REAL-TIME PCR

Brucella spp IN LACRIME, UMORE ACQUEO E VITREO DI PECORE INFETTE,
ATTRAVERSO LA REAL-TIME PCR.
Brucella spp (REAL-TIME PCR) INTO TEARS, AQUEOUS AND VITREOUS HUMOR OF
INFECTED SHEEP
DI PIETRO S., GALBO A.*, BONANNO G., DE DOMENICO A., REALE S.**,
GIUDICE E.
Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Università di Messina, *Azienda Unità
Sanitaria Locale n° 5 – Messina, **I.Z.S. “A. Mirri” - Sicilia
PAROLE CHIAVE: Brucella spp., fluidi oculari, real-time PCR, ovini.
KEY WORDS: Brucella spp., ocular fluids, real-time PCR, ovine.
RIASSUNTO
Obiettivo del presente lavoro è stato quello di avvalersi della real-time PCR quale
strumento di elevato valore diagnostico nel riscontro della Brucella spp. in lacrime, umore
acqueo e corpo vitreo di pecore risultate positive ai test routinari impiegati nei piani di
eradicazione della malattia. La real-time PCR è stata effettuata su n° 18 pecore risultate
infette da Brucella spp. (esami sierologici); in particolare, il test biomolecolare è stato
eseguito su n°18 campioni di lacrime e su n°36 campioni rispettivamente di umore acqueo e
di vitreo. Il DNA di Brucella spp. è stato evidenziato in tutti i campioni lacrimali (100% di
positività), in n° 29 campioni di umore acqueo (80% di positività), in n° 23 campioni di
corpo vitreo (63% di positività). Sulla base dei risultati del presente lavoro è possibile
affermare che la real-time PCR può essere applicata per l’evidenziazione della Brucella
spp. nell’apparato oculare di pecore infette, quale test diagnostico altamente sensibile e
specifico.
SUMMARY
The objective of this study is to apply the real-time Polymerase chain reaction (PCR) as a
tool with a high diagnostic value to detect Brucella spp. in tears, aqueous and vitreous
serum-positive to Brucella spp.. Real-time PCR assay was performed in n° 18 infected
sheep: 18 lacrimal samples and respectively 36 aqueous and vitreous samples. Brucella
DNA was detected in all lacrimal samples (positivity: 100%); in 29 aqueous (positivity:
80%); and in 23 vitreous samples (positivity: 63%). On the basis of the results it is possible
to underline that real-time PCR can be applied to detect Brucella spp. in the ocular
apparatus of infected sheep, as a diagnostic tool with high sensitivity and specificity.
INTRODUZIONE
Brucella spp., batterio Gram-, è responsabile di diverse affezioni acute e/o croniche nelle
varie specie animali, uomo compreso. Nell’animale l’infezione può avvenire per via
digerente, respiratoria, attraverso la mucosa oculo-congiuntivale, vaginale o attraverso
soluzioni di continuo; nell’uomo si stabilisce sia per contatto diretto con animali e materiali
infetti sia per via indiretta attraverso l’ingestione di materiale contaminato. Una volta
all’interno dell’organismo ospite, il batterio, riconosciuto dalle cellule immunocompetenti,
superata la barriera linfonodale, si riversa nel circolo ematico, dando luogo ad una
batteriemia primaria con localizzazione in diversi organi (1). Prescindendo dalle più note
lesioni che il microorganismo può determinare in organi e tessuti, una particolare menzione
nell’uomo riguarda l’apparato oculare, dove Brucella spp. può determinare entità
nosologiche di una certa importanza che se non diagnosticate in tempo possono sortire degli
effetti alquanto gravi come: episcleriti, uveiti, neuropatie ottiche ed endoftalmiti (2), oltre a
forme di cheratocongiuntivite e dacrioadenite, con elevate concentrazioni di Brucella spp. a
livello delle ghiandole lacrimali (3). Nel cane Brucella canis è stata isolata dall’occhio e
riconosciuta responsabile di uveite ed endoftalmite (4), mentre nel cavallo Brucella abortus
viene ritenuta potenziale agente di uveite ricorrente da immunocomplessi (5); diversamente
dalle rare segnalazioni riportate in letteratura relativamente alle lesioni oculari da Brucella
spp. nel cane e nel cavallo, nella specie ovina i riferimenti bibliografici sono carenti. Scopo
del nostro lavoro è stato quello di valutare tramite la real-time PCR la possibile diffusione
della cellula batterica nei diversi tessuti oculari, al fine di evidenziarne la capacità di
determinare lesioni oculari. La diagnosi della malattia con i metodi di routine è abbastanza
controversa in quanto sia la siero agglutinazione rapida che la fissazione del complemento
danno luogo a reattività crociate; l’esame colturale, sebbene specifico, è abbastanza
indaginoso. L’uso di test biomolecolari, nel nostro caso della Real-Time PCR (PCR
quantitativa), consente una diagnosi certa e rapida, confermando uno stato di infezione
prima ancora che si verifichi la siero conversione nel soggetto. Inoltre essendo un’analisi
quantitativa, permette di conoscere la carica batterica del microrganismo e di valutare
meglio i potenziali danni creati dallo stesso.
