LM Sc.Biosanitarie Ricerca Diagnostica 2013-14
Premesse e riepilogo
Lezione 1
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LM Sc.Biosanitarie Ricerca Diagnostica 2013-14
Non esistono dispense autenticate dal Docente
Tom Strachan-Andrew Read
Genetica molecolare umana
Zanichelli
integrare con P.J.Russell
Genetica
EdiSES
o altro testo utilizzato nel corso di genetica
generale
e il testo di Biologia Molecolare
Saranno disponibili come supporto allo studio
del libro (non sono dispense) i Power Point delle
lezioni e fotocopie/PDF per integrare
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2
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Scopo del corso
Lo scopo di questo corso non e’ quello di imparare la clinica delle malattie, ma capire
come si sceglie un test diagnostico
nei casi di malattie che coinvolgono il materiale ereditario.
Quindi dovrete rinfrescarvi la Genetica fatta finora.
In questo corso parleremo di diagnostica e quindi necessariamente dovremo parlare di
malattie, ma ora come sempre le malattie ci servono come modelli per capire le
strategie.
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Cosa significa ricerca delle mutazioni.
Vi ricordo che mutazione significa semplicemente variazione di una sequenza
confrontata con una sequenza di riferimento. Da questo ne consegue che
mutazione non vuol dire che ci sia un effetto patologico. Vi ricordo la
definizione di polimorfismo:variazione presente nella popolazione con una
frequenza superiore a 1%. Per definizione un polimorfismo e’ innocuo, almeno
finche’ non si dimostra il contrario. E’ comunque vero che generalmente quando si
parla di mutazione si intende una variazione patogenetica e il polimorfimo viene
chiamato anche variante allelica, tuttavia non e’ completamente corretto e noi
specificheremo sempre mutazione patogenetica o non patogenetica
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Mutazioni
Il genoma umano, come tutti i genomi e’ plastico: la sopravvivenza di una specie
dipende dalla sua variabilita’ e dalla capacita’ di evolvere. Il genoma umano e’ il
risultato di eventi di poliploidizzazione che hanno modificato drasticamente il
numero cromosomico. Le mutazioni cromosomiche di solito alterano il fenotipo
riducendo la fitness, e sono pertanto rare a livello costituzionale, ma frequenti a
livello somatico nei tumori. A livello molecolare si distinguono diversi tipi di
mutazione che ormai dovreste conoscere percio’ vi risparmio il loro elenco.
La variazione di una sequenza in una popolazione naturale non comporta
necessariamente l’insorgenza di un fenotipo anomalo. Quando si parla di alleli di
un locus questi sono il risultato di una mutazione che per caso, per effetto della
deriva genetica si sono fissati nella popolazione
MEterozigosi media per il DNA genomico umano: ~0,0037 (0,37%). Cio’
significa che in due alleli circa 1:250-1:1000 basi sono diverse
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Mutazioni
Va ricordato che le mutazioni avvengono a caso percio’ sia il DNA
M codificante
che il non codificante sono egualmente suscettibili. Le
conseguenze sono ovviamente diverse. Le conseguenze nella parte
codificante (che costituisce circa il 3% del genoma umano) sono legate al
tipo di mutazione e anche questo lo sapete.
Il tasso di mutazione del DNA codificante risulta piu’ basso rispetto
al non codificante in quanto la pressione selettiva agisce eliminando
dalla popolazione gli alleli negativi e rendendo di fatto assenti nella
popolazione quelle mutazioni che alterino pesantemente la funzione
del prodotto genico (per es. le “frameshift” piu’ frequenti nel non
codificante).
Le mutazioni del DNA non codificante hanno effetto se avvengono nelle
sequenze regolatrici o nelle sequenze introniche deputate allo splicing.
Anche in questo caso l’effetto dipende dal mantenimento della funzione.
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Mutazioni
J Sostituzione silente: non determina alcun cambiamento nel prodotto:
l’amminoacido resta lo stesso. Dal momento che modifica la sequenza puo’
originare un RFLP. In qualche caso puo’ dare origine ad un sito di splicing
criptico e quindi essere tutt’altro che neutre come la semplice sequenza
potrebbe far pensare.
LSostituzione non senso: si origina un codone di stop. Dal momento che la
pressione selettiva e’ forte su un prodotto troncato prematuramente, sono
rare.
