APOPTOSI
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ATTIVITA’ CELLULARE Segnale Attivazione di specifici pacchetti di geni Esecuzione di uno dei programmi di attività cellulare Proliferazione Differenziamento Arresto e Quiescenza Morte cellulare Nabissi2016 Nabissi2016 MORTE CELLULARE Nabissi2016 MECCANISMIDIMORTECELLULARE • • NECROSI – Eventoaccidentale – Passivamentesubitodallecellule – Interessagruppidicellule – Dovutoatrauma,veleno,anossia,ecc – Lalisidellacellulacausafenomenidiinfiammazioneediautoimmunità APOPTOSI – Eventoprogrammato – A8vamenterealizzatodallecellule – Interessacellulesingole – Realizzatodinormaincondizionifisiologiche – Laframmentazionedellacellulaelemodificazionidisuperficiefavorisconolafagocitosi AUTOFAGIA -PermeFeallecelluleincondizionedimalnutrimentooprivedifaForidicrescitadi sopravvivere.SelamancanzadisImolipersistelecellulesi“autodigeriscono”e muoiono. Nabissi2016 LA NECROSI La necrosi, è l’ evidenza strutturale della morte di gruppi di cellule di un tessuto o di un organo. Nella zona di avvenuta necrosi le delimitazioni extracellulari scompaiono ed il tessuto si trasforma in una massa amorfa, con conseguente rilascio di sostante intracellulari negli spazi extracellulari. Questo fenomeno comporta, spesso, attivazione di un processo infiammatorio in quanto le sostanze rilasciate dalla cellula necrotica possono richiamare (chemiotassi) i leucociti o attivare una risposta antigenica Nabissi2016 Necrosi LemodificazioniultrastruFuralidellacellula,incuisièaKvatoilprocessodi mortepernecrosi,possonoesseresuddivisecomesegue: -Cariolisi(degradazionedelDNAcausatadall’aKvitàdelleDNasi) -Picnosi:(riduzionedelnucleo) -Cariolessi:(frammentazionedelnucleopicnoIco,finoallasuascomparsa) - Alterazioni della membrana plasmaIca, deplezione di ATP e della struFura dei mitocondri, dilatazione del reIcolo endoplasmaIco (per aumento del Ca2+ intracellulare,perditadell’osmolaritàcellulare Nabissi2016 Nabissi2016 CARATTERISTICHE NECROSI VOLUME CELLULARE AUMENTO NUCLEO PICNOSI-CARIOLESSI-CARIOLISI MEMBRANA CITOPLASMATICA DANNEGGIATA CONTENUTO CELLULARE DIGESTIONE ENZIMATICA INFIAMMAZIONE DELLE AREE ADIACENTI FREQUENTE RUOLO FISIOLOGICO O PATOLOGICO SEMPRE PATOLOGICO Nabissi2016 Inoltre la cellula necrotica puo’ avere un aspetto piu’ trasparente rispetto alla cellula normale (perdita del contenuto di glicogeno). Un altro fenomeno presente nel processo necrotico consiste nella calcificazione delle cellule, con riempimento della cellula morta con fosfolipidi degradati (dette figure mieliniche), che vengono poi degradate dai macrofagi, con formazione di saponi di calcio ed di un sito infiammatorio. Nabissi2016 STEATONECROSI CON SAPONIFICAZIONE. Saponi di calcio nelle zone di distruzione lipidica Figure mieliniche Nabissi2016 La necrosi del tessuto puo’ essere classificata come: Necrosi coagulativa: denaturazione completa della cellula, tessuto duro e biancastro in cui le proteine possono andare incontro ad un processo di denaturazione. La necrosi coagulativa implica la conservazione della struttura della cellula per alcuni giorni, come nel caso dell’infarto del miocardio dove il danno o l’aumento di acidosi cellulare denatura le proteine ma anche gli enzimi degradativi . Un tipo particolare di necrosi coagulativa è la necrosi caseosa, che si incontra spesso nel granuloma tubercolare. Deve il suo nome all’aspetto macroscopico del tessuto (bianco e simile al formaggio). Si distingue dalla normale necrosi coagulativa perché in essa la normale architettura del tessuto appare completamente scomparsa. Nabissi2016 POLMONE TUBERCOLARE- NECROSI CASEOSA Nabissi2016 • LanecrosicoagulaIvaimplicalaconservazionedellastruFura dellacellulaperalcunigiorni,comenelcasodell’infartodel miocardiodoveildannool’aumentodiacidosicellulare denaturaleproteinemaancheglienzimidegradaIvi A) Miocardio normale, B) cellule del miocardio prive di nucleo Nabissi2016 Necrosi colliquativa: predomina la digestione enzimatica, il tessuto diventa molle e liquefatto principalmente come conseguenza dell’azione degli enzimi litici rilasciati dai leucociti, richiamati nel sito necrotico (chemiotassi). La necrosi colliquativa è caratteristica delle infezioni batteriche, dato che questi organismi stimolano l’accumulo di cellule infiammatorie. La completa digestione delle cellule morte, con conseguente trasformazione del tessuto in una massa fluida e viscosa, comprende spesso la formazione di pus. Nabissi2016 