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Chimica Biologica A.A. 2010-2011 Ciclo dell’Acido Citrico Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano Macromolecole Biologiche Ciclo dell’Acido Citrico - la glicolisi non è l’unica via catabolica in grado di produrre energia Anzi, le cellule che dipendono solo dalla glicolisi per soddisfare le proprie necessità metaboliche sprecano la maggior parte dell’energia chimica potenziale dei carboidrati perché il glucosio viene convertito in prodotti come il lattato e l’etanolo che lasciano la cellula in forma ancora relativamente ridotta Ciclo acido citrico, o “ciclo di Krebs”, o “ciclo acidi tricarbossilici”(TCA) - via catabolica fondamentale del metabolismo aerobico - rappresenta la via comune della degradazione ossidativa di tutti i nutrienti energetici (carboidrati, lipidi, e anche proteine) nelle cellule aerobiche Macromolecole Biologiche Ciclo dell’Acido Citrico - dal punto di vista biochimico, la respirazione è l’ossidazione da parte dell’O2 di substrati organici - negli eucarioti la respirazione cellulare ha sede nel mitocondrio - la respirazione avviene in 3 stadi: (1) generazione di acetil-CoA forma attivata di gruppo acetile, composto a 2 atomi di carbonio (2) ossidazione del gruppo acetile dell’acetil-CoA (ciclo dell’acido citrico) ⇒ produzione di CO2 e trasportatori ridotti di elettroni (NADH, FADH2) (3) ossidazione da parte dell’O2 dei trasportatori ridotti di elettroni nel trasporto degli elettroni accoppiato alla sintesi di ATP (fosforilazione ossidativa) Macromolecole Biologiche Vie Metaboliche Compartimentalizzazione cellulare Macromolecole Biologiche Ciclo dell’Acido Citrico Localizzazione del Catabolismo Ossidativo Il mitocondrio: “centrale energetica” della cellula - sito dove avviene il metabolismo ossidativo degli eucarioti Contiene: vedi diapositiva precedente - piruvato deidrogenasi (1) - alcuni enzimi del ciclo dell’acido citrico (2) - enzimi che catalizzano l’ossidazione degli acidi grassi - enzimi e proteine redox coinvolte nel trasporto degli elettroni e nella fosforilazione ossidativa (3) ~ 2000 mitocondri in una cellula eucariotica che occupano ~1/5 del volume totale della cellula - forma ellittica e dimensioni ~0.5 x 1.0 μm ~ dimensioni di un batterio Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA Sintesi dell’acetil-CoA - i gruppi acetilici entrano nel ciclo TCA come parte del composto ad alta energia acetil-CoA (i tioesteri sono composti con elevata energia libera di idrolisi) - una proteina di trasporto trasferisce il piruvato insieme a H+ all’interno dei mitocondri per l’ulteriore ossidazione (simporto piruvato-H+) - decarbossilazione ossidativa del piruvato ⇒ Acetil-CoA - complesso multienzimatico della Piruvato deidrogenasi contenente 3 enzimi in copie multiple e 5 coenzimi Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA Complesso della Piruvato deidrogenasi - complesso multienzimatico contenente 3 enzimi in copie multiple E1 ⇒ piruvato deidrogenasi E2 ⇒ diidrolipoil transacetilasi E3 ⇒ diidrolipoil deidrogenasi E.coli: 60 subunità totali (~4600 kD, diametro ~300 Å) 24 proteine E2 (associate in trimeri agli angoli di un cubo) palline verdi 24 proteine E1 (associate in dimeri lungo i 12 lati del cubo) palline arancioni 12 proteine E3 (associate in dimeri sulle 6 facce del cubo) palline viola - il complesso di mitocondrio di mammifero ha dimensioni doppie di quelle del complesso di E. coli e contiene anche subunità regolatorie Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA Complesso della Piruvato deidrogenasi vantaggi complessi multienzimatici - gruppi di enzimi associati in modo non covalente che catalizzano 2 o più tappe in successione di una via metabolica - evoluzione verso una maggior efficienza catalitica: (a) minimizzazione delle distanze percorse dai substrati per raggiungere i vari siti attivi ⇒ aumento della velocità di reazione (b) riduzione di reazioni fra intermedi metabolici di reazioni successive con altre molecole (minimizzazione reazioni collaterali) (c) le reazioni possono essere controllate in modo coordinato Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA Complesso della Piruvato deidrogenasi - il complesso catalizza 5 reazioni enzimatiche in successione stechiometria totale Piruvato + CoA + NAD+ → acetil-CoA + CO2 + NADH - 5 diversi coenzimi: (a) tiamina pirofosfato (TPP) (b) lipoamide (c) coenzima A (d) FAD (e) NAD+ Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA 1) Piruvato deidrogenasi (E1) - enzima TPP-dipendente Reazione: decarbossilazione del piruvato con formazione dell’intermedio idrossietil-TPP (reazione identica a quella catalizzata dalla piruvato decarbossilasi di lievito durante la fermentazione alcolica) Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA 1) Piruvato deidrogenasi ylid: carbanione dipolare (forma attiva di TPP) (1) attacco nucleofilico di ylid al C carbonilico del piruvato (2) rilascio di CO2 per dare un carbanione stabilizzato per risonanza anello tiazolico come trappola di elettroni Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA 2) Diidrolipoil transacetilasi (E2) - enzima contenente gruppo lipoamidico - lipoamide: acido lipoico legato con legame amidico al gruppo ε amminico di una Lys - centro reattivo: disolfuro ciclico che può essere ridotto reversibilmente con formazione di diidrolipoamide Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA 2) Diidrolipoil transacetilasi (E2) - l’intermedio idrossietil-TPP attacca il disolfuro della lipoamide e viene eliminata TPP - il carbanione idrossietile (forma attivata del gruppo aldeidico) viene ossidato a gruppo acetile e passato al lipoamide (formando un gruppo tioestere: forma attivata del gruppo acetile). - il disolfuro della lipoamide viene ridotto Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA 3) Diidrolipoil transacetilasi (E2) Reazione: transesterificazione in cui il gruppo acetile è trasferito sul CoA con formazione di acetil-CoA e diidrolipoamide-E2 CoA—SH + H Sintesi dell’Acetil-CoA Macromolecole Biologiche Acetil-CoA - il coenzima A è un trasportatore di gruppi acile attivati - la porzione attiva del CoA è il gruppo tiolico - l’acetil-CoA contiene un gruppo tioestere - l’acil-CoA ha un elevato potenziale di trasferimento del gruppo acile Sintesi dell’Acetil-CoA Macromolecole Biologiche Reazioni 1, 2, 3 riossidazione del gruppo lipoamide Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA 4) Diidrolipoil deidrogenasi (E3) Reazione: rigenerazione (riossidazione) del gruppo lipoamide di E2 da parte di E3 - E3 nella forma ossidata contiene un gruppo disolfuro ed un FAD - l’ossidazione della diidrolipoamide è una reazione di interscambio di disolfuri Sintesi dell’Acetil-CoA Macromolecole Biologiche Reazioni 1, 2, 3, 4 riossidazione di E3 ridotta Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA 5) Diidrolipoil deidrogenasi (E3) Reazione: riossidazione di E3 ridotta - i gruppi sulfidrilici vengono riossidati dal FAD - il FADH2 risultante viene ossidato dal NAD+ producendo NADH Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA 5) Diidrolipoil deidrogenasi (E3) - il FAD legato a proteine ha un potenziale di riduzione ~0 V - FADH2 è inadatto per donare elettroni a NAD+ (E0’ = -0.315 V) - nella diidrolipoil deidrogenasi FAD non diventa mai completamente ridotto a FADH2 - grazie al preciso posizionamento dell’anello flavinico e nicotinamidico, il FAD agisce come “conduttore di elettroni” dal disolfuro della proteina a NAD+ attraverso la formazione transiente di un anione flavinico