MATERIALI E METODI
Il nostro studio è stato effettuato su n°18 pecore adulte, di razze diverse, tutte femmine,
risultate positive ai test di routine (SAR e FC) previsti dal piano nazionale di eradicazione
della brucellosi ovi-caprina. Prima della macellazione, che si è svolta presso il mattatoio di
Messina, tutti i soggetti, previa contenzione manuale, sono stati sottoposti ad esame
oftalmologico ed al prelievo del secreto lacrimale tramite pipette Eppendorf munite di
puntale, dalla porzione mediale del fornice congiuntivale inferiore. Subito dopo
l’abbattimento si è proceduto all’enucleazione del globo oculare ed al prelievo, tramite
centesi, dell’humor acqueo e dell’humor vitreo. I liquidi biologici prelevati sono stati
sottoposti a real-time PCR per Brucella spp., con limite di rilevabilità di 1 equivalente
genomico/ml.
Il sistema di PCR in real-time è stato sviluppato su Light Cycler (Roche), sfruttando la
chimica TaqMan che prevede l’uso di una coppia di primers e di una sonda marcata, scelte
omologhe ad una porzione del gene 16S. I test sono stati effettuati sulla base di una curva di
taratura, ottenuta saggiando diluizioni successive in base 10, di una soluzione di DNA di
Brucella equivalente a 106 batteri per ml. Secondo tale schema, sono stati ottenuti 6 punti
per curva, in un intervallo compreso tra 106 e 101 equivalenti genomici per ml di campione
estratto.
La miscela di reazione per il test è stata sviluppata come segue: FastStart DNA Master
Hybridization Probes (Roche)1x, 1pmol/ l per ciascun primer, 0,125pmol/ l di sonda
marcata, 5 l di estratto di DNA e H2O fino al completamento del volume di reazione
(20 l ).
Per quanto riguarda il programma di analisi, in seguito ad una iniziale denaturazione di 3
min a 95°C, si sono realizzati i seguenti cicli di reazione con 45 ripetizioni: 95°C per 5 sec,
60°C per 8 sec, 72°C per 10 sec. Il test biomolecolare è stato eseguito su n°18 campioni di
lacrime e su n° 36 campioni rispettivamente di umore acqueo e vitreo. La specificità e la
sensibilità del sistema sono state infine calcolate rispettivamente su campioni sicuramente
negativi e sicuramente positivi.
RISULTATI
Il DNA di Brucella spp. è stato evidenziato in tutti i campioni di secreto lacrimale (100% di
positività), in n° 29 campioni di umore acqueo (80,55% di positività) e in n°23 campioni di
corpo vitreo (63,89% di positività). In tabella 1 vengono riportati i dati relativi alla realtime PCR effettuata sui fluidi oculari, suddivisi in diverse classi, in relazione al numero di
equivalente genomico della cellula batterica presente in 1 ml di campione. In tabella sono
riportate inoltre le percentuali di positività rispetto al numero totale dei campioni.
Tabella 1
Liquido biologico
Eq. Gen/ml
1-100
Eq. Gen/ml
101-1000
Eq. Gen/ml
Totale positivi
> 1001
Lacrime
Humor acqueo
Humor vitreo
2 (11,11%) 15 (83,33%) 1 (5,56%)
21 (58,33%) 8 (22,22%) 0 (0%)
21 (58,33%) 2 (5,56%)
0 (0%)
18 (100%)
29 (80,55%)
23 (63,89%)
Le prove di ripetibilità hanno sempre confermato l’assenza di falsi positivi su campioni veri
negativi, (Specificità 100%) e l’assenza di falsi negativi su campioni veri positivi
(Sensibilità 100%). In tal senso è anche stata dimostrata la scarsa influenza che la matrice
di partenza può avere sul test.
