Test genetico

LM Sc.Biosanitarie Ricerca Diagnostica 2013-14
Test genetico
Lezione 2
Capitolo 18 del testo
By NA
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Cos’e’ un test genetico/diagnostico
M Il test genetico di per se’ non e’ solo utilizzato in diagnostica: sono
un’insieme di tecniche che vengono utilizzate per studiare il DNA.
M la differenza e’ nelle domande che si pone chi le
utilizza: li posso usare per studiare la struttura di un
genoma e la sua evoluzione, per studiare il
funzionamento di una genoma e le diverse funzioni,
per mappare un gene,per identificare in fattori di
suscettibilita’. In qualunque organismo dal virus, alle
piante, agli animali uomo compreso
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Cos’e’ un test genetico/diagnostico
 ne deriva che viene utilizzato per la ricerca: le informazioni che si ricaveranno
potranno essere utilizzate per la diagnostica, servendosi delle stesse tecniche
M quindi cambiano le domande che l’operatore si pone
nel caso della ricerca:
ho un fenotipo alternativo presente nella mia popolazione(di qualunque organismo) a
quale dei locus si riferisce? dove mappa? come viene ereditato? quale e’ il gene e la
sua funzione? quale/i mutazione/i si esprimono in quel fenotipo?
By NA
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Cos’e’ un test genetico/diagnostico
Diagnostica in genetica umana: questo fenotipo e’ dovuto alle mutazioni del gene X,
questo paziente quale mutazione ha?
Diagnostica: applicazioni forensi: DNA non solo umano, ma anche di piante, animali,
microorganismi per rispondere alle domande sull’identita’, sulla paternita’, nella
protezione degli animali contro il traffico clandestino, per la conservazione di piante
e animali, per la diagnostica delle malattie.
DOMANDE DIVERSE STESSI TEST
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test diagnostico quando e come
M Il test diagnostico individua il genotipo di individui
a rischio per ben definite patologie.
M L’analisi viene fatta
indicazione precisa
solo quando c’e’ una
M La scelta del materiale dipende da quello che devo
vedere nel contesto della specifica diagnosi : DNA,
RNA, attivita’ enzimatica, biopsia... ricerca di una
mutazione gia’ identificata nella famiglia o
sconosciuta???
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Cosa analizzare
☛DNA: qualunque cellula provvista di nucleo va bene.Quindi facilmente
reperibile e facile da manipolare.
Pero’ il sequenziamento e’ lungo: coinvolge la struttura genomica e di
difficile interpretazione nelle mutazioni che originano errori di splicing
☛RNA: permette con RT-PCR un sequenziamento rapido degli esoni e
quindi evidenziare errori di splicing.
contrindicazioni: piu’ difficile da manipolare, mancata espressione del
gene in un tessuto facilmente accessibile, basso livello di trascritti
illegittimi, instabilita’ legata ai sistemi di sorveglianza...
☛Saggi funzionali: teoricamente permettono di esaminare il prodotto del
gene in esame,tuttavia richiedono a volte una sensibilita’ elevata e il
prodotto deve essere espresso in un tessuto accessibile
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Cosa analizzare
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Premesse
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Premesse
Le tecniche vanno scelte caso per caso in
relazione a quello che si sa della patologia in
studio, al caso che si sta studiando, alla
struttura della f amiglia in relazione al modello di
trasmissione della malattia, alla possibilita’ di
mosaicismo, al perche’ si f a la diagnosi
(conf erma diagnostica, ricerca degli eterozigoti,
diagnosi prenatale. . .. ). Per una particolare
f amiglia puo’ non bastare l’approccio standard e
bisogna cambiare strategia ricorrerendo a
tecniche aggiuntive.
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PREMESSE
La situazione di partenza e’ determinante ai fini della scelta
del test:
Cosa si sa della specifica malattia dal punto di vista

molecolare e genetico?
E’ la prima volta che la famiglia/il probando chiede il test?
E’ gia’ stata identificata la/le mutazione/i presente/i nella
famiglia e sto cercando i portatori o facendo una diagnosi
prenatale?