FADH- Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA Complesso della Piruvato deidrogenasi - il gruppo idrossietile legato alla TPP viene trasferito alla lipoamide ossidata riducendola a diidrolipoamide - l’idrossietile (aldeide) viene contemporaneamente ossidato ad acetile - quando l’acetile è trasferito al CoA, due elettroni restano sulla diidrolipoamide Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA Complesso della Piruvato deidrogenasi Braccio di lipoillisina - incanalamento degli intermedi di reazione fra E2 (core complesso) ed E1 e E3 - il braccio di lipoillisina si comporta come una lunga articolazione che fa oscillare il gruppo disolfuro da E1 al sito attivo di E2 e poi su E3 ⇒ da E1 raccoglie un gruppo idrossietilico ⇒ nel sito attivo di E2 il gruppo idrossietilico è trasferito per formare acetil-CoA ⇒ su E3 viene riossidato il gruppo disolfuro ridotto - una proteina E1 è in grado di acetilare numerose proteine E2 e una proteina E3 può riossidare diversi gruppi diidrolipoamidici Macromolecole Biologiche Sintesi dell’Acetil-CoA Inattivazione del Complesso della Piruvato deidrogenasi Avvelenamento da Arsenico - inattivazione da parte dell’arsenito (AsO33-) e degli arsenicali organici degli enzimi contenenti lipoamide (Es: complesso della piruvato deidrogenasi e α-chetoglutarato deidrogenasi) ⇒ blocco respirazione - legano composti sulfidrilici che possono formare addotti bidentati - AS-organici più tossici per i microorganismi che per l’uomo ⇒ uso antibiotico (effetti collaterali piuttosto gravi) Napoleone Darwin coloranti tappezzerie “soluzione di Fowler’s” Macromolecole Biologiche Ciclo dell’Acido Citrico Ciclo Acido Citrico - Ciclo di Krebs o Ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA): - serie di 8 reazioni che ossidano il gruppo acetile dell’acetil-CoA a 2 molecole di CO2, conservando l’energia libera prodotta nei composti ridotti NADH (3 molecole) e FADH2 (1 molecola) ed un composto ad alta energia (1 molecola di ATP o GTP) reazione netta: 3NAD+ + FAD + GDP + Pi + acetil-CoA → 3NADH + FADH2 + GTP + CoA + 2 CO2 - l’ossidazione di un gruppo acetile a 2 CO2 richiede il trasferimento di 4 paia di e- ⇒ riduzione di 3 NAD+ e di un FAD Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche Ciclo Acido Citrico - il ciclo TCA si comporta come un catalizzatore a tappe multiple in grado di ossidare un numero illimitato di gruppi acetili (l’ossalacetato consumato nella prima tappa è rigenerato nell’ultima reazione del ciclo) ⇒ l’ossalacetato è sia un reagente della prima reazione, sia un prodotto dell’ultima Macromolecole Biologiche Ciclo dell’Acido Citrico Ciclo Acido Citrico - negli eucarioti tutti gli enzimi del ciclo TCA sono localizzati nei mitocondri ⇒ tutti i substrati (compresi NAD+ e GDP) devono essere generati nei mitocondri o trasportati al loro interno dal citosol ⇒ tutti i prodotti devono essere consumati nei mitocondri o trasportati al loro esterno dal citosol - il risultato netto di un ciclo è l’ossidazione di un gruppo acetile a 2 CO2, ma gli atomi di carbonio delle 2 molecole di CO2 non sono quelli del gruppo acetile - gli intermedi del ciclo TCA sono anche precursori della biosintesi di altri composti (es: ossalacetato per la gluconeogenesi) Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche 1) Citrato sintasi Reazione: condensazione di acetil-CoA ed ossalacetato - meccanismo cinetico sequenziale ordinato: ⇒ l’ossalacetato si lega all’enzima prima dell’acetil-CoA - reazione fortemente esoergonica dato che l’acetil-CoA ha un forte potenziale di trasferimento del gruppo acetile - “sintasi”: gruppo di enzimi che catalizzano reazioni di sintesi senza impiego di ATP (come invece avviene nel caso delle “sintetasi”) (liasi) Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche 1) Citrato sintasi - proteina dimerica enzima libero (forma aperta) enzima + ossalacetato (forma chiusa) sito legame ossalacetato - il cambiamento conformazionale genera il sito di legame per l’acetil-CoA ed isola il sito di legame dell’ossalacetato dal solvente Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche 2) Aconitasi Reazione: Isomerizzazione reversibile del citrato in D-isocitrato ⇒ trasferimento del gruppo -OH del gruppo alcoolico terziario al carbonio adiacente, a dare un gruppo alcoolico secondario più adatto ad essere ossidato a gruppo carbonilico - l’aconitato (che da il nome all’enzima) è un intermedio che esiste solo come complesso con l’enzima Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche 2) Aconitasi a) deidratazione: vengono rimossi un protone ed un gruppo OH b) reidratazione: … del doppio legame del cis-aconitato ⇒ si potrebbero formare 4 potenziali stereoisomeri per l’isocitrato. Invece la aconitasi catalizza l’addizione stereospecifica di OH- e H+ con la produzione di un solo stereoisomero Citrato = molecola prochirale ⇒ diventa chirale per sostituzione di un gruppo carbossimetilico –CH2COO-) - interazione asimmetrica (su 3 punti) fra citrato ed enzima Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche 3) Isocitrato deidrogenasi NAD+-dipendente Reazione: decarbossilazione ossidativa dell’isocitrato ad α-chetoglutarato - viene prodotta la prima molecola di CO2 e di NADH del ciclo dell’acido citrico (NB: CO2 proviene dall’ossalacetato e non dall’acetil-CoA) - l’enzima usa Mn2+ o Mg2+ come cofattori a) ossidazione di un alcol secondario (isocitrato) a chetone (ossalosuccinato) b) decarbossilazione del gruppo carbossilico β a chetone Mn2+ aiuta la polarizzazione del gruppo carbonilico che si forma l’intermedio ossalosuccinato esiste transientemente e non si dissocia dall’enzima Macromolecole Biologiche Ciclo dell’Acido Citrico 4) α-chetoglutarato deidrogenasi Reazione: decarbossilazione ossidativa di un α-chetoacido (α-chetoglutarato) - viene prodotta la seconda molecola di CO2 e di NADH del ciclo dell’acido citrico (NB: CO2 proviene dall’ossalacetato e non dall’acetil-CoA) ⇒ durante ogni ciclo vengono ossidati 2 atomi di C a CO2, ma gli atomi dei gruppi acetili che entrano nel ciclo vengono ossidati a CO2 nei giri successivi (come ossalacetati) Macromolecole Biologiche Ciclo dell’Acido Citrico 4) α-chetoglutarato deidrogenasi - multicomplesso enzimatico simile (e reazione identica) alla piruvato deidrogenasi: - α-chetoglutarato deidrogenasi (E1) - diidrolipoil transsuccinalasi (E2) - diidrolipoil deidrogenasi (E3) (identica a E3 della piruvato deidrogenasi) Prodotto: formazione di un tioestere ad alta energia (succinil-CoA) ⇒ parte dell’energia della decarbossilazione ossidativa è convertita nel gruppo tioestere del succinil-CoA (passaggio è fortemente esoergonico) Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche 5) succinil-CoA sintetasi Reazione: accoppiamento della scissione esoergonica (ΔG0’ = -32.6 kJ/mole) del legame al “alta energia” del succinil-CoA alla sintesi endoergonica (ΔG0’ = 30.5 kJ/mole) di un nucleotide trifosfato ad “alta energia” (fosforilazione a livello del substrato) nome riferito alla reazione inversa mammiferi: sintesi di GTP da GDP + Pi piante e batteri: sintesi di ATP da ADP + Pi reazioni energeticamente equivalenti poiché ATP e GTP sono interconvertibili rapidamente mediante la reazione della nucleoside difosfato chinasi Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche 6, 7, 8 - dopo la quinta reazione l’equivalente di un gruppo acetile è stato completamente ossidato a 2 CO2 e sono stati generati 2 NADH e 1 GTP - le ultime 3 reazioni del ciclo servono a convertire il succinato in ossalacetato in modo da completare il ciclo Macromolecole Biologiche Ciclo dell’Acido Citrico 6) succinato deidrogenasi Reazione: deidrogenazione flavina-dipendente del succinato con formazione di fumarato - l’ossidante è FAD, ossidante più forte del NAD+ - la reazione è stereospecifica ⇒ forma fumarato (configurazione trans, e non il suo stereoisomero cis, il maleato) - inibizione competitiva da malonato (analogo strutturale del succinato) Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche 7) fumarasi Reazione: idratazione del doppio legame del fumarato a formare malato - formazione di un carbanione nello stato di transizione (l’addizione di OH- prima dell’addizione di H+) Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche 8) malato deidrogenasi Reazione: rigenerazione dell’ossalacetato - ossidazione NAD-dipendente del gruppo ossidrilico del malato - stesso meccanismo della lattato deidrogenasi e dell’alcol deidrogenasi (strutture molto simili) Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche 8) malato deidrogenasi - ΔG0’ = +29.7 kJ/mole ⇒ all’equilibrio (e in condizioni cellulari) la conc. di ossalacetato è molto bassa rispetto a quella del malato - Citrato sintasi: ΔG0’ = -31.1 kJ/mole reazione fortemente esoergonica ⇒ la formazione di citrato diventa un processo esoergonico anche alle basse [ossalacetato] presenti nelle cellule e quindi aiuta lo svolgersi del ciclo dell’acido citrico (si capisce ora il bisogno di un processo così esoergonico che apparentemente sembrava uno spreco di energia) Macromolecole Biologiche Ciclo dell’Acido Citrico Reazione bilanciata di un giro attraverso il ciclo dell’acido citrico Acetil-CoA + 3H2O +3NAD+ + FAD + GDP + Pi → 2CO2 + 3NADH + FADH2 + CoA-SH + GTP - il GTP è energeticamente equivalente all’ATP: la nucleoside difosfato chinasi interconverte gli NTP - la reazione bilanciata complessiva del catabolismo del glucosio attraverso glicolisi + ciclo dell’acido citrico è: Glucosio + 2H2O + 10NAD+ + 2FAD + 4ADP + 4Pi → 6 CO2 + 10 NADH + 6H+ + 2FADH2 + 4ATP Macromolecole Biologiche Ciclo dell’Acido Citrico Capacità del ciclo di produrre energia - ossidazione del gruppo acetile a 2 molecole di CO2 (non sono gli atomi di C del gruppo acetile entrante che vengono ossidati) che coinvolge 4 coppie di elettroni, infatti - per ogni acetil-CoA che entra nel ciclo: 3 NAD+ sono ridotti a NADH ⇒ acquisto di 3 coppie di elettroni 1 FAD è ridotto a FADH2 ⇒ acquisto di 1 coppia di elettroni viene prodotto 1 GTP (o ATP) - gli elettroni trasportati da NADH entrano nella catena di trasporto degli elettroni con riduzione finale di O2 ad H2O - l’energia ricavata dal trasporto degli elettroni viene conservata per la sintesi di ATP che avviene mediante la fosforilazione ossidativa riduzione NADH ⇒ produzione di ~2.5 ATP a partire da ADP + Pi riduzione FADH2 ⇒ produzione di ~1.5 ATP Macromolecole Biologiche Ciclo dell’Acido Citrico Capacità del ciclo di produrre energia - glicolisi: 1 glucosio viene convertito in 2 molecole di piruvato ⇒ 2 ATP + 2 NADH (~7 ATP) 5 ATP 2 ATP - complesso piruvato deidrogenasi: 2 molecole di piruvato convertite in 2 acetil-CoA ⇒ 2 NADH (~5 ATP) 5 ATP - per ogni ciclo si generano ~ 10 ATP ⇒ 2 giri del ciclo dell’acido citrico (uno per gruppo acetile) (~20 ATP) 15 ATP 3 ATP 2 ATP In condizioni aerobiche 1 glucosio può potenzialmente promuovere la sintesi di ~32 ATP. Solo 2 ATP in condizioni di anaerobiosi Ciclo dell’Acido Citrico Macromolecole Biologiche Regolazione del ciclo Tappe che limitano la velocità del ciclo condizioni standard - 3 enzimi operano in condizioni lontane dall’equilibrio - meccanismi di regolazione a) disponibilità del substrato (specialmente NAD+) b) inibizione da prodotto c) inibizione retroattiva competitiva di intermedi prodotti più avanti nel ciclo d) regolazione allosterica e) modificazioni covalenti (fosforilazione)
