La diagnostica di laboratorio La diagnostica di laboratorio

La diagnostica di laboratorio
Maria Rosaria Capobianchi, [email protected]
Antonino Di Caro, [email protected]
Concetta Castilletti, [email protected]
WHO Collaborating Center for clinical care, diagnosis,
response and training on Highly Infectious Diseases
Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola
per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio
Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma
22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014
La diagnostica di laboratorio
Outline
•Diagnostica di base
•Diagnostica differenziale
•Diagnostica specifica per Ebola
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•Diagnostica di base
•Diagnostica differenziale
•Diagnostica specifica per Ebola
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FAQ 1. Possono essere eseguiti
test diagnostici nei laboratori
locali (urgenza, microbiologia,
virologia, ecc.) prima di avere il
risultato del test per Ebola?
SI: se si adottano le adeguate misure di protezione
il rischio per i laboratoristi è molto basso in caso
di “bassa probabilità di malattia da virus ebola ”, e basso
in caso di “elevata probabilità”
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Prelievi
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Prelievi
•Valutazione del rischio
Unlikely to have a VHF
Low possibility of VHF
High possibility of VHF
Confirmed VHF
• Avvisare il laboratorio locale del rischio assegnato, per consentire
l’adozione di adeguate misure di biosicurezza
•Inviare i campioni al laboratorio locale in
contenitori chiusi e infrangibili
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Indagini chimico cliniche
Emocromo
elettroliti
transaminasi
PCR
coagulazione
ecc.
• Le indagini chimico-cliniche possono essere eseguite in loco,
privilegiando i POCT (Point of Care Testing) o sistemi chiusi che
consentano ad es. di forare la provetta e di centrifugarla, ove
necessario, in modo automatico
• Le provette contenenti i campioni vanno sempre aperte sotto
cappa, proteggendo occhi e mucose da eventuali spruzzi
• Se non si dispone di un laboratorio in grado di osservare queste
misure, inviare i campioni allo Spallanzani
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•Diagnostica di base
•Diagnostica differenziale
•Diagnostica specifica per Ebola
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Diagnostica differenziale
• Malaria
• Dengue
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Febbre tifoide
Shigellosi
Colera
Leptospirosi
Peste
Rickettsiosi
Febbre ricorrente
Borreliosi da pidocchi
Meningiti e sepsi
• Epatiti
• Altre febbri emorragiche virali
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FAQ 2. Il test di malaria può
essere eseguito in loco?
Si, se si adottano adeguate
precauzioni
Privilegiare il test rapido (POCT)
• le positività vanno confermate con i test convenzionali
In PS l’operatore è protetto dai dispositivi di protezione e
dalle procedure
In laboratorio il POCT va eseguito in BSL2, sotto cappa,
proteggendo gli occhi e le mucose da eventuali spruzzi
In caso di impossibilità di eseguire il test in loco, o in caso di
elevata probabilità di MVE, la ricerca del parassita malarico
può essere eseguita all’INMI
Test rapido (risultato comunicato in tempo reale)
Conferma con goccia spessa
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•Diagnostica di base
•Diagnostica differenziale
•Diagnostica specifica per Ebola
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Il virus ebola, come gli altri
filovirus, è un virus di gruppo di
rischio 4
•Alta contagiosità
•Elevata mortalità
•Assenza di terapia specifica
•Assenza di vaccini
La diagnostica per virus di gruppo di rischio 4
non è assimilabile ad analoghe procedure per
microrganismi di gruppo inferiore, in quanto
presenta requisiti strutturali, professionali ed
organizzativi peculiari.
