APPARATO LACRIMALE IN PECORE CON INFEZIONE DA Brucella spp.: REPERTI ISTOPATOLOGICI GHIANDOLARI ED ELETTROFORESI LACRIMALE LACRIMAL SYSTEM IN SHEEPS WITH Brucella spp INFECTION: GLANDULAR HISTOPATHOLOGICAL FINDINGS AND LACRIMAL ELECTROPHORESIS. GRUPPILLO A., GALIA S., BOSCO V.R.F., PARISI F., MAZZULLO G.*, PUGLIESE A. Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Università di Messina; * Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria, Università di Messina. PAROLE CHIAVE: apparato lacrimale, Brucella spp., pecora, real time PCR, istologia, elettroforesi. KEY WORDS: lacrimal system, Brucella spp., sheep, real time PCR, histology, electrophoresis. RIASSUNTO La ricerca è stata effettuata su n°20 pecore adulte siero-positive a Brucella spp.. Obiettivi del presente lavoro sono stati: individuare la presenza del batterio nell’apparato lacrimale attraverso la real-time PCR (ghiandola lacrimale principale e lacrime) e valutare eventuali lesioni isto-patologiche ghiandolari in rapporto alla presenza del batterio a livello oculare. Infine, determinare l’assetto quali-quantitativo del pattern proteico lacrimale, mediante elettroforesi su gel d’agarosio, al fine di evidenziare variazioni nella composizione proteica lacrimale. I tessuti ed i liquidi biologici prelevati sono stati sottoposti a real-time PCR per Brucella spp. La positività dei campioni è risultata del 100% per quanto riguarda il secreto lacrimale e leggermente inferiore per le ghiandole lacrimali. L’esame istologico effettuato sulle ghiandole positive alla PCR ha messo in evidenza la presenza di un infiltrato infiammatorio localizzato per lo più in sede perivascolare, verosimilmente riconducibile all’azione patogena delle brucelle sui tessuti presi in esame. L’elettroforesi lacrimale ha permesso di identificare nelle lacrime, su un valore di proteine totali di 7 g/dl, le seguenti frazioni proteiche: proteine a migrazione rapida (PMR) (valore medio: 15.82%); albumina (25.77%); lattoferrina ad elevato peso molecolare (37.55%) ed immunoglobuline (20.85%).Tali valori non presentano modificazioni significative rispetto al pattern proteico lacrimale fisiologico di specie. SUMMARY The research was carried on n°20 adult sheep serum-positive to Brucella spp. The objectives of this study were: to detect the bacterium into the lacrimal system using the real time PCR on the principal lacrimal gland and the tears, and to evaluate the histopathological lesions in the gland relate to the presence of the bacterial cell into the eye. Another aim was to determine the quali-quantitative protein lacrimal pattern using the agarose gel electrophoresis, underlying the possible variations in the protein composition of tears. On the biological samples the real-time PCR to detect Brucella spp. was carried. The lacrimal samples were all positive, while the lacrimal glands showed a lower positivity. The histological examination performed on the positive to Brucella spp. lacrimal glands showed the presence of an inflammatory perivascular infiltration, that can be related to the action of the pathogen into the tissues. The lacrimal electrophoresis allowed to identify into the tears the following protein fractions (total protein: 7 g/dl): proteins with a rapid migration (PMR) (mean value: 15.82%); albumin (25.77%); lactoferrin with elevated molecular weight (37.55%) and immunoglobulines (20.85%). Those values not show significant differences in respect to the physiological lacrimal protein pattern of this animal specie. PREMESSA La brucellosi ovi-caprina, sostenuta prevalentemente da Brucella melitensis, è un’infezione cosmopolita ad elevata contagiosità e rappresenta una tra le malattie zoonosiche più diffuse in tutto il bacino del Mediterraneo. L’uomo può contrarre l’infezione per via diretta, ossia a seguito del contatto con animali infetti, oppure per via indiretta attraverso il consumo di latte non pastorizzato o formaggi freschi ottenuti da latte infetto (1). Nella specie ovina l’infezione può realizzarsi per via orale, per via transplacentare e attraverso il coito; inoltre, soprattutto negli animali stabulati al chiuso la mucosa congiuntivale può rappresentare una via di trasmissione dell’infezione da non sottovalutare. Il batterio, una volta introdotto nell’ospite e moltiplicatosi nei fagociti e nel tessuto linfoide, determina reazioni flogistiche a carattere granulomatoso (granuloma brucellare), essudatizio-necrotizzante o purulento in organi quali milza, fegato, midollo osseo e linfonodi. Possono inoltre essere coinvolti anche l’apparato genitale (utero e placenta di femmine gravide, con conseguente aborto), la mammella (micromastite interstiziale granulomatosa), i reni, il testicolo, l’epididimo, le articolazioni, le