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Come, se e’ il primo approccio con una
probando e la sua famiglia
Primo problema: il gene coinvolto nel fenotipo presenta eterogeneita’ allelica
Perche’ e’ un problema?
By NA
Dovreste rispondervi da soli
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Come
Primo problema: eterogeneita’ allelica
Perche e’ un problema?
devo cercare la mutazione che provoca il fenotipo (gia’ attribuito ad un
locus),
ma questa potrebbe trovarsi in un punto qualunque del locus, anche al
difuori del gene molecolare.
il metodo migliore e’ il sequenziamento (cioe’ confrontare la sequenza in esame
con
una nota wild type) che oggi e’ piu’ rapido e meno costoso o usare i
microarray(costosi e quindi soprattutto quando ci sono un certo numero di
mutazioni frequenti), ma non crediate che l’interpretazione sia semplice!
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Come
Primo problema: eterogeneita’ allelica
☛nel passato venivano utilizzati per ovviare ai costi altri metodi, oggi
non piu’ utilizzati di routine, ma che possono essere utili
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Come
Secondo problema: la metilazione
Perche e’ un problema?
perche’ il sequenziamento non permette di vedere gli errori di metilazione
(PWS, Angelman..., tumori, X-fragile)
il metodo migliore e’ la digestione con enzimi di restrizione sensibili alla
metilazione
in alternativa modificazione con bisolfito piu’ complicato
standardizzazione
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nella
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E poi..
Problema: varianti non classificate
che vuol dire?
Vi ricordo che mutazione significa semplicemente variazione di una sequenza
confrontata
con una sequenza di riferimento. Da questo ne consegue che
mutazione non vuol dire che ci sia un effetto patologico. Vi ricordo la definizione
di polimorfismo:variazione presente nella popolazione con una frequenza
superiore a 1%. Per definizione un polimorfismo e’ innocuo, almeno finche’ non si
dimostra il contrario
Il tasso e il tipo di sostituzioni percio’ e’ estremamente variabile fra i diversi geni.
Alcune proteine come le ubiquitine hanno un livello di conservazione totale nella
scala zoologica dall’uomo al lievito. La loro sequenza a livello di DNA indica che le
sostituzioni ci sono, ma sono praticamente tutte sinonime.
All’estremo opposto ci sono geni pochissimo conservati se non in brevi domini
nell’evoluzione come SRY. SRY ha una funzione chiave in tuttii mammiferi, ma questa e’
demandata all’ HMG box, che corrisponde a 78 aa. I segmenti N- e C- terminali sono
estremamente variabili, indicando che per la funzione del gene questi segmenti non sono
critici
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NA
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e quindi?
☛ Mutazione mai descritta in letteratura, ma che potrebbe
essere patogenetica (il meccanismo di azione del prodotto e’
noto): e’ presente in altri soggetti sani della famiglia?
☛ Mutazione mai descritta in letteratura, con effetto ignoto sulla
funzionalita’: e’ presente in soggetti sani della famiglia?
☛ Mutazione mai descritta in letteratura, ma il cui effetto si
ritiene innocuo sulla funzionalita’: e’ presente in soggetti sani della
famiglia?
☛ Mutazione descritta in letteratura, il cui effetto e’ accertato
essere innocuo sulla funzionalita’ (come?)
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E quindi?
si e’ risposto SI a tutte le domande precedenti, quindi non
si e’ trovato niente di chiaramente patogenetico. Che vuol dire? che si fa??
☛ una mutazione che non e’ visibile perche’ si manifesta durante la
maturazione dell’RNA. Si possono usare i programmi per lo studio in
silico (attenzione non sono il verbo rivelato!)
☛ Studio in silico per vedere se si puo’ ipotizzare un effetto
patogenetico
☛ Confronto con altre specie
☛ una mutazione ad un altro locus, ETEROGENEITA’ DI LOCUS, il
prodotto del secondo ipotetico locus interagisce con il primo e quindi
il fenotipo e’ uguale
☛ Infine diagnosi clinica errata
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Come, se NON e’ il primo approccio
con una probando e la sua famiglia o
non c’e’ eterogeneita’ allelica
Perche’ accomuno queste due situazioni apparentemente diverse?
