Focus sulla Sclerosi Laterale Amiotrofica, Palazzo Reale Caserta, 11-12 maggio 2012 CELLULE STAMINALI e MALATTIE DEL MOTONEURONE Massimo Corbo Centro Clinico NEMO (NEuro Muscular Omnicentre) Centro Clinico ad alta specializzazione per lo studio e la cura delle distrofie muscolari e delle altre patologie neuromuscolari. Ospedale Niguarda Ca’ Granda – Milano • Stem cells in ALS 2006 Silani et al., Lancet, 2004 Amniotic cells Strategia complessa: – Scelta del donatore (autologo vs allogenico) – Scelta del tipo di SC (neurali vs non-neurali) – SC mantenute e amplificate in vitro (inalterate) – SC transdifferenziate (se non-neurali) o geneticamente modificate (rilascio di fattori trofici) – Associate a terapie specifiche – Sito e via di iniezione delle SC Replacement or Protection? • R è il fine ultimo per la maggior parte delle MND maggiori ostacoli: • la sopravvivenza delle cellule • l’ottenimento di unità motorie funzionalmente valide • l’ottenimento di proiezioni a lunga distanza connesse con i muscoli • P dei rimanenti MN in corso di degenerazione più realistica Cellule Staminali Embrionali (ES cells) hanno il più alto potenziale per la ricerca biomedica e clinica in grado di autorinnovarsi illimitatamente capacità di differenziarsi in tutti i tipi di cellule somatiche fonte illimitata di cellule e tessuti per malattie disabilitanti o degenerative • modelli animali di lesioni del midollo spinale (Keirstead et al, 2005; Sharp et al, 2010), retinopatie (Lamba et al, 2009) e malattia di Parkinson (Yang et al, 2008): → FDA ha approvato trial con hES cell progenitors per il trattamento dei Pz con lesioni midollari spinali e retinopatie congenite Cellule staminali embrionali ES cell-derived MNs • Grande potenziale proliferativo • Si differenziano esprimendo marker MN (ChAT) • Acquisiscono proprietà elettrofisiologiche dei MN maturi • Assoni si estendono alla periferia e formano giunzioni neuromuscolari (embrioni di pollo) • Dopo trapianto intraspinale formano unità motorie funzionali (ratto) • Miglioramento motorio del ratto SOD1G93A ↔ mancata sopravvivenza dell’innesto (istologia) Replacement • Effetti positivi sono attribuiti alla generazione di MNlike cells La strategia del R necessita da parte delle SC trapiantate: • la formazione di lunghi tratti di crescita assonale • la formazione di giunzioni neuromuscolari funzionalmente attive (solo 2 lavori l’hanno dimostrata) Punto critico: distanza (animali più grandi: primati) • presenza di altre cellule neuronali o non-neuronali (gliali) nel trapianto secernenti fattori di crescita o in grado di creare connessioni modulanti la funzione e la sopravvivenza dei MN residui ⇒ effetti collaterali Motor Neuron Protection rather than Replacement? Coinvolgimento extraneuronale: nuovi protagonisti • Negli ultimi anni si sono accumulate prove del coinvolgimento ‘attivo’ di cellule extraneuronali nei meccanismi che sono alla base del processo degenerativo della SLA. Nei topi chimerici che presentano cellule normali e cellule che esprimono la SOD1 mutante, è stato dimostrato che la tossicità per i motoneuroni richiede che la SOD1 mutante sia espressa anche nelle cellule non neuronali (glia). L’espressione della SOD1 mutante nei motoneuroni è essenziale per lo sviluppo della malattia, mentre la riduzione dell’espressione della SOD1 mutante nella microglia riduce nettamente la progressione della malattia in fase avanzata Impiego di cellule non-neurali per sostenere i MN morenti • Microglia: 10% della popolazione del cervello e del midollo spinale; di origine mieloide (SC di derivazione ematopoietica) • Wild-type bone marrow transplantation in topi modello della SLA familiare aumenta la sopravvivenza diminuzione della degenerazione di MN • SC mesenchimali: non ematopoietiche, multipotenti; - facili da isolare - possono essere trapiantate come autologhe - si indirizzano nelle zone di sofferenza cellulare - si differenziano sulla linea mesench.: osso, cartilagine, etc - anche verso cellule “astrocytic like” e “neuronal like” • Effetti protettivi: produzione di Fattori Trofici ↓ gliosi e infiammazione neuroprotezione Studi di trapianto cellulare nei modelli animali di MND Studi di trapianto cellulare nei modelli animali di MND Stem-cell therapy in humans: Italy Safety and Immunological Effects of Mesenchymal Stem Cell Transplantation in Patients With Multiple Sclerosis and Amyotrophic Lateral Sclerosis Dimitrios Karussis, MD, PhD; Clementine Karageorgiou, MD; Adi Vaknin-Dembinsky, MD, PhD; Basan Gowda-Kurkalli, PhD; John M. Gomori, MD; Ibrahim Kassis, MSc; Jeff W. M. Bulte, PhD; Panayiota Petrou, MD; Tamir Ben-Hur, MD, PhD; Oded Abramsky, MD, PhD; Shimon Slavin, MD Arch Neurol. 2010;67(10):1187-1194. doi:10.1001/archneurol.2010.248 ABSTRACT Objective To evaluate the feasibility, safety, and immunological effects of intrathecal and intravenous administration of autologous mesenchymal stem cells (MSCs) (also called mesenchymal stromal cells) in patients with multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Design A phase 1/2 open-safety clinical trial. Patients Fifteen patients with MS (mean [SD] Expanded Disability Status Scale [EDSS] score, 6.7 [1.0]) and 19 with ALS (mean [SD] Amyotrophic Lateral Sclerosis Functional Rating Scale [ALSFRS] score, 20.8 [8.0]) were enrolled. Intervention After culture, a mean (SD) of 63.2 x 106 (2.5 x 106) MSCs was injected intrathecally (n = 34) and intravenously (n = 14). In 9 cases, MSCs were magnetically labeled with the superparamagnetic iron oxide ferumoxides (Feridex). Main Outcome Measures The main outcome measure was the recording of side effects. Follow-up ( 25 months) included adverse events evaluation, neurological disability assessment by means of the EDSS, magnetic resonance imaging to exclude unexpected pathologies and track the labeled stem cells, and immunological tests to assess the short-term immunomodulatory effects of MSC transplantation. Clinical follow-up of patients with multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS) after transplantation of mesenchymal stem cells (MSCs) Karussis, D. et al. Arch Neurol 2010;67:1187-1194. Magnetic resonance imaging after injection of ferumoxides-labeled mesenchymal stem cells Karussis, D.restrictions et al. Arch Neurol 2010;67:1187-1194. Copyright may apply. A 3-T diffusion-weighted axial magnetic resonance imaging scan of the brain shows hyperintense signals in the occipital horns of the brain ventricles, indicating the presence of dependent transplanted cells that were not magnetically labeled Karussis, D. et al. Arch Neurol 2010;67:1187-1194. Copyright restrictions may apply. Immunological effects in patients with multiple sclerosis (MS) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS) injected intravenously and intrathecally with mesenchymal stem cells (MSCs) Karussis, D. et al. Arch Neurol 2010;67:1187-1194. Copyright restrictions may apply. Italian Ministery of Health Autologous Clinical Trial G-CSF, then mannitol G-CSF (Lenograstim) RAZIONALE: potenzialità di cellule staminali adulte midollari (passaggio BEE?) STUDIO: SSLA 40-65 anni, SLA definita, probabile, prob+lab, SLA < 12 mesi, ALS-FRS-R > 3 in 3 items, in Riluzolo 4 Pazienti per Centro (7) EP: sicurezza e tollerabilità ES: efficacia STUDIO attuato (Torino, Genova, Milano, Palermo, Pavia, Pisa, Roma) HSCT for ALS Blanco et al. 2005 J Clin Invest (2005) The hematopoietic factor G-CSF is a neuronal ligand that counteracts programmed cell death and drives neurogenesis. Schneider A, Kru¨ger C, Steigleder T, et al. G-CSF and G-CSFR are widely expressed in CNS neurons and their expression is induced by ischemia. G-CSF markedly improved long-term outcomes after cerebral ischemia in rats and G-CSF not only had antiapoptotic activity, but also stimulated neurogenesis. Impiego di cellule neurali per sostenere i MN morenti • Tessuto nervoso: fonte naturale di cellule per le MND • Le cellule staminali neurali (NSCs) sono state isolate sia dalla corteccia sia dal midollo spinale da feti umani postmortem • Le cellule derivate dalla corteccia fetale crescono in coltura in forma di aggregati, noti come “neurosfere” (hNPC) - hanno una sopravvivenza limitata - dopo diversi passaggi si differenziano in astrociti (e neuroni) - non formano teratomi: a differenza delle embrionali e dell’iPS • Se il neurone non è il primo fine, le hNPC sono più utilizzabili Studi di trapianto cellulare nei modelli animali di MND Cellule staminali embrionali Incompatibilità immunologica dovuta all’incremento di espressione delle molecole del MHC durante la differenzazione delle cellule embrionali (hES cells) Clonazione terapeutica: trasferimento del nucleo di una cellula somatica (SCNT) Fusione cellulare SCNT e Fusione Cellulare non risolvono completamente il problema della reazione immunologica del trapianto allogenico di progenitori derivati da cellule embrionali né il problema etico per la distruzione di embrioni e oociti. Equivalenti funzionali delle Cellule Staminali Embrionali Identificazione di pluripotency-inducing factors In 2006, Takahashi and Yamanaka: attraverso l’over-expression della combinazione di solo 4 fattori di trascrizione: octamer 3/4 (Oct4), SRY box–containing gene 2 (Sox2), Kruppel-like factor 4 (Klf4), c-Myc • sufficienti a riprogrammare dei fibroblasti murini verso uno stato simil-embrionico induced pluripotent stem (iPS cells) pochi mesi dopo, da fibroblasti umani hiPS cells nel 2007-2008, Yu et al e Park et al con una combinazione di geni lievemente diversa POU5F1 (OCT4), • Cellule somatiche umane riprogrammate SOX2, NANOG, LIN28A (LIN28) iPS cells Simili alle cellule staminali embrionali (hES cells) - per morfologia, proprietà di crescita ed espressione dei marker fenotipici - possibilità di differenziarsi in linee cellulari multiple con lo stesso livello di efficienza delle hES cells La riprogrammazione molecolare è un metodo elegante per generare cellule staminali pluripotenti, ma rimane un processo poco compreso e altamente inefficiente (cellule somatiche umane: 1/1000) Vantaggi potenziali delle iPS cells • Derivate dai fibroblasti o B linfociti (non necessitano embrioni o oociti) non comportano problemi etici e/o politici • Il metodo per generare iPS cells è relativamente semplice e eseguibile dalla maggior parte di laboratori che usano tecniche e strumentazione standard Banche di iPS cells sono ottenute da volontari sani di differenti età, origini etniche e sesso. utilità per gli studi di screening farmacologici per una miglior predizione delle tossicologie generate da Pz possono dare disease/mutation specific cell lines SLA, m. di Parkinson e SMA iPS cells nel trattamento della sickle cell disease Neuroni dopaminergici derivati dalle iPS cells funzionalmente integrati nel cervello di ratti adulti con malattia di Parkinson significativo miglioramento sintomatico (Yang et.al, 2008) Cellule endoteliali derivate dalle iPS cells funzionalmente normali iniettate in topi con emofilia A incremento significativo dei plasmatici livelli del fattore VIII e correzione della diatesi emorragica (Xu et.al, 2009) Cellule Staminali (SC): terapia per le Malattie Neurodegenerative 1) Definire la competitività della terapia con SC: rischio accettabile per il Pz malattie a vario grado di disabilità: PD, ALS terapie a differente efficacia sicurezza delle SC: proliferazione e differenzazione difficili da controllare i modelli animali non predicono: - la tossicità, - l’insorgenza di una risposta biologica (immunitaria), - il rischio di un tumore dopo l’impianto nel Pz. Cellule staminali (SC): terapia per le Malattie Neurodegenerative 2) Determinare quale cellula deve essere generata dalle SC: patologia della malattia terapia basata sul rimpiazzo cellulare: cellule differenti per differenti malattie PD neuroni dopaminergici (DA); ALS motoneuroni la patologia della malattia può colpire le cellule derivate dalle SC trapiantate: tessuto mesencefalico embrionale impiantato nei Pz con PD cloni terapeutici (ES cells con nucleo da cellule somatiche) o iPSc maggior suscettibilità al processo patologico. Cellule staminali (SC): terapia per le Malattie Neurodegenerative 3) Dimostrare nei modelli animali che l’uso delle SC da un miglioramento significativo dei deficit funzionali: prima dell’applicazione clinica il comportamento delle SC in vitro o nell’animale può esser diverso di quello nel Pz il modello animale non mima tutti gli aspetti della patologia umana mancata efficacia delle SC nei trial clinici 4) Determinare il meccanismo biologico responsabile degli effetti di un trattamento con SC nel modello animale: rimpiazzo cellulare ripristino (parziale) della circuiteria neuronale PD immunomodulazione, neuroprotezione per soppressione di meccanismi proinfiammatori NSCs verso le lesioni demielinizzanti Terapia con Cellule Staminali nella M. di Parkinson Terapie con Cellule Staminali nella Sclerosi Laterale Amiotrofica Massimo Corbo, Neurologist (clinical director) Fabrizio Rao, pulmonologist Christian Lunetta, neurologist Mario Melazzini scientific director Alberto Fontana president Nadia Cellotto, Physiatrist Ksenjia Gorni, child neurologist Elisabetta Roma pulmonologist Gabriella Rossi, psychologist Eleonora Maestri, data manager Donatella Pozzi, head nurse Physiotherapists Grazie per l’attenzione