guaine tendinee, le borse sinoviali e l’apparato oculare. In quest’ultimo caso, le manifestazioni oculari più comunemente riportate sono rappresentate da forme di episclerite, uveite, neuropatia ottica ed endoftalmite (2-7). Considerato l’importante ruolo svolto dalla specie ovina nell’ambito dell’epidemiologia della malattia e la carenza di dati bibliografici relativi alla brucellosi oculare in questa specie animale, obiettivo del presente lavoro è stato quello di effettuare una valutazione delle strutture oculari in pecore infette. In particolare, abbiamo rivolto la nostra attenzione all’apparato lacrimale (ghiandola lacrimale principale) e al secreto lacrimale, dal momento che l’occhio ed i suoi annessi possono rappresentare la prima via di penetrazione del patogeno nell’organismo ospite e la sede di una prima reazione immunologica locale. MATERIALI E METODI La nostra ricerca è stata effettuata su n°18 pecore adulte, di razze diverse, sottoposte al piano nazionale di eradicazione della brucellosi ovina e caprina. Su tutti i soggetti, prima della macellazione, si è proceduto ad effettuare: prelievo di sangue, esame oftalmologico e raccolta del secreto lacrimale di ciascun occhio tramite pipette Eppendorf, munite di puntale, poste tangenzialmente alla mucosa del fornice congiuntivale ventrale. Subito dopo l’abbattimento è stata effettuata l’enucleazione dei globi oculari e, successivamente, il prelievo delle ghiandole lacrimali principali. Parte di tessuto ghiandolare ed un aliquota di secreto lacrimale sono stati sottoposti a realtime PCR per Brucella spp., Mycoplasma spp. e Chlamydophila spp., con limite di rilevabilità di 1 equivalente genomico per ml. I rimanenti campioni lacrimali, mantenuti in ambiente refrigerato (4°C) durante il trasporto in laboratorio, sono stati sottoposti ad esame spettrofotometrico, per la determinazione del contenuto proteico totale, e ad elettroforesi zonale su gel d’agarosio, per valutare l’assetto quali-quantitativo del pattern proteico. L’identificazione di alcune frazioni proteiche contenute nelle lacrime è stata possibile grazie al confronto con protidogrammi di siero proveniente dagli stessi soggetti e sottoposti a migrazione parallela nelle medesime condizioni. La comparazione dei tracciati è stata possibile assumendo come riferimento la migrazione dell’albumina sierica, in quanto la quota di albumina lacrimale è anch’essa di derivazione ematica e la velocità di migrazione è identica in entrambi i campioni. Dai preparati istologici delle ghiandole lacrimali, previa fissazione dei tessuti in formalina tamponata al 10% e inclusione in paraffina, sono state ottenute sezioni di 4 µm di spessore, successivamente colorate con Ematossilina-Eosina (EE). RISULTATI La positività dei campioni per Brucella spp alla real-time PCR è risultata del 100% nel secreto lacrimale e del 41,66% nelle ghiandole. Di queste ultime, il 22,22% è risultato positivo solo a Brucella spp mentre nel 19,44% del campione esaminato la positività era legata alla compresenza di Brucella spp e Mycoplasma spp; La positività dei campioni per Mycoplasma spp. alla real-time PCR è risultata del 94,44% nel secreto lacrimale e del 69,44% nelle ghiandole, di cui il 50 % è risultato positivo solo a Mycoplasma spp. e il 19,44% a Brucella spp., associata a Mycoplasma spp. (Tabella 1 e 2); ancora, tutti i campioni sono risultati negativi per Chlamydophila spp. Nelle ghiandole lacrimali negative alla RT PCR per Brucella spp. l’esame istologico non ha messo in evidenza lesioni istopatologiche riconducibili all’azione patogena svolta dal batterio. Nelle ghiandole lacrimali risultate positive a Brucella spp. la valutazione istologica ha permesso di evidenziare un infiltrato infiammatorio localizzato per lo più in sede perivascolare e costituito prevalentemente da una popolazione linfo-istiocitaria e scarse plasmacellule. Relativamente al secreto lacrimale la concentrazione media delle proteine totali nei campioni oggetto di studio è stata di 7 g/dl. L’elettroforesi lacrimale, condotta in parallelo con la foresi sierica degli stessi soggetti quale campione di riferimento, ha permesso di identificare nelle lacrime le seguenti frazioni proteiche: proteine a migrazione rapida (PMR), albumina, lattoferrina ad elevato peso molecolare ed immunoglobuline. Le rispettive concentrazioni medie erano: PMR =1,13 g/dl (15.82%); albumina =1,75 g/dl (25.77%); lattoferrina ad elevato peso molecolare =2,61 g/dl (37.55%); immunoglobuline =1,49 g/dl (20.85%). Specie batterica Tipo di campione Secreto Ghiandola Tabella 1. Positività di ghiandole lacrimali e secreto. Specie batterica BRUCELLA SPP. MICOPLASMA SPP. CHLAMYDOPHILA SPP. 100% 41,66% 94,44% 69,44% - Tabella 2. Positività nella