Perche’ dal punto di vista della scelta del test sono identiche
Se una malattia ha un numero limitato di alleli patogenetici
identificare quello/i presente/i nel probando e nella sua famiglia
e’ relativamente semplice (si fa per dire…)
Stesso discorso se la/e mutazione/i sono gia’ state identificate:
basta riutilizzare lo stesso test impiegato la prima volta
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Come, se NON e’ il primo approccio
con una probando e la sua famiglia o
non c’e’ eterogeneita’ allelica
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Esempi di malattie con un’eterogeneita’
allelica limitata
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metodi routinari per la ricerca di
mutazioni note
ricerca di un sito di restrizione perso per effetto della mutazione
non e’ un metodo molto in uso perche’ presenta parecchi limiti:
costo ,efficienza necessita’ di ricorre a primer ingegnerizzati…
ASO, ARMS, OLA si basano sulla reazione di oligonucleotidi o
primer costruiti ad hoc per sequenze specifiche,consentono
dell’utilizzo di multiplex.i microarray utilizzano la stessa logica
minisequenziamento mediante primer extension,
pirosequenziamento,
genotipizzazione mediante spettrometria di massa
genotipizzazione di massa di SNP con microarray
(per esempi e dettagli tecnici cfr. libro)
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Ancora tecniche alternative
nel caso di delezioni/duplicazioni non sempre la PCR e’ risolutiva,
non essendo quantitativa,l’array-CGH e’ utile per evidenziare
cambiamenti di numero di copie anche su larga scala, ma non e’
un metodo routinario per i suoi costi elevati.
come test diagnostico si utilizza la MLPA: variante della OLA
esistono in commercio kit appropriati e viene molto utilizzata
ricordate che stiamo parlando di mutazioni note)
In alternativa si puo’ usare la PCR real-time
esemplificativo e’ il caso della DMD in cui il 60% delle mutazioni sono
delezioni e identificare le portatrici e’ problematico
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Ancora tecniche alternative
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Ancora tecniche alternative
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Ancora
tecniche
alternative:
espansione di
triplette
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Ancora tecniche alternative:
espansione di triplette
Come emerso dalla precedente tabella alcuni alleli patogenetici
sono molto lunghi e la PCR, utile per evidenziare alleli normali e
le premutazioni o mutazioni complete non troppo espanse, o da
poliglutammina non permette una diagnosi certa.
Soprattutto nelle portatrici di sindromi X-linked.
Si ricorre allora al buon vecchio Southern blotting
Ricordate che se l’espansione provoca perdita di funzione, come
succede nell X-fragile, i probandi potrebbero avere mutazioni
puntiformi o delezioni che richiederanno altri approcci
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Ancora
tecniche
alternative:
espansione di
triplette
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Effetto del
fondatore
nella
diagnostica
tay-sachs
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Quando non si e’ trovato niente di noto
Quando si sono testate le mutazioni gia’ note e non si e’ arrivati
a definire la presenza della mutazione, prima di ricorrere al
sequenziamento vero e proprio di tutto il gene, si puo’ ricorrere a
tecniche per evidenziare differenze fra la sequenza normale e la
mutata, anche senza conoscerne la sequenza (SSCP, DDGE....)
Il principio su cui si basano e’ quello per cui una variazione anche di
una sola base modifica la conformazione del DNA in condizioni
sperimentali definite,o evidenziano grosse alterazioni della sequenza
(delezioni, duplicazioni...)
attenzione pero’ a variazioni polimorfiche
M Polimorfismo: variazione la cui frequenza sia maggiore di 0,01(1%)
MEterozigosi media per il DNA genomico umano:~ 0,0037 (0,37%). Cio’
significa che in due alleli circa 1:250-1:1000 basi sono diverse
Multima opzione : gene tracking
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NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul
libro
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