CONSIDERAZIONI E CONCLUSIÓN
Da quanto riportato in tabella si evince che la Brucella spp. è presente in tutti i fluidi
esaminati, con maggiore incidenza nelle lacrime, nelle quali si riscontra una positività del
100%. La maggiore concentrazione del batterio nel secreto lacrimale supporta l’ipotesi di
una possibile penetrazione della brucella nell’organismo attraverso la via congiuntivale
anche nell’animale (1), così come riportato nell’uomo, dove sono state descritte più
frequentemente forme di dacrioadenite (2). Il rilevamento del DNA batterico a livello
dell’apparato oculare conferma la possibilità di localizzazione del batterio in queste
strutture anche nella specie ovina, in analogia con quanto riscontrato nell’uomo (6), e
depone per una diffusione per via ematica del microorganismo.
Il mancato riscontro di lesioni macroscopiche a carico dei tessuti oculari, nelle pecore
oggetto di studio, può essere rapportato ad uno stadio acuto della malattia; nell’uomo,
infatti, viene riportato che le uveiti in corso di brucellosi si instaurano nella fase cronica,
quale esito di una reazione immunitaria (7). In assenza di lesioni, la RT-PCR positiva viene
considerata nell’uomo una tecnica importante per diagnosticare l’infezione in fase precoce,
al fine di evitare l’instaurarsi di lesioni alquanto gravi, quali forme di endoftalmite con
conseguente perdita di funzionalità dell’organo (8).
Sulla base di quanto riscontrato è auspicabile, nell’ambito dell’oftalmologia comparata,
l’impiego di campioni lacrimali per la diagnosi di brucellosi oculare nell’uomo, considerata
la non invasività della tecnica di prelievo. La presenza del batterio a livello di humor
acqueo e vitreo in discrete quantità, esorta l’applicazione della real-time PCR anche su
questi fluidi.
La Real-time PCR risulta così essere un importante strumento di diagnosi e ricerca sia in
medicina umana che in medicina veterinaria, in quanto rappresenta un metodo rapido,
specifico (100%) e sensibile (100%) per la diagnosi e la quantificazione del patogeno.
Tramite la RT-PCR, viene valutata la carica batterica totale e non quella infettante. Questa
tecnica però non consente di effettuare un distinguo tra batterio vivo e morto, per cui risulta
opportuno associare a suddetta tecnica la semina su terreni di coltura oppure valutare la
presenza del genoma batterico al tempo “t0” nel campione, seminarlo in brodo e sempre con
lo stesso metodo, valutare la crescita esponenziale del genoma al tempo “t1”.
Se da un lato la RT PCR non riesce a discriminare tra batterio vivo o morto, dall’altro
considerata l’elevata diffusione della brucellosi tra la popolazione, in particolare tra le
categorie a rischio, non si puo´escludere che i fluidi oculari possano rappresentare un
veicolo di trasmissione anche per l’uomo, coem viene riportato per gli animali.. A tal
proposito sono ancora in itinere le ricerche riguardanti l’esame colturale dei campioni
oculari, al fine di accertare la possibilita` di crescita e moltiplicazione del batterio sul
materiale organico e il conseguente potere patogeno dello stesso.
In considerazione degli scarsi riferimenti bibliografici, riteniamo opportuno sottolineare il
carattere innovativo dell’applicazione della Real-time PCR, nella diagnosi della brucellosi
oculare nelle pecore, nonché la possibilità di quantificare, con tale metodica, la presenza del
patogeno nelle strutture oculari. Riteniamo anche che il presente studio sia da considerare
un importante contributo alle ricerche scientifiche condotte nell’ambito dell’oftalmologia
comparata.
BIBLIOGRAFIA
1) Farina R (1998) Brucella. In: Farina R e Scatozza F “Trattato di Malattie Infettive degli
Animali” II ed., UTET, Torino, pp. 155-179. 2) Güngör K, Bekir NA, Namiduru M (2001),
Acta Ophthalmol Scand, 79, 76-78. 3) Bekir NA, Güngör K, Namiduru M (2000), Eur J
Ophthalmol, 10 (3), 259-61. 4) Martin C.L. (1999) Ocular Manifestations of Systemic
Disease. In: Gelatt K.N. “Veterinary Ophthalmology” III ed. Lippincott Williams &
Wilkins, USA, 1409-1411. 5) Moore C.P. (1990) Disease of the Eye. In: Smith B.P. “Large
Animal Internal Medicine” ed. The C.V. Mosby Company, USA pp 1216, 1233. 6)
Bourcier T, Cassoux N, Karmochkine M, Lehoang P (1998), J Fr Ophtalmol, 21 (2), 126-7.
7) Walker J, Sharma OP, Rao NA (1992), Am J Ophthalmol, 75, 374-5. 8) Van Rooyen
MM, (1981), S Afr Med J. 60 (5), 206-7.