KSostituzione di senso errato:si origina un codone per un altro amminoacido
conservativa : il nuovo amminoacido ha caratteristiche chimiche simili al vecchio.
Pertanto l’effetto sul prodotto puo’ essere minimo e puo’ essere definito polimorfismo
sia a livello di DNA che di prodotto.
J
L
non conservativa: il nuovo ammnoacido e’ completamente diverso dal vecchio.
Puo’ avere effetti deleteri.
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Mutazioni
Il tasso e il tipo di sostituzioni percio’ e’ estremamente variabile fra i
diversi geni.
Alcune proteine come le ubiquitine hanno un livello di conservazione
totale nella scala zoologica dall’uomo al lievito. La loro sequenza a livello
di DNA indica che le sostituzioni ci sono, ma sono praticamente tutte
sinonime.
All’estremo opposto ci sono geni pochissimo conservati se non in brevi
domini nell’evoluzione come SRY. SRY ha una funzione chiave in tuttii
mammiferi, ma questa e’ demandata all’ HMG box, che corrisponde a 78
aa. I segmenti N- e C- terminali sono estremamente variabili, indicando
che per la funzione del gene questi segmenti non sono critici
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Mutazioni dinamiche
Mutazioni dovute all’espansione di trinucleotidi localizzati nelle regioni
codificanti o non-codificanti di alcuni geni, si originano per errori nella
replica del DNA.
Non tutte le espansioni sono instabili. Se l’aumento di lunghezza non e’
Keccessivo,
e’ una mutazione patogena ma stabile nella trasmissione. Si
comportano cioe’ come le mutazioni “canoniche”, e seguono le leggi di
Mendel
Gene HOXD13 : l’espansione determina la formazione di lunghi tratti di
polialananina, e provoca sinpolidattilia. E’ rimasta stabile per 7 generazioni
Quando una sequenza trinucleotidica cambia le proprie
Ldimensioni
da una generazione all’altra si parla di mutazioni
dinamiche
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Mutazioni che alterano i meccanismi
epigenetici: Imprinting
Principio dell’equivalenza dei gameti: l’espressione di un gene non dipende dal
sesso del genitore che lo trasmette.
Esclusione allelica: in alcuni tipi cellulari viene espresso uno solo dei due
alleli, anche se entrambi sono in grado di esprimersi. Si ha una emizigosi
funzionale:linfociti B e immunoglobuline, geni dei recettori olfattivi nei
neuroni ....
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Ricordiamo cosa non e’ e cosa e’ l’imprinting
LL’eredita’ mitocondriale non segue il principio dell’equivalenza dei gameti, ma in
questo caso non si parla di imprinting: i gameti sono effettivamente non equivalenti
in termini di contenuto genico perche’ il gamete maschile non contribuisce alla
dotazione di mitocondri dell’embrione.
L L’eredita’ legata al sesso non segue
il principio dell’equivalenza dei gameti, ma
di nuovo i gameti sono effettivamente non equivalenti perche’ i cromosomi
sessuali non sono del tutto omologhi. L’espressione di un fenotipo dovuto a un
locus localizzato sui cromosomi sessuali dipende dal sesso della progenie.
Imprinting genomico: espressione differenziata di un
gene perfettamente funzionale legata all’origine
parentale, indipendente dal sesso della progenie, che
puo’ essere limitata nello spazio e nel tempo.
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Modifiche nella configurazione della cromatina
Il cambiamento di configurazione, legato ad un effetto di posizione
per un riarrangiamento, puo’ portare alla manifestazione di fenotipi
patologici:
Aniridia: silenziamento del gene PAX6
Distrofia Facioscapolomerale: una delezione di 3-4Kb elimina dalla
regione compresa fra due geni: FRG1 e FRG2, delle sequenze ripetute
denominate D4Z4. La perdita di queste sequenze porta questi due geni
normalmente localizzati in due domini diversi, a mappare nello stesso
dominio. L’assenza delle ripetizioni che interagiscono con proteine regolatrici
per modificare l’espressione di questi geni, comporterebbe un over
espressione, con conseguente fenotipo patologico
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Mutazioni cromosomiche
Sono una categoria di mutazioni rara nel costituzionale, e il piu’ delle volte sono
patogenetiche. Possono provocare patologie gravi a livello dell’individuo e quindi non
vengono ereditate. Oppure ridurre la fitness per la presenza di gameti sbilanciati,
ma possono venir trasmesse alla generazione successiva per la loro tollerabilita’ in
eterozigosi. Sono frequenti nei tumori, dove possono indurre la tumorigenesi a causa
della creazione di geni ibridi, o perche’ portono alla sovraespressione di geni
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“Repetita iuvant”
Perche’ bisogna sempre tener presente cosa andiamo a testare oltre che il
come: i test sono tanti e oggi ce ne sono alcuni che abbreviano il percorso,
ma vanno scelti caso per caso
vi ricordate le complicazioni negli alberi genealogici? e gli altri problemi che
abbiamo trattato nelle prime lezioni di genetica umana?
