CELLULE STAMINALI APPLICAZIONI TERAPEUTICHE

CELLULE STAMINALI
APPLICAZIONI TERAPEUTICHE
(3 CFU)
Maurilio Sampaolesi
lesson 9
BIOTECNOLOGIE
Specialistica
Corso ANATOMIA UMANA II
(2011-2012)
SISTEMA NERVOSO CENTRALE
•encefalo
tronco encefalico, cervelletto,
diencefalo, due emisferi cerebrali
•midollo spinale
neuromeri segmenti
cranio-caudale
•sostanza grigia
neuroni, processi dendritici e neuritici, glia, vasi
•sostanza bianca
neuriti mielinizzati e non, glia, vasi
pseudobipolare
bipolare
multipolare
NEURONI:
Sensitivi
Motori (effettori)
Interneuroni
TESSUTO NERVOSO
OLIGODENDROCITA
ASTROCITI
NEURONE
by R.GALLI
SISTEMA NERVOSO CENTRALE
ARCHI RIFLESSI
arco riflesso
verticale
orizzontale
arco riflesso
monosinaptico
riflesso patellare
tendine rotuleo del quadr.:
1 recettore
2 via afferente
3 via efferente
4 organo effettore
SISTEMA NERVOSO CENTRALE
midollo spinale
neuromeri
2 nervi spinali
(radice ant. e post.)
emergono da
ogni neuromero
nel rigonfiamento
radicale albergano
i neuroni sensitivi
(gangli spinali)
Il corno posteriore è occupato in buona parte dal nucleo proprio, disposto
dorsalmente al midollo dorsale (di Clarke). Nel nucleo di Clark terminano
le fibre della sensibilità propriocettiva ed originano fibre dirette al
cervelletto. Proseguendo posteriormente, si trova la sostanza gelatinosa
(di Rolando) ricoperta a sua volta dalla sostanza spongiosa.
Nel corno anteriore i motoneuroni sono raggruppati in gruppi di nuclei
suddivisibli in: gruppo mediale, laterale e centrale.
Encefalo
è contenuto nella scatola cranica 1400 gr nel sesso
maschile e 1200-1300 gr in quello femminile; formato da una parte assile, il
tronco encefalico e da centri soprassiali, il cervelletto e gli emisferi
cerebrali
faccia inferiore dell’encefalo
IPOTALAMO
COTROLLO NEUROENDOCRINO
L’ipotalamo esercita un controllo sul sistema endocrino
Vasopressina o ADH ormone antidiuretico e Ossitocina
Funzioni:
-controllo vita vegetativa
-termoregolazione
-fame e sete
-comportamento sessuale
-regolazione sfera emotiva
-regolazione ritmo sonno-veglia
TELENCEFALO
emisferi cerebrali sono separati dalla scissura
interemisferica, situata sopra il corpo calloso
MENINGI avvolgono l’encefalo e il midollo spinale:
Dura madre (membrana spessa e fibrosa)
Aracnoide (organizzazione trabecolare in cui circola liquor)
Pia madre (membrana a contatto con il tessuto nervoso)
MENINGI SPINALI
MENINGI ENCEFALICHE
Schema della
circolazione del liquor
nelle cavità ventricolari e
nello spazio
subaracnoideo
MENINGI ENCEFALICHE
L’aracnoide contiene il liquor che si raccoglie in cisterne
subaracnoidee.
La pia madre riveste l’encefalo ed è responsabile per la
produzione del liquor o liquido cefalorachidiano
CELLULE STAMINALI NEURALI ADULTE
Compartimento
staminale adulto
Neuroni,
astrociti,
oligodendrociti
Maturazione
Astroblasti
Neuroblasti
Oligodendroblasti
Cellule staminali
del sistema nervoso centrale
adulto
Automantenimento
Progenitori bipotenti
Differenziamento
- rimozione di mitogeni (EGF, FGF2)
- esposizione a citochine (LIF, CNTF)
- espressione di geni (Emx2)
Cellule staminali
del sistema nervoso centrale adulto
Localizzazione
• Zona periventricolare (cellule ependimali, cellule gliali)
• Rostral migratory stream (RMS)
• Giro dentato dell’ ippocampo
Cellule staminali
del sistema nervoso centrale adulto
Isolamento
• Isolate per la prima volta nel 1992 (Reynolds and Weiss).
• In vitro identificate in risposta a fattori mitogeni specifici.
• In vivo identificate in seguito a somministrazione di analoghi di base.
Dissociazione del tessuto
(regione periventricolare
o ippocampo)
+ EGF&bFGF
Neurosfere primarie,
secondarie,
terziarie, n ...
Dissociazione
- EGF&bFGF
+ EGF&bFGF
Proliferazione
dopo esposizione a
fattori di
crescita per 24-36
ore
+ EGF&bFGF
Proliferazione
dopo esposizione a
fattori di
crescita per 3-5
giorni
Differenziamento
dopo rimozione di
fattori trofici
Differenziate
Cellule staminali
Progenitori
Enzymatic/
mechanical dissociation
SINGLE CELL SUSPENSION
ADULT FOREBRAIN
MITOGENS
Dissociation
PRIMARY
NEUROSPHERES
MITOGEN
REMOVAL
TERTIARY.. ..n..
NEUROSPHERES
SECONDARY
NEUROSPHERES
Neural stem cells from the adult SVZ
•First isolated in 1992 by Reynolds and Weiss
•Satisfy in vitro the criteria accepted to define a
stem cell
MATURE CELLS
CARDIOSFERE
OLIGODENDROCITA
ASTROCITI
NEURONE
Terapia cellulare di malattie neurodegenerative
tramite cellule staminali
Caratteristiche utili delle cellule staminali nervose:
• sorgente continua e rinnovabile di neuroni e glia.
• coltivabili per lunghi periodi senza perdita di
stabilità genetica.
• prone ad essere modificate tramite
ingegnerizzazione per la correzione di difetti
congeniti.
• disponibili in notevoli quantità.
Next steps (ongoing)
Source of cells
Human neural stem cells (hNSCs)
•Naive
•Manipulation prior to transplantation (oligodendroglial committment in
vitro)
Animal model
Chronic and multifocal CNS demyelination in non-human primates
Total Cell Number
Human foetal neural stem cells (hNSCs) display stable functional features
109
Genetic stability
Proliferation
and self-renewal
DE p20
CTX p20
108
107
Passage 13 through 18
Passage 25 through 30
0
10
20
30
40
50
Days In Vitro
Multipotency
% of Immunoreactive cells
neurons
astrocytes
(TUJ1)
(GFAP)
_____________________________
DE passage 18
13,66
58,41
passage 29
14,37
32,5
CTX passage 18
passage 30
13,5
17,6
TUJ1
GFAP
NG2
O4
41,2
51,7
1-3%
Human foetal NSCs can be genetically modified
U3
substitution
RSV
Dapi
TUJ1
GFP
U3
deletion
GA RRE
y
CMV eGFP
Dapi
GFAP
GFP
Dapi
GalC
GFP
Cell therapy approach for
Parkinson’s disease
hNSCs
•Integration,
survival,
differentiation of
transplanted cells
•Behavioral tests
Transplant of
hNSCs in the
striatum of 6OHDA-lesioned
rats
Dopaminergic induction
• epigenetic approach --> exposure to specific
molecules (GFs, cytokines) or unknown factors
secreted by different cells/cell lines.
•genetic approach --> expression of key genes in in
dopamine synthesis or genes active during embryonic
development (Nurr1/Not1).
A. Vescovi, R.Galli, L. DeFilippis-SCRI
CELLULE STAMINALI NEURALI UMANE COME
STRUMENTO PER LA TERAPIA SOSTITUTIVA
NELLE
MALATTIE
DI
PARKINSON
E
HUNTINGTON. Fondazione Cariplo. 2003-2004.
Cell-tracing
TH-GFP cells
G. Consalez-DIBIT
Naive hNSCs in a non-human primate model of CNS demyelination
“Human foetal NSCs vs syngenic Schwann cells in
marmosets with EAE”
Groups
•Neuroimmunology Unit, DiBiT-HSR
•SCRI, DiBiT-HSR
•Laboratoire des Affections de la Myeline et des
Canaux Ioniques Musculaires, Centre
Hospitalier Universitaire Pitie-Salpetriere,Paris,
FR
•Dept. Immunobiology, BPRC, Rijswijk, NL
Sponsors
•European Community (project no. HPRI-CT-200100150-PCDD-11)
•The Myelin Project
•Associazione Italiana Sclerosi Multipla
Gene-targeting of endogenous stem cells
2-In vivo analysis
1-LV-GFP injection
RE
(In collaboration with L. Naldini, TIGET-
GFP-expressing
cells in the SVZRE-OB pathway 2
and 6 months after
LV-GFP injection
OB
3-SVZ of LV-GFP injected mice ---> neural stem cell lines
Proliferation, self-renewal
7 days
Multipotency
GFP
GFAP
DAPI
GFP
TUJ1
DAPI
GFP
O4
DAPI
ESTIMATED N. OF CELLS X 1000
1E+06
1E+05
1E+04
1E+03
INJECTED SIZE (GFP+)
CONTROLATERAL
primary spheres
Tertiary spheres
1E+02
0
10
20
30
40
50
DAYS IN VITRO