozzetti al centro.
22. Pipettare i prodotti PCR nel gel.
NOTA:
a.
Per tutti i kit tranne Rare Screen: Aprire la microprovetta 1 (segnata da un puntino nero) per il primo campione e pipettare 6 µL del
contenuto nel pozzetto assegnato nel gel. Ripetere questa operazione per ogni microprovetta PCR nel corrispondente pozzetto del gel.
Cambiare i puntali dopo ogni dispensazione.
b.
Per Rare Screen: Aprire ogni microprovetta PCR e pipettare 6 µl del contenuto nel pozzetto assegnato nel gel. Cambiare i puntali dopo
ogni dispensazione.
Questa fase è notevolmente facilitata mediante l’uso di una pipetta multicanale (8-canali) con capacità 5-20 µL.
23. Pipettare 5 µL di acqua nel micropozzetto al centro. Pipettare 5 µL del controllo negativo in questo pozzetto.
24. Se si desidera introdurre il marcatore di bande, pipettare 10 µL di E-Ladder nell’altro micropozzetto.
NOTA:
Può essere utilizzato altro marcatore di DNA di appropriate paia di basi. In questo caso la diluizione per il caricamento deve essere
determinata dall’utilizzatore.
25. Premere il tasto Mode (M) e utilizzare la freccia in giù per selezionare il programma 3. Il tempo di corsa dovrebbe essere di 15 minuti. Si può
modificare premendo le freccie su e giù. Premere il tasto GO per iniziare la corsa elettroforetica. La luce rossa cambierà in verde e il display
mostrerà il tempo rimanente.
26. Alla fine della elettroforesi la luce verde diventa rossa lampeggiante e compare un allarme sonoro. Premere il tasto power e la luce rossa
lampeggiante diventerà fissa. Disconnettere il dispositivo e rimuovere il gel dalla camera. Continua al punto 46.
Caricamento e corsa di un E-Gel® 2% 48 pozzetti
27. Estrarre un E-Gel® 2% dalla confezione di alluminio e rimuovere il pettine proteggi pozzetto. Se necessario pulire la parte superiore
asciugando con carta assorbente da laboratorio. Annotare sulla superficie del gel i dati identificativi.
28. Dispensare 13 µL di acqua deionizzata in ogni pozzetto del gel, tranne che nei due pozzetti M sul lato sinistro delle righe.
29. Pipettare il prodotto di PCR nel gel.
a.
Per tutti i Kit tranne Rare Screen: Rimuovere la prima fila di tappini o aprire la microprovetta N°1 (segnata con un puntino nero) e
pipettare 5 µL del contenuto nel pozzetto assegnato nel gel. Ripetere questa fase per ogni microprovetta nel corrispondente pozzetto
assegnato nel gel. Ripetere la stessa operazione per tutti i campioni da testare. Cambiare I puntali dopo ogni dispensazione. Accertarsi
di pipettare correttamente ogni campione nelle posizioni definite.
b.
For Rare Screen: Aprire ogni miniprovetta e pipettare 5 µL del contenuto nel pozzetto assegnato nel gel. Cambiare i puntali dopo ogni
dispensazione
30. Pipettare 5 µL del controllo negativo in uno dei pozzetti M nel lato destro.
31. Se si desidera introdurre il marcatore di bande, pipettare 15 µL di E-Ladder nei due pozzetti M a sinistra.
NOTA:
Può essere utilizzato altro marcatore di DNA di paia di basi appropriate. In questo caso la diluizione per il caricamento deve essere
determinate dall’utilizzatore.
32. Collegare la camera gel all’alimentatore si accenderà una luce rossa e sul display compare il tempo di corsa in minuti. Usare il tasto power
(tasto destro) per selezionare la modalità EG (invece della modalità EP).
33. Introdurre il gel facendolo scorrere sulla E-Base della camera gel permettendo ai relativi elettrodi il contatto con gli elettrodi del dispositivo.
34. Usare il tasto di sinistra e impostare il tempo su 15 minuti. Premere il tasto power (tasto destro) per iniziare l’ elettroforesi. Durante la
migrazione la luce rossa diventa verde.
35. Alla fine della elettroforesi la luce verde diventa rossa lampeggiante e compare un allarme sonoro. Premere il tasto power e la luce rossa
lampeggiante diventerà fissa. Disconnettere il dispositivo e rimuovere il gel dalla camera. Continua al punto 46.
8
Caricamento e corsa di E-Gel® 2% 96 pozzetti
36. Estrarre un E-Gel® 2% 96 dalla confezione di alluminio e rimuovere il pettine proteggi pozzetto. Se necessario pulire la parte superiore
asciugando con carta assorbente da laboratorio.
37. Annotare sulla superficie del gel i dati identificativi.
38. Dispensare 16 µL di acqua deionizzata in ogni pozzetto del gel, tranne che nei pozzetti M a destra.
39. Pipettare il prodotto di PCR nel gel.
NOTA:
a.
Per tutti i kit eccetto il Rare Screen: Rimuovere la prima fila di tappini o aprire la miniprovetta N°1 (segnata con un puntino nero) e
pipettare 5 µL del contenuto nel pozzetto assegnato nel gel. Ripetere questa fase per ogni miniprovetta nel corrispondente pozzetto