sono ostacoli quando si vuole iniziare a studiare un fenotipo e ci si domanda:
come si eredita? dove mappa? che funzione potrebbe avere il gene wild
type? le variazioni che trovo in un gene candidato sono patogenetiche e
giustificano il fenotipo? Sono sicura di studiare il gene giusto e non uno
collegato?
sono ostacoli anche quando si fa diagnostica perche’ potrei trovarmi in una
situazione di quel tipo nelle famiglie che richiedono il test e quindi sbagliare
tenete presente che il test genetico si fa una volta sola nella vita il suo
risultato non cambia durante la vita
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complicazioni:Penetranza
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Penetranza
& Nel caso dei caratteri mendeliani classici il fenotipo corrisponde
esattamente al genotipo (compatibilmente con la dominanza e la
recessivita’). Spesso pero’ a livello del singolo individuo questo puo’non
essere vero o immediamente evidente.
& Un carattere
presenta penetranza pari al 100% quando tutti i
portatori di un certo allele manifestano il fenotipo corrispondente:
pisello verde o giallo, colore bianco, rosso, rosa o striato dei fiori,
nanismo acondroplasico nell’uomo, gruppo sanguigno ….
& Un carattere
presenta penetranza pari al 70% quando solo il 70%
degli individui portatori dell’allele manifestano il fenotipo.
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Penetranza
& La penetranza e’ quindi un concetto che si riferisce alla popolazione. A
livello del singolo individuo il carattere ha solo due possibilita’ : si
manifesta o non si manifesta. E’ piu’ frequente nei caratteri dominanti ed
e’ piu’ evidente nella genetica umana perche’ la genetica umana si applica
ad una popolazione “selvatica”. Gli animali da laboratorio sono
geneticamente piu’ omogenei, anche se chi opera con i transgenici sa bene
che un gene inserito in un ceppo invece che in un altro puo’ portare ad
espressioni diverse del fenotipo e questo aspetto viene sempre tenuto
presente
& Sapere che un fenotipo puo’ non essere completamente
penetrante, e’ critico per studiarne la genetica o fornire
consulenza genetica: un certo soggetto che non manifesta il
carattere puo’ essere portatore dell’allele mutato
& Es. Osteogenesi imperfetta : fragilita’ ossea, sclere
blu,anomalie dei denti perdita dell’udito.Alcuni soggetti
presentano solo le sclere blu. E’ critico percio’ il livello
17 di
indagine
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Penetranza ed espressivita’
&
La penetranza ridotta non e’ da confondere con l’espressivita’
variabile
&
L’espressivita’ e’ il grado di gravita’ con cui fra gli individui che
presentano il fenotipo questo si esprime: puo’ costituire un sottoinsieme
degli individui “penetranti”
&
Es. Neurofibromatosi: presenza di tumori lungo i nervi periferici e
regioni di pigmentazione scura (“macchie di caffelatte”)Tutti i portatori
presentano almeno uno dei segni, ma la gravita’ puo’ essere diversa
anche all’interno della stessa famiglia: un genitore con macchie e piccoli
tumori cutanei benigni puo’ avere un figlio che presenta tumori estesi e
maligni. (questa differenza non e’ prevedibile, si puo’ solo quantizzare il rischio
di ereditare l’allele non il fenotipo )
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Espressivita’ variabile
L alla base c’e’ l’ignoranza del difetto di base e/o della mutazione
& SINDROME: insieme di segni che nel singolo individuo possono
presentarsi tutti o solo in parte
☛Se il fenotipo e’ sindromico
& e’ tipica dei fenotipi dominanti, anche se la recessivita’ potrebbe
essere interpretata come un effetto della espressivita’ variabile
& l’allele a meno che non sia deleto o completamente inattivato,
a livello
molecolare e’ sempre “dominante”: il problema e’ avere i mezzi per vederlo
& al livello di popolazione un fenotipo presenta espressivita’ variabile quando
all’interno dell’insieme di soggetti sicuramente portatori il fenotipo presenta
gravita’ e/o complessita’ diversa. Anche all’interno della famiglia ci puo’
essere espressivita’ variabile
MPENETRANZA ED ESPRESSIVITA’ SONO CONCETTI CHE
SI RIFERISCONO AL FENOTIPO ALL’INTERNO DI UNA
POPOLAZIONE
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Complicazioni: espressivita’ variabile
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complicazioni:
imprinting
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Mosaicismo
MOSAICISMO SOMATICO E/O DELLA LINEA GERMINALE: un individuo
presenta alcune cellule mutate e altre no. Se le cellule mutate sono in
prevalenza rispetto a quelle wild-type si possono manifestare segni clinici della
malattia.
