Salvatore Iaconis
Tecnica che permette di analizzare la presenza di carboidrati e proteine/peptidi
in cellule mediante il legame di un anticorpo con specifici epitopi
Analisi fenotipica di una popolazione cellulare
Per rivelare il legame antigene-anticorpo esistono:
Metodi
diretti
indiretti
AbII
AbI
epitopo
M
Marcatore (Enzima, fluorocromo, etc)
AbI
epitopo
Fluorocromo
Composto policiclico aromatico con
estesa coniugazione di doppi legami
Fluoresceina
FITC
Texas red
Loss of Energy
2
Excitation
Emission
1
3
Emitted light
Stato elettronico fondamentale
Alexa fluor 594
λecc = 590 nm
λem = 617 nm
Emette nel rosso
+ fotostabile del texas red
Alexa fluor 488
λecc = 494 nm
λem = 517 nm
Emette nel verde
+ fotostabile del FITC
Differenziamento Cardio
Differenziamento Neuro
Pax6 Nes4na NFM GFAP (Glia) βΙΙΙTubulina
Nanog SSEA-­‐1 Oct4 Bra Mesp1 αTroponina αAc4nina αMHC Oct4
DAPI
Merge
SSEA-1
α-tropomiosina /DAPI
MHC/DAPI
20X
10X
α-actinina/DAPI
40X
GFAP/DAPI
β3 Tubulina/DAPI
β3 Tubulina/GFAP/DAPI
• Fissazione (Para 4%, metanolo/acetone)
• Permeabilizzazione (metanolo/acetone, Triton X-100, Tween-20)
• Mascheramento siti aspecifici (BSA, NGS..)
• Incubazione Ab primario
• Incubazione Ab secondario coniugato con fluorocromo
• Colorazione dei nuclei con DAPI
Cellule indifferenziate
OCT4 e SSEA-1
Differenziamento cardiaco 12gg
Differenziamento neurale 12gg
MHC (catena pesante della miosina)
β-ΙΙΙ Tubulina
e
GFAP (Proteina Acida Fibrillare Gliale)