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Difficoltà del laboratorio
Necessità, specie in assenza di un sospetto clinico ben indirizzato, di
una diagnosi differenziale ad ampio spettro
Scarsità/assenza di kit commercialmente disponibili, validati
Scarsità di materiali di riferimento per lo sviluppo e la validazione
dei metodi diagnostici
Necessità di partecipare ai network internazionali per poter
accedere a: metodi, materiali/agenti, EQA, assistenza/conferme dei
risultati
Necessità di sviluppare, spesso in fretta, metodi nuovi e, in assenza
di standard di riferimento, di sviluppare metodi di conferma
Necessità di laboratori ad alto biocontenimento
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Capacità diagnostiche per Ebola allo Spallanzani
• Ricerca diretta del virus mediante metodi molecolari basata su un
test iniziale di screening e vari test successivi di conferma
• Caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento ed analisi
filogenetica
• Ricerca diretta del virus mediante metodi colturali
• Ricerca diretta del virus mediante microscopia elettronica
• Ricerca degli anticorpi mediante Immunofluorescenza indiretta
(IgM e IgG)
• Ricerca di anticorpi mediante test di neutralizzazione
• Diagnosi differenziale verso le principali eziologie alternative,
nonché verso altre cause di sindromi emorragiche, incluse Lassa,
Dengue, Alkhurma, febbre gialla, ecc.
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Algoritmo di laboratorio
Blood specimens sent to
BSL3/4 VHF national
reference laboratory
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Cinetica dell’RNA (SUDV Uganda 2000)
L’RNA virale è presente ad alti titoli fino a 10 g dopo inizio sintomi;
la sensibilità dei test non è un problema rilevante
Towner, J Virol 2004
Ricerca del virus mediante test di biologia
molecolare (EBOV-RVNA)
Rilevazione di una sequenza genica di EBOLA
con RT-PCR Real-Time
Conferma dei positivi con un metodo basato su un
target diverso, ed esecuzione di una PCR classica
Caratterizzazione mediante sequenziamento della
regione amplificata con PCR classica
La sequenza ottenuta viene confrontata con le
sequenze disponibili nelle banche dati accessibili
via Web
Real-time PCR semi-quantitativa per il monitoraggio
clinico
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17
Tempi di risposta
Dall’arrivo dei campioni al laboratorio di virologia
dello Spallanzani, attivo h24
Test rapido malaria 1 ora
Real Time PCR Filovirus (Ebola) 4-6 ore
A meno di imprevisti….
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A proposito di imprevisti
•Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria
Necessità di bonificare la superficie esterna
Difficoltà a recuperare il campione residuo
disponibile
•Le informazioni sull’etichetta sono
incongruenti con quelle della scheda
Necessità di contattare chi ha inviato il
campione per escludere scambi di provette
•Il campione contiene inibitori o sostanze che
interferiscono con il saggio
Necessità di ricominciare dall’estrazione
•Altre circostanze impreviste (es. Scheda all’interno della
confezione)
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McElroy, JID 2014
A proposito di imprevisti
•Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria
Necessità di bonificare la superficie esterna
Difficoltà a recuperare il campione residuo
disponibile
•Le informazioni sull’etichetta sono
incongruenti con quelle della scheda
Necessità di contattare chi ha inviato il
campione per escludere scambi di provette
•Il campione contiene inibitori o sostanze che
interferiscono con il saggio
Necessità di ricominciare dall’estrazione
•Altre circostanze impreviste (es. Scheda all’interno della
confezione)
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McElroy, JID 2014
Esami accessori per la conferma
Il sequenziamento
Dudas, PloS Curr Outbreaks 2014
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Anticorpi
La ricerca degli anticorpi in genere ha
valore di documentazione retrospettiva
•Le IgM compaiono dopo 3 giorni e sono
fugaci (< 3 settimane)
•Le IgG persistono a lungo e sembrano
essere protettive
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Cinetica della comparsa di IgG e IgM
EBOV (Kikwit, DCR 1995)
IgM
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IgG
Ksiazek, JID 1999
Rivelazione della risposta umorale e
cellulare specifica
• Risposta umorale: eseguita mediante metodi
appositamente allestiti in laboratorio
(immunofluorescenza indiretta e test di
sieroneutralizzazione.
• Per la risposta cellulare vengono eseguite colture di
linfomonociti esposti agli agenti identificati, e la
rilevazione delle sottopopolazioni linfocitarie attivate
viene eseguita mediante rilevazione citofluorimetrica
delle citochine intracitoplasmatiche.