La mutazione e’ insorta durante lo sviluppo
embrionale. Piu’ precocemente insorge
maggiore e’ il numero di cellule mutate.
MESISTE UN RISCHIO DI
TRASMISSIONE DELLA MALATTIA.
Anche se non quantizzabile. Questo
sembra spiegare casi di famiglie con piu’ di
un figlio affetto, ma genitori sani e non
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22 (se nota).
portatori della mutazione
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Mosaicismo germinale
Figure 3.7, A new mutation in X-linked recessive Duchenne muscular dystrophy - Human Molecu...
Figure 3.7
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7573/figure/A300/?report=objectonly
A n e w m utatio n in X-lin ke d re ce s s ive Du ch e n n e m us cu lar dys tro phy
The three grandparental X chromosomes were distinguished using genetic markers, and are shown in blue, gray and white (ignoring recombination). III1 has the grandpaternal X, which has acquired a mutation at
some point in the pedigree. There are four possible points at which this could have happened:
If III1 carries a new mutation, the recurrence risk for all family members is very low.
If II1 is a germinal mosaic, there is a significant risk (but hard to quantify) for her future children, but not for her sisters.
If II1 was the result of a single mutant sperm, she has the standard recurrence risk for X-linked recessives, but her sisters are free of risk.
If I1 was a germinal mosaic all the sisters have a significant risk, which is hard to quantify.
From: Chapter 3, Genes in pedigrees
Human Molecular Genetics. 2nd edition.
Strachan T, Read AP.
New York: Wiley-Liss; 1999.
Copyright © 1999, Garland Science.
NCBI Bookshelf. A service of the National Library of Medicine, National Institutes of Health.
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Mosaicismo germinale
N
OI
CSp PSp
225 nt
72 nt
La diversa intensita’
della banda indica
che nel padre in
n°di cellule mutate
e’ ridotto,ecco
perche non
manifesta la
malattia
63 nt
del padre
M la mutazione e’ presente anche nelle cellule germinali
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M
Eterogeneita’ genetica
Eterogeneita’ genetica di locus
LIl fenotipo e’ il risultato di una catena di interazioni:
il risultato finale puo’ risultare simile anche quando i
locus sono diversi.
identificare con precisione i criteri di
JE’ importante
Eterogeneita’ allelica/Serie allelica
M
definizione
L Fenotipi diversi possono essere originati da
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mutazioni in siti diversi dello stesso25gene o da
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Complementazione
Figure 3.3, Complementation: parents with autosomal recessive profound hearing loss often ha...
Figu re 3 .3
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7573/figure/A280/?report=objectonly
Co m p le m e n ta tio n : pa re n ts w ith au to s o m al re ce s s ive p ro fo u n d h e ar in g lo s s o fte n h a ve ch ild re n w ith n o rm al h e arin g
II6 and II7 are offspring of unaffected but consangineous parents, and each has affected sibs, making it likely that each has autosomal recessive hearing loss. All their children are unaffected, showing that II6 and II7
have nonallelic mutations.
From: Chapter 3, Genes in pedigrees
Human Molecular Genetics. 2nd edition.
Strachan T, Read AP.
New York: Wiley-Liss; 1999.
Copyright © 1999, Garland Science.
NCBI Bookshelf. A service of the National Library of Medicine, National Institutes of Health.