assegnato nel gel. Ripetere la stessa operazione per tutti i campioni da testare. Cambiare I puntali dopo ogni dispensazione. Accertarsi
di pipettare corretamente ogni campione nelle posizioni definite.
b.
Per il Rare Screen: Aprire ogni miniprovetta e pipettare 5 µL del contenuto nel pozzetto assegnato nel gel. Cambiare I puntali dopo ogni
dispensazione
Questa fase è notevolmente facilitata mediante l’uso di una pipetta multicanale (8-canali) con capacità 5-20 µL.
40. Pipettare 6 µL del controllo negative in un pozzetto libero. Se i pozzetti sono stati tutti utilizzati, può essere utilizzato un pozzetto M a destra. In
questo caso aggiungere 16 µL di acqua deionizzata nelpozzetto prima di aggiungere il controllo negative.
41. Se si desidera introdurre il marcatore di bande, pipettare 15 µL di E-Ladder in ogni pozzetto M a destra, tranne in quelli usati per il controllo
negativo.
NOTA:
Può essere utilizzato altro marcatore di DNA di appropriate paia di basi. In questo caso la diluizione per il caricamento deve essere
determinate dall’utilizzatore.
42. Collegare la camera gel all’alimentatore si accenderà una luce rossa e sul display compare il tempo di corsa in minuti. Usare il tasto power
(tasto destro) per selezionare la modalità EG (invece della modalità EP).
43. Introdurre il gel facendolo scorrere sulla E-Base della camera gel permettendo ai relativi elettrodi il contatto con gli elettrodi del dispositivo.
44. Usare il tasto di sinistra e impostare il tempo su 11 minuti. Premere il tasto power (tasto destro) per iniziare l’elettroforesi. Durante la
migrazione la luce rossa diventa verde.
45. Alla fine della elettroforesi la luce verde diventa rossa lampeggiante e compare un allarme sonoro. Premere il tasto power e la luce rossa
lampeggiante diventerà fissa. Disconnettere il dispositivo e rimuovere il gel dalla camera.
Foto Documentazione
46. Porre il gel sul transilluminatore ed esaminare le bande entro 20 minuti. Se si desidera archiviare il gel, fotografare utilizzando un sistema di
documentazione di immagine adeguato.
D.
CONTROLLO DI QUALITA’
E.
Il controllo interno deve essere visibile in tutti gli amplificati tranne nella provetta del controllo negativo. Va considerato però che l’amplificazione allele
specifica compete con il controllo interno, quindi nelle reazioni di amplificazione allele specifiche positive, la banda controllo interno può essere
soppressa, debole o assente. Questo non deve preoccupare. Se per il DNA caricato dalla provetta non si osserva la banda di controllo o la banda allele
specifica, l’amplificazione è fortemente compromessa. Il fallimento di tale amplificazione può essere il derivare dal deterioramento dei reagenti,
programmazione errata del termociclatore, dal cattivo grado di purezza del DNA, da una insufficiente quantità di DNA caricato, da una chiusura non
corretta della provetta di reazione, da omissione nel caricamento di un reattivo nella preparazione della miscela di reazione.
La provetta del controllo negativo non dovrebbe avere nessuna banda visibile. La presenza di un prodotto di PCR in questa provetta indica
contaminazione della Master Mix. Può esserci contaminazione a causa di errori procedurali o contaminazioni di reagenti o strumentazione
precedentemente usata. Se il controllo negativo risulta positivo la seduta non potrà essere interpretata, ripetere l’analisi.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Il controllo interno produce una banda di 434 bp per tutti I kit tranne per ABO Sub Typing , dove la banda è pari a 540 bp. Il prodotto specifico per la
maggior parte delle reazioni è più grande del controllo interno, in altri più piccolo. Alcune microprovette possono produrre più di una banda specifica
(reazioni multiplex) Le grandezze di tutte le reazioni specifiche sono riportate nel foglio di lavoro.
Annotare per ogni campione il pattern delle reazioni positive e confrontarlo con il foglio di lavoro per determinare gli alleli presenti nel campione.
Dovrebbe essere fatta particolare attenzione alle note in fondo ad ogni foglio di lavoro. Queste ci forniscono informazioni utili per aiutare a interpretare
correttamente le bande.
LIMITI
•
RED CELL EZ TYPE® kits contiene materiale per l’amplificazione delle sequenze di DNA genomico mediante reazione a catena della polimerasi con
conseguente rivelazione della specifica variazione genetica del gruppo sanguigno come mostrato dal foglio di lavoro specifico dei diversi kit. Altre
variazioni, incluse varianti sconosciute nella sequenza del gene, possono influire negativamente sui risultati.

L’allele non trascritto, JK*null 01 (Jk-), presente per lo più nelle persone affette da trisomia 21, non è rilevabile dal kit Kell-Duffy-Kidd Typing
(RKDK) o dal kit Jk-Fy Typing (RJF).

I risultati dei kit RED CELL EZ TYPE® vanno usati in aggiunta ai test sierologici e non devono essere usati in sostituzione ai test sierologici.

Per assicurare risultati ottimali delle analisi con i kit RED CELL EZ TYPE®, il campione di DNA dovrebbe avere una concentrazione tra 25 ng/µL e 50
ng/µL con assorbanza 260 nm/280 nm razio 1,60-1,90. Amplificazioni povere di prodotto PCR possono risultare da insufficiente aggiunta di DNA
campione nella reazione o da campione di DNA non puro.
9

Risultati falsamente negativi possono derivare da campioni non correttamente conservati, errori procedurali, presenza di inibitori
dell’amplificazione, oppure dal basso grado di purezza del DNA.

Risultati falsamente negativi possono derivare dall’uso di una Taq polimerasi diversa da quelle riportate nella tabella dei materiali richiesti (ma non
forniti).

Contaminazione da carryover di acidi nucleici, DNA genomico in eccesso, l’uso di temperature diverse da quelle indicate possono dare reazioni
falsamente positive.

Il programma di amplificazione indicato è stato testato con termociclatori PE 9600, PE 9700 e Veriti (Applied Biosystems), con PTC-100, PTC-200,
e C1000 (BioRad), T Professional (Biometra), Flexcycler (Analytik Jena). Per altri termociclatori possono essere richiesti alcuni aggiustamenti ai
parametri indicati.

I termociclatori dovrebbero essere calibrati e controllati in accordo alle istruzioni del produttore.
CARATTERISTICHE SPECIFICHE DEL TEST
Nell’ambito dello studio di valutazione delle prestazioni, i risultati di tutte le analisi sono state comparate con i risultati sierologici o di tipizzazioni
molecolari di campioni noti. Per tutti i sitemi analizzati, la concordanza dei risultati era del 100%.
La composizione delle mix di primer permette una affidabile identificazione degli antigeni riportati nei fogli di interpretazione. L’accuratezza e la
riproducibilità delle reazioni e delle mix di primer è stata testata utilizzando campioni di controllo con antigeni noti.
Come controllo della produzione finale, ogni mix di primer è stata testata per fornire informazioni, ove possibile, sulla corretta positività e negatività.
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10
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E-Gel is a registered trademark of Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA
EZ Type is a registered trademark of GTI Diagnostics, Waukesha, WI
RED CELL EZ TYPE®
REF
RAB, RRZ, RWD, RDN, RKDK,
RMN, RRI, RRS, RKP, RABS, RJF
Conservare a < -20° Per Kit
Conservare a 15-30°C E-Gels
IVD
Per Uso Diagnostico IN VITRO
REV 2011-05-11 (it)
20925 Crossroads Circle, Suite 200
Waukesha, WI 53186-4054 USA
262.754.1000 or 800.233.1843
www.gtidiagnostics.com
EC REP
Qarad b.v.b.a
Volmolendeide 13,
B-2400 Mol
Belgium
11