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24
Immunofluorescenza indiretta
Negative control
IgM positive sample
IgG positive sample
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25
Identificazione del virus
• Isolamento virale in colture di tessuto (BSL4)
e successiva caratterizzazione degli isolati con
metodi immunologici o molecolari.
• In casi particolari è previsto anche lo studio
morfologico in Microscopia Elettronica, sia
sull’isolato che sul campione biologico iniziale.
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26
Coltivazione del virus: BSL4
0<
0
-15
BSL3
-5.1
-5,1
-33
-10
-33
-50
BSL3
-15
-35
BSL4
Tipologia di campioni
Fase della malattia
Tipologia di campioni
Fase
acuta • Sangue con EDTA per RT-PCR
sintomatica
• Sangue senza anticoagulanti per
(Entro i primi 2-7 sierologia
giorni dall’esordio)
Eventuali campioni biologici
aggiuntivi:
• Urine
• Tamponi mucosali
• Altro
Fase convalescente
(risoluzione della
sintomatologia, e
comunque non
prima di 15 giorni
dall’inizio della
sintomatologia)
Tipologia di contenitore
• Provetta sterile infrangibile con EDTA
• Provetta sterile infrangibile
• Contenitore infrangibile sterile
• Tampone floccato in terreno di trasporto
virale in flacone infrangibile
• Da concordare con il Laboratorio
• Sangue con EDTA per RT-PCR • Provetta sterile infrangibile con EDTA
• Sangue senza anticoagulanti per • Provetta sterile infrangibile
sierologia
Eventuali campioni
aggiuntivi:
• Urine
• Tamponi mucosali
• Altro
biologici
• Contenitore infrangibile sterile
• Tampone floccato in terreno di trasporto
virale in flacone infrangibile
• Da concordare con il Laboratorio
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Prima di inviare campioni, è necessario contattare il
laboratorio.
Il Laboratorio di Virologia è attivo h24.
Il virologo di turno può essere reperito ai seguenti numeri:
•0655170666
•3204343793
Il virologo di turno effettuerà con il richiedente la valutazione
congiunta preliminare, e provvederà ad attivare le
procedure interne.
Ulteriori recapiti utili:
Accettazione: tel 0655170674; fax 0655170676
Segreteria: fax 065594555
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Preparazione dei campioni.1
• Il campione di scelta per la ricerca del virus è sangueEDTA (no eparina)
• I campioni vanno mantenuti a +4°C prima dell’invio
• Il trasporto al Laboratorio deve essere effettuato entro
il più breve tempo possibile, preferibilmente entro le
24 ore e a temperatura refrigerata
• Per tempi di consegna più prolungati, concordare con
il Laboratorio le modalità di preparazione e
conservazione
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Preparazione dei campioni. 2
• I prelievi devono essere accompagnati dalla scheda
dati, riportata in calce alle istruzioni, compilata in
tutte le sue parti
• Su ogni singolo campione deve essere apposta
un’etichetta riportante a chiare lettere il nome del
paziente, la tipologia del campione (sangue, urine,
altro) e la data di prelievo.
• Le informazioni riportate sulle provette devono
essere coerenti con quelle inserite nella scheda dati.
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Confezionamento e trasporto dei campioni
• Il campione va confezionato seguendo il principio
del triplo involucro
• Il trasporto dei campioni al laboratorio va eseguito
secondo le raccomandazioni per i campioni a
rischio biologico
(Circolare Ministeriale n°3/2003 “Raccomandazioni
per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi
e di campioni diagnostici”)
L’invio va concordato con il Laboratorio
x
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Consegna dei campioni
L’indirizzo cui inviare in campioni è:
Laboratorio di Virologia
Padiglione Baglivi
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Ingresso carrabile:
via Giacomo Folchi, 6a
00149 Roma
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Scheda di raccolta dati per la diagnosi di Laboratorio in caso
di sospetta infezione da virus Ebola
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Recapito del richiedente (possibilmente tel. cellulare)__________
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