L’eterogeneita’ di locus e’ comune nelle sindromi che si originano per
l’alterazione di un pathway complesso
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Eterogeneita’ genetica di locus
&Questo concetto si applica alla popolazione ed e’ un indice della
nostra ignoranza dei processi che portano all’espressione del fenotipo
&Il fenotipo puo’ essere molto lontano dal gene e dal suo prodotto
primario in quanto esso risulta dall’interazione di prodotti genici.
Il primo passo e’ definire le modalita’ di trasmissione:
Uno stesso fenotipo puo’ mostrare tipi di ereditarieta’ diversa :questo
immediatamente segnala la presenza di piu’ loci.
Retinite pigmentosa ~12 locus X-linked, ~20 locus
autosomici trasmessi sia come caratteri recessivi che
dominanti
Alterazioni del collagene di tipo1: ci sono 2 loci dal
momento che questo collagene e’ formato da un
eterotrimero: il fenotipo viene comunque
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identificato come Osteogenesi imperfetta 27
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Eterogeneita’allelica/Serie allelica
Fenotipi diversi possono essere originati da mutazioni in siti diversi
dello stesso gene o da tipi diversi di mutazione.
L
☛AR : la mutazione puntiforme che provoca l’inattivazione del gene origina
la femminilizzazione testicolare. L’espansione di triplette l’atrofia
muscolo-spino-bulbare
☛Ret: Mutazioni che provocano la perdita di funzione originano la sindrome
di Hirschsprung. Mutazioni puntiformi che generano un aumento di funzione
originano tumori familiari delle ghiandole endocrine
☛PMP22: la duplicazione di una regione di 1.5 Mb provoca CMT1A,distrofia
muscolare neurogena con ipomielinizzazione delle fibre nervose. La delezione
della stessa regione HNPP: sindrome neurologica con paralisi e ipermielinizzazione
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Ancora complicazioni:Serie allelica
L
Fenotipi diversi possono essere originati da
mutazioni in siti diversi dello stesso gene o da tipi
diversi di mutazioni.
NON CONFONDERE CON ALLELIA MULTIPLA/
ETEROGENEITA’ ALLELICA:
il gene white in Drosophila, i gruppi sanguigni nell’uomo… la maggior parte
delle malattie genetiche
M
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Eredità digenica
La malattia è dovuta all’effetto additivo di mutazioni
ETEROZIGOTI in loci diversi
Forma di retinite pigmentosa che si manifesta
in individui DOPPI ETEROZIGOTI per i geni ROM1 e
per la periferina (RDS) che codificano per i
fotorecettori. Le mutazioni in eterozigosi
separatamente non causano alcun fenotipo patologico
By NA
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Eredità digenica pedigree
AFFETTO
ROM1+/RDS+/-
ROM1+/+
RDS+/+
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ROM1+/RDS+/+
NON AFFETTO
ROM1+/+
RDS+/+
ROM1+/+
RDS+/-
ROM1+/RDS+/-
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Eredità triallelica
Sindrome di Bardet –Biedl (BBS): sindrome dismorfica caratterizzata da
obesità, polidattilia, patologia renale, deficit cognitivo
Carattere autosomico recessivo, ma la condizione che si riscontra è quella di
due mutazioni in un locus ed eterozigote in un altro locus associato
X X
X
X
X X
X
XX
X X
XX
X
X
XX
X
AFFETTI
By NA
XX
X
X X
BBS2 BBS4 BBS6
X
Mutazione
X
X
X
X
………………
XX
NON AFFETTI
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Eredità triallelica pedigree
BBS6 wt/A242S
BSS2 wt/Y24X
BBS6 wt/A242S
BSS2 wt/wt
BBS6 wt/A242S
BSS2 Y24X/Y24X
AFFETTO
By NA
BBS6 wt/wt
BSS2 wt/Y24X
BBS6 wt/wt
BSS2 wt/Y24X
BBS6 wt/wt
BSS2 wt/wt
NON AFFETTO
BBS6 wt/147X
BSS2 wt/Q59X
BBS6 wt/147X
BBS6 wt/wt
BSS2 Y24X/Q59X BSS2 Y24X/Q59X
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MECCANISMO BI/TRIALLELICA
B
A
D
x
D
A B
A B
C
A
B
x B
legame meno
stabile
A
By NA
x B
B
x
assenza del
fenotipo
x
x
A
C
Funzione
Bx
comparsa del
fenotipo
A
D
D
A
x
B
C
D
x
Bx
A
C
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NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul
libro
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