Salvatore Iaconis - IGB-CNR
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Salvatore Iaconis Tecnica che permette di analizzare la presenza di carboidrati e proteine/peptidi in cellule mediante il legame di un anticorpo con specifici epitopi Analisi fenotipica di una popolazione cellulare Per rivelare il legame antigene-anticorpo esistono: Metodi diretti indiretti AbII AbI epitopo M Marcatore (Enzima, fluorocromo, etc) AbI epitopo Fluorocromo Composto policiclico aromatico con estesa coniugazione di doppi legami Fluoresceina FITC Texas red Loss of Energy 2 Excitation Emission 1 3 Emitted light Stato elettronico fondamentale Alexa fluor 594 λecc = 590 nm λem = 617 nm Emette nel rosso + fotostabile del texas red Alexa fluor 488 λecc = 494 nm λem = 517 nm Emette nel verde + fotostabile del FITC Differenziamento Cardio Differenziamento Neuro Pax6 Nes4na NFM GFAP (Glia) βΙΙΙTubulina Nanog SSEA-­‐1 Oct4 Bra Mesp1 αTroponina αAc4nina αMHC Oct4 DAPI Merge SSEA-1 α-tropomiosina /DAPI MHC/DAPI 20X 10X α-actinina/DAPI 40X GFAP/DAPI β3 Tubulina/DAPI β3 Tubulina/GFAP/DAPI • Fissazione (Para 4%, metanolo/acetone) • Permeabilizzazione (metanolo/acetone, Triton X-100, Tween-20) • Mascheramento siti aspecifici (BSA, NGS..) • Incubazione Ab primario • Incubazione Ab secondario coniugato con fluorocromo • Colorazione dei nuclei con DAPI Cellule indifferenziate OCT4 e SSEA-1 Differenziamento cardiaco 12gg Differenziamento neurale 12gg MHC (catena pesante della miosina) β-ΙΙΙ Tubulina e GFAP (Proteina Acida Fibrillare Gliale)