NecrosicolliquaBva CaraFerisIcadelleinfezionibaFeriche,datochequesIorganismisImolano l’accumulodicelluleinfiammatorie. CompletadigesIonedellecellulemorte,conconseguentetrasformazionedel tessutoinunamassafluidaeviscosa.Spessoconprendelaformazionedipus. Nabissi2016 Un altro tipo particolare di necrosi è la gangrena che si verifica in un arto con interruzione completa dell’irrorazione sanguigna e conseguente necrosi coagulativa. Se si sovrappone un’infezione batterica con conseguente colliquazione si definisce gangrena umida. Necrosi grassa (steatonecrosi): indica la presenza di zone di distruzione lipidica causate dal rilascio di lipasi Nabissi2016 Mediatoridelprocessodinecrosi SpeciereaKvedell’ossigeno,ionicalcio,PARP(poly–ADP–ribosepolymerase) PARP è una DNA-repair enzyme che puo’ diminuire fortemente le riserve di ATP quandocatalizzalariparazionedelDNA,cheavvieneduranteundanno. Nabissi2016 Proteasi calcio-aKvate non lisosomiali (Calpaine) e catepsine mediano il processo di necrosi. CalpainesiaKvanoquandolaconcentrazionedicalcioèelevata. Le Catepsine vengono liberate nel citoplasma dopo che le calpaine aKvate compromento l’integritàdellemembranelisosomiali. Ilisosomicontengonopiu’di80IpidiversidienzimiidroliIci,inclusolecatepsine.RilasciaI nel citoplasma quesI enzimi degradano le struFure cellulari, interferendo con il normale metabolismo,elamorteèinevitabile. Nabissi2016 Nabissi2016 DETERMINAZIONEDELPROCESSONECROTICO MarcaturaconPI(iodurodipropidio) AnalisieleFroforeIcadelDNA AKvazioneenzimidegradaIvi medianteWesternBlotanalisi Nabissi2016 LANECROSIINDUCE INFIAMMAZIONE LANECROSIPUO’ INDURREFENOMENIDI AUTOIMMUNITA’ DAMP’S:damage-associated molecularpaFerns APOPTOSI:“suicidiocellulare” Èunamodalitàdimortecellulare“aKva”,Ipicadellecelluledi organismipluricellularievieneanchedescriFacomeunaforma di“suicidioaltruista”,inquantospessolacellula“sisacrifica” perilbenedell’interoorganismo.Lemodalitàdellamorteper apoptosisonofinalizzateaevitarel’instaurarsidifenomenidi INFIAMMAZIONEediAUTOIMMUNITÀ,edilfaFochenon dialuogoafenomenidiinfiammazionefasìchelamorte cellularenonsiaavverItadall’organismo(morteindolore) Nabissi2016 PERCHÉ SI PARLA DI PROGRAMMA APOPTOTICO? Perché l’apoptosi è un processo cellulare innescato da induttori specifici, in quanto richiede la trascrizione di specifici geni. L’apoptosi fisiologica avviene naturalmente nell’organismo, per favorire l’eliminazione di cellule che hanno terminato la loro funzione, in cellule danneggiate o in condizioni d’adattamento cellulare Nabissi2016 SVILUPPO EMBRIONALE/FETALE E METAMORFOSI NORMALE TURN-OVER TISSUTALE: epitelio intestinale, i neutrofili dopo il termine dell’infiammazione, linfociti al termine di una risposta immunitaria. ONTOGENESI E OMEOSTASI DEL SISTEMA IMMUNITARIO: L’eliminazione di linfociti auto-reattivi potenzialmente pericolosi, prima e dopo la loro formazione e maturazione. ATROFIA ORMONE-DIPENDENTE: L’involuzione ormone-dipendente nell’adulto, come la distruzione delle cellule dell’endometrio durante il ciclo mestruale, atresia dei follicoli ovarici nella menopausa, regressione della mammella dopo svezzamento, atrofia prostatica dopo castrazione. DEPRIVAZIONE DI FATTORI DI CRESCITA o INDUCENTI: L’eliminazione cellulare in popolazioni cellulari proliferanti. Nabissi2016 APOPTOSI TOSSINE,FARMACI RADIAZIONI INFEZIONIVIRALI CITOTOSSICITÀCELLULO-MEDIATA:lamortecellulareindoFadailinfociI citotossici,unmeccanismididifesacontrolinfociIinfeFaIdavirusocontrocellule tumorali. Perapoptosipatologicas’intendelamortecellulareindoFadaunaseriedisImoli dannosi,adesempioildannocellulareinparIcolarimalaKevirali,comel’epaIte viraleincuil’eliminazionedellecelluleèlargamentedipendentedall’apoptosi, l’atrofiapatologicanegliorganiparenchimalidopoostruzionedeidoK(pancreas, reni)elamortecellularenelleneoplasie. Nabissi2016 Quindi l’apoptosi si puo’definire un programma intracellulare strettamente regolato, in cui le cellule destinate a morire attivano enzimi che degradano il DNA, le proteine nucleari e citoplasmatiche. La membrana citoplasmatica rimane intatta ma la struttura della cellula si altera a tal punto da essere bersaglio di cellule fagocitarie . Nabissi2016 Nabissi2016 Immaginidicelluleinapoptosi Nabissi2016 CARATTERISTICHE NECROSI APOPTOSI VOLUME CELLULARE AUMENTO RIDOTTO NUCLEO PICNOSI-CARIOLESSICARIOLISI FRAMMENTAZIONE MEMBRANA CITOPLASMATICA DANNEGGIATA INTATTA CONTENUTO CELLULARE DIGESTIONE ENZIMATICA INTATