CELLULE STAMINALI APPLICAZIONI TERAPEUTICHE (3 CFU) Maurilio Sampaolesi lesson 9 BIOTECNOLOGIE Specialistica Corso ANATOMIA UMANA II (2011-2012) SISTEMA NERVOSO CENTRALE •encefalo tronco encefalico, cervelletto, diencefalo, due emisferi cerebrali •midollo spinale neuromeri segmenti cranio-caudale •sostanza grigia neuroni, processi dendritici e neuritici, glia, vasi •sostanza bianca neuriti mielinizzati e non, glia, vasi pseudobipolare bipolare multipolare NEURONI: Sensitivi Motori (effettori) Interneuroni TESSUTO NERVOSO OLIGODENDROCITA ASTROCITI NEURONE by R.GALLI SISTEMA NERVOSO CENTRALE ARCHI RIFLESSI arco riflesso verticale orizzontale arco riflesso monosinaptico riflesso patellare tendine rotuleo del quadr.: 1 recettore 2 via afferente 3 via efferente 4 organo effettore SISTEMA NERVOSO CENTRALE midollo spinale neuromeri 2 nervi spinali (radice ant. e post.) emergono da ogni neuromero nel rigonfiamento radicale albergano i neuroni sensitivi (gangli spinali) Il corno posteriore è occupato in buona parte dal nucleo proprio, disposto dorsalmente al midollo dorsale (di Clarke). Nel nucleo di Clark terminano le fibre della sensibilità propriocettiva ed originano fibre dirette al cervelletto. Proseguendo posteriormente, si trova la sostanza gelatinosa (di Rolando) ricoperta a sua volta dalla sostanza spongiosa. Nel corno anteriore i motoneuroni sono raggruppati in gruppi di nuclei suddivisibli in: gruppo mediale, laterale e centrale. Encefalo è contenuto nella scatola cranica 1400 gr nel sesso maschile e 1200-1300 gr in quello femminile; formato da una parte assile, il tronco encefalico e da centri soprassiali, il cervelletto e gli emisferi cerebrali faccia inferiore dell’encefalo IPOTALAMO COTROLLO NEUROENDOCRINO L’ipotalamo esercita un controllo sul sistema endocrino Vasopressina o ADH ormone antidiuretico e Ossitocina Funzioni: -controllo vita vegetativa -termoregolazione -fame e sete -comportamento sessuale -regolazione sfera emotiva -regolazione ritmo sonno-veglia TELENCEFALO emisferi cerebrali sono separati dalla scissura interemisferica, situata sopra il corpo calloso MENINGI avvolgono l’encefalo e il midollo spinale: Dura madre (membrana spessa e fibrosa) Aracnoide (organizzazione trabecolare in cui circola liquor) Pia madre (membrana a contatto con il tessuto nervoso) MENINGI SPINALI MENINGI ENCEFALICHE Schema della circolazione del liquor nelle cavità ventricolari e nello spazio subaracnoideo MENINGI ENCEFALICHE L’aracnoide contiene il liquor che si raccoglie in cisterne subaracnoidee. La pia madre riveste l’encefalo ed è responsabile per la produzione del liquor o liquido cefalorachidiano CELLULE STAMINALI NEURALI ADULTE Compartimento staminale adulto Neuroni, astrociti, oligodendrociti Maturazione Astroblasti Neuroblasti Oligodendroblasti Cellule staminali del sistema nervoso centrale adulto Automantenimento Progenitori bipotenti Differenziamento - rimozione di mitogeni (EGF, FGF2) - esposizione a citochine (LIF, CNTF) - espressione di geni (Emx2) Cellule staminali del sistema nervoso centrale adulto Localizzazione • Zona periventricolare (cellule ependimali, cellule gliali) • Rostral migratory stream (RMS) • Giro dentato dell’ ippocampo Cellule staminali del sistema nervoso centrale adulto Isolamento • Isolate per la prima volta nel 1992 (Reynolds and Weiss). • In vitro identificate in risposta a fattori mitogeni specifici. • In vivo identificate in seguito a somministrazione di analoghi di base. Dissociazione del tessuto (regione periventricolare o ippocampo) + EGF&bFGF Neurosfere primarie, secondarie, terziarie, n ... Dissociazione - EGF&bFGF + EGF&bFGF Proliferazione dopo esposizione a fattori di crescita per 24-36 ore + EGF&bFGF Proliferazione dopo esposizione a fattori di crescita per 3-5 giorni Differenziamento dopo rimozione di fattori trofici Differenziate Cellule staminali Progenitori Enzymatic/ mechanical dissociation SINGLE CELL SUSPENSION ADULT FOREBRAIN MITOGENS Dissociation PRIMARY NEUROSPHERES MITOGEN REMOVAL TERTIARY.. ..n.. NEUROSPHERES SECONDARY NEUROSPHERES Neural stem cells from the adult SVZ •First isolated in 1992 by Reynolds and Weiss •Satisfy in vitro the criteria accepted to define a stem cell MATURE CELLS CARDIOSFERE OLIGODENDROCITA ASTROCITI NEURONE Terapia cellulare di malattie neurodegenerative tramite cellule staminali Caratteristiche utili delle cellule staminali nervose: • sorgente continua e rinnovabile di neuroni e glia. • coltivabili per lunghi periodi senza perdita di stabilità genetica. • prone ad essere modificate tramite ingegnerizzazione per la correzione di difetti congeniti. • disponibili in notevoli quantità. Next steps (ongoing) Source of cells Human neural stem cells (hNSCs) •Naive •Manipulation prior to transplantation (oligodendroglial committment in vitro) Animal model Chronic and multifocal CNS demyelination in non-human primates Total Cell Number Human foetal neural stem cells (hNSCs) display stable functional features 109 Genetic stability Proliferation and self-renewal DE p20 CTX p20 108 107 Passage 13 through 18 Passage 25 through 30 0 10 20 30 40 50 Days In Vitro Multipotency % of Immunoreactive cells neurons astrocytes (TUJ1) (GFAP) _____________________________ DE passage 18 13,66 58,41 passage 29 14,37 32,5 CTX passage 18 passage 30 13,5 17,6 TUJ1 GFAP NG2 O4 41,2 51,7 1-3% Human foetal NSCs can be genetically modified U3 substitution RSV Dapi TUJ1 GFP U3 deletion GA RRE y CMV eGFP Dapi GFAP GFP Dapi GalC GFP Cell therapy approach for Parkinson’s disease hNSCs •Integration, survival, differentiation of transplanted cells •Behavioral tests Transplant of hNSCs in the striatum of 6OHDA-lesioned rats Dopaminergic induction • epigenetic approach --> exposure to specific molecules (GFs, cytokines) or unknown factors secreted by different cells/cell lines. •genetic approach --> expression of key genes in in dopamine synthesis or genes active during embryonic development (Nurr1/Not1). A. Vescovi, R.Galli, L. DeFilippis-SCRI CELLULE STAMINALI NEURALI UMANE COME STRUMENTO PER LA TERAPIA SOSTITUTIVA NELLE MALATTIE DI PARKINSON E HUNTINGTON. Fondazione Cariplo. 2003-2004. Cell-tracing TH-GFP cells G. Consalez-DIBIT Naive hNSCs in a non-human primate model of CNS demyelination “Human foetal NSCs vs syngenic Schwann cells in marmosets with EAE” Groups •Neuroimmunology Unit, DiBiT-HSR •SCRI, DiBiT-HSR •Laboratoire des Affections de la Myeline et des Canaux Ioniques Musculaires, Centre Hospitalier Universitaire Pitie-Salpetriere,Paris, FR •Dept. Immunobiology, BPRC, Rijswijk, NL Sponsors •European Community (project no. HPRI-CT-200100150-PCDD-11) •The Myelin Project •Associazione Italiana Sclerosi Multipla Gene-targeting of endogenous stem cells 2-In vivo analysis 1-LV-GFP injection RE (In collaboration with L. Naldini, TIGET- GFP-expressing cells in the SVZRE-OB pathway 2 and 6 months after LV-GFP injection OB 3-SVZ of LV-GFP injected mice ---> neural stem cell lines Proliferation, self-renewal 7 days Multipotency GFP GFAP DAPI GFP TUJ1 DAPI GFP O4 DAPI ESTIMATED N. OF CELLS X 1000 1E+06 1E+05 1E+04 1E+03 INJECTED SIZE (GFP+) CONTROLATERAL primary spheres Tertiary spheres 1E+02 0 10 20 30 40 50 DAYS IN VITRO