PROGETTI A CONCORSO 2009-2010 - VINCITORI
PROGETTO N. 7
CDR / 150 / 02
RESPONSABILE PROGETTO: FLAVIO ANDREA CAPRIOLI
FINANZIAMENTO: € 50.000,00
Titolo del progetto:
Ruolo dell’interleuchina-21 e dei linfociti Th17 nella patogenesi della graft-versus-host disease acuta dopo
trapianto allogenico di midollo osseo.
Responsabile scientifico del progetto di ricerca:
Dott. Flavio Caprioli
Medico Chirurgo – Specialista in Gastroenterologia ed Endoscopia Digestiva
Dottorando di ricerca in Gastroenterologia – Università degli Studi di Milano
Sinossi del progetto:
Il trasferimento di linfociti T maturi da donatore a ricevente di trapianto allogenico di cellule staminali
emopoietiche è responsabile dello sviluppo di graft-versus-host disease (GVHD), una reazione causata dal
riconoscimento da parte di linfociti del donatore di alloantigeni di natura proteica presenti nell’organismo del
ricevente. In organi bersaglio di pazienti con GVHD si verifica una deplezione progressiva di linfociti T
regolatori (Tregs), cellule ad attività immunosoppressoria, ed un incremento di Th17, linfociti con
caratteristiche proinfiammatorie, necessari allo sviluppo di fenomeni autoimmunitari. La differenziazione di
Tregs da cellule T naïve richiede l’apporto di transforming growth factor(TGF)-β. L’interleuchina(IL)-21, una
citochina prodotta da linfociti CD4+, è criticamente coinvolta nella polarizzazione di linfociti naïve in Th17,e
nella contemporanea inibizione della differenziazione di Tregs mediata da TGF-β.
Il lavoro sarà focalizzato su tre obiettivi fondamentali:
1. Valutare se l’IL-21 viene prodotta in eccesso a seguito di trapianto di cellule staminali emopoietiche,
e durante il corso di GVHD acuta nell’uomo
2. Valutare le relazioni esistenti fra la produzione di IL-21 e la polarizzazione T linfocitaria verso
specifiche linee differenziative (Th1,Th2,Th17) in corso di trapianto di cellule staminali emopoietiche
e GVHD acuta nell’uomo
3. Valutare gli effetti diretti dell’IL-21 nel danno intestinale associato alla GVHD acuta
1.Studi recenti hanno dimostrato come IL-21 rappresenti un mediatore fondamentale nell’innesco e nella
amplificazione di numerose vie infiammatorie alla base di risposte patologiche immuno-mediate nell’uomo. In
accordo con ciò, un’aumentata produzione di IL-21 è stata descritta in corso di patologie umane T-mediate,
come il lupus eritematoso sistemico, le malattie infiammatorie croniche intestinali, e la malattia celiaca.
Inoltre, il blocco farmacologico di IL-21 si è dimostrato in grado di attenuare il processo infiammatorio
sistemico e mucosale. In particolare, la dimostrazione che l’IL-21 risulta in grado di incrementare la
proliferazione e la sopravvivenza dei linfociti T CD4+ e CD8+, e di regolare il profilo delle citochine secrete
da queste cellule, rende l’IL-21 un possibile bersaglio per il trattamento delle patologie immuno-mediate, e ci
porta ad investigare il ruolo dell’IL-21 nella modulazione della risposta linfocitaria a seguito di reazione
alloimmune nell’uomo.
A tale fine, valuteremo inizialmente l’espressione sistemica e tissutale di IL-21 a seguito di trapianto
allogenico di midollo osseo e durante il decorso di GVHD acuta. Verranno effettuate determinazioni seriali di
IL-21 circolante in riceventi di trapianto allogenico di midollo ed in soggetti con GVHD acuta. Inoltre,
valuteremo la produzione di IL-21 in vitro da parte di linfociti CD4+ del sangue periferico isolati dagli stessi
pazienti. I livelli di IL-21 verranno comparati allo staging clinico della GVHD acuta, secondo i criteri di
classificazione proposti da Glucksberg et al., e tutti i dati verranno posti in relazione ad una popolazione di
controllo rappresentata da donatori di sangue sani, comparabili per sesso ed età con i pazienti, e da
riceventi di trapianto di midollo singenico o autologo. In questa fase dello studio, l’utilità della misurazione dei
livelli di IL-21 nella predizione delle manifestazioni di GVHD acuta verrà investigata come obiettivo
secondario.
Per valutare se l’IL-21 venga prodotta in eccesso nel contesto di organi bersaglio di GVHD acuta,
l’espressione di IL-21 verrà determinata in biopsie coliche in toto estratte da pazienti con GVHD intestinale, e
sottoposti ad endoscopia per motivi diagnostici. Verrà inoltre valutata la produzione di IL-21 da parte di
linfomonociti della lamina propria intestinale, e posta in relazione allo score della GVHD, come valutato da
un anatomopatologo in cieco rispetto allo score endoscopico. I dati verranno posti in relazione a quelli di
biopsie endoscopiche raccolte da soggetti sani, comparabili per sesso ed età, e sottoposti ad endoscopia
per lo screening del carcinoma del colon-retto.
2.Recenti scoperte riguardanti le basi molecolari della polarizzazione T linfocitaria hanno portato a
dimostrare differenze significative fra uomo e topo a riguardo dei fattori che determinano la differenziazione
linfocitaria in sottoclassi specifiche. In particolare, la polarizzazione Th17 nel topo risulta determinata dagli
effetti combinati di IL-21/IL-6 e TGF-β, mentre questo processo nell’uomo sembra essere indipendente da
quest’ultima citochina, e determinato soprattutto da alte concentrazioni delle citochine proinfiammatorie IL-1β
e IL-6. Al momento, il ruolo dell’IL-21 nella polarizzazione di cellule T naïve nell’uomo è scarsamente noto. In
questo contesto, il nostro gruppo ha recentemente riportato una riduzione significativa nella produzione in
vitro di IL-17A a seguito del blocco di IL-21 in cellule CD4+ intestinali estratte da pazienti con malattia di
Crohn, a suggerire un ruolo di questa citochina nella polarizzazione Th17 nell’uomo.
In questa parte dello studio, abbiamo in programma di valutare il ruolo funzionale dell’IL-21 nella
polarizzazione T linfocitaria nel contesto del trapianto allogenico di midollo osseo e nel corso di GVHD acuta
umana. In studi descrittivi, i livelli circolanti e tissutali di IL-21 verranno posti in relazione a quelli di citochine
prodotte da linfociti Th1 (IFN-γ, IL-12), Th2 (IL-4, IL-5) e Th17 (IL-17A, IL-22) a differenti tempi successivi
alla procedura trapiantologica. La produzione in vitro di IL-21 sarà correlata con quella delle citochine
sopramenzionate in culture di cellule CD4+ isolate dal sangue periferico e dalla lamina propria del colon di
pazienti con GVHD acuta. Inoltre, l’espressione di fattori di trascrizione specifici per cellule T (T-bet, Stat4,
Gata-3, RORC, Foxp3) verrà valutata in campioni di tessuto ed in cellule CD4+ isolate. In studi ulteriori,
valuteremo gli effetti del blocco dell’IL-21 mediante uno specifico anticorpo monoclonale sulla produzione in
vitro di citochine, e sull’espressione di fattori di trascrizione specifici per cellule T in colture di cellule di
sangue periferico, di lamina propria colica, ed in colture d’organo di pazienti con GVHD acuta.
3.E’stato recentemente suggerito come l’IL-21 possa esercitare ulteriori effetti nell’indirizzare l’infiammazione
tissutale ed il danno d’organo, oltre al già citato ruolo nella polarizzazione di linfociti T naïve. In questo
contesto, lavori del nostro gruppo hanno dimostrato un ruolo funzionale dell’IL-21 nel favorire la secrezione
della proteina infiammatoria macrofagica MIP-3α, una proteina chemotattica per le cellule T, da parte delle
cellule dell’epitelio intestinale, e nell’incrementare il reclutamento di linfociti CD4+ e CD8+ dalla circolazione
periferica alle aree di mucosa infiammata. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato come lo stimolo con IL21 possa indurre i fibroblasti intestinali a secernere metalloproteinasi della matrice intestinale, una famiglia di
enzimi che degrada selettivamente alcuni componenti della matrice extracellulare, pertanto promuovendo la
distruzione tissutale. Se i nostri esperimenti confermeranno aumentati livelli di IL-21 durante il corso di
GVHD acuta intestinale, valuteremo l’ipotesi che il blocco di IL-21 in pazienti con GVHD acuta intestinale
possa ridurre significativamente questi meccanismi di danno tissutale. A questo scopo, valuteremo
inizialmente i livelli di MIP-3α e di metalloproteinasi 1, 2, 3 e 9 in biopsie coloniche intere, in cellule epiteliali
intestinali, ed in fibroblasti estratti da pazienti con GVHD e controlli. Per confermare un ruolo funzionale per
l’IL-21 nelle vie infiammatorie sopramenzionate, valuteremo se il blocco in vitro dell’IL-21 possa
significativamente ridurre la secrezione di MIP-3α e di metalloproteinasi della matrice in colture d’organo di
pazienti con GVHD acuta intestinale.