ghiandola lacrimale principale. BRUCELLA SPP. TOTALE BRUCELLA SPP. + 7 (19,45%) 18 (50%) 25 (69,45%) MICOPLASMA SPP. + 8 (22,22%) 3 (8,33)% 11 (30,55%) MICOPLASMA SPP. 15 (41,67)% 21 (58,33)% 36 (100%) TOTALE CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI La brucellosi rappresenta nel nostro paese un notevole problema per la salute pubblica, in quanto è caratterizzata da un’elevata diffusibilità tra la popolazione, comprese le categorie a rischio. Il coinvolgimento dell’apparato oculare in corso di brucellosi è un’evenienza tutt’altro che rara nell’essere umano, in cui sono stati osservati episodi di uveite ricorrente ed endoftalmite e più raramente cheratocongiuntivite e dacrioadenite. Al contrario, scarso interesse è stato riservato alle possibili lesioni oculari determinate da Brucella spp. negli animali da reddito (biblio). I risultati del presente lavoro sottolineano la presenza di Brucella spp a livello oculare nelle pecore, con particolare riferimento ad un interessamento dell’apparato lacrimale, come evidenziato dall’elevata positività dei test diagnostici impiegati, sia a livello del fluido lacrimale (100% di positività alla RT PCR) che delle strutture ghiandolari (40 % circa di positività). Tali riscontri, se da una lato evidenziano che il batterio può essere presente in elevate concentrazioni anche a livello oculare, dall’altro testimoniano la possibilità che le lacrime di animali infetti possono rappresentare un veicolo di trasmissione della brucellosi all’uomo e ad altri animali di non trascurabile interesse. Le lesioni istopatologiche riscontrate a livello delle ghiandole lacrimali positive tramite RTPCR a Brucella spp., pur non potendo essere considerate patognomoniche dell’infezione brucellare, possono essere verosimilmente ricondotte all’azione flogogena svolta da tali batteri sui tessuti ghiandolari presi in esame, confermando l’esistenza di una stretta correlazione tra brucellosi e lesioni oculari. La presenza dell’infiltrato linfoplasmocitario perivascolare ghiandolare può essere riconducibile, esclusivamente, all’azione flogogena di Brucella spp., considerata la negatività dei campioni esaminati a Chlamydophila spp. e l’assenza di lesioni istopatologiche ghiandolari in quei soggetti risultati positivi unicamente a Mycoplasma spp. I dati ottenuti nel presente lavoro rappresentano la prima segnalazione del coinvolgimento della ghiandola lacrimale principale in corso di infezione naturale di brucellosi ovina, così come dimostrato per le strutture extraoculari del bovino soltanto in seguito ad esposizione sperimentale al batterio. Diversamente nell’uomo sono già state riportate manifestazioni extra ed endo-oculari della malattia, con quadri clinici riferibili ad uveiti, endoftalmiti, dacrio-adeniti e neuriti ottiche (biblio). La valutazione elettroforetica delle proteine lacrimali degli animali infetti, comparata con il pattern proteico lacrimale della specie ovina in condizioni fisiologiche, non ha evidenziato differenze significative relativamente alla composizione quali-quantitativa del pool proteico lacrimale. Il quadro elettroforetico lacrimale riscontrato testimonia un normale funzionamento del sistema di produzione delle lacrime, evidentemente non inficiato in maniera significativa dalla presenza dei batteri in sede oculare. Ancora, la presenza di elevate concentrazioni di materiale genetico brucellare nelle strutture esterne dell’occhio (vedi tabella) può confermare, in analogia con quanto riportato in letteratura per la specie bovina (Meador VP et al., 1988), che la via congiuntivale possa rappresentare la porta d’ingresso della brucella nell’organismo ospite anche negli animali oggetto di studio. Quanto affermato sottolinea l’importanza di un precoce controllo diagnostico dei fluidi oculari, considerato che la oculo-congiuntivale rappresenta una via di trasmissione non trascurabile nell’ambito dell’epidemiologia della malattia, non potendo escludere a nostro avviso un contagio diretto intra ed interspecifico con tale materiale biologico, anche in assenza di lesioni oculari macroscopiche. Riteniamo, infine, che il nostro lavoro possa rappresentare un nuovo traguardo nell’ambito dell’epidemiologia e della profilassi della brucellosi, considerato che il riscontro di brucelle nella ghiandola lacrimale principale e nel secreto lacrimale di pecore infette è un reperto di nuova acquisizione, espressione della colonizzazione del patogeno nel segmento esterno dell’occhio. BIBLIOGRAFIA Hall WH (1991): Brucellosis. In: Evans AS & Brachman PS (Eds). Bacterial infection in humans. Plenum, New York, pp.133-149. Güngör K, Bekir NA, Namiduru M (2001). Acta Ophthalmol Scand, 79, pp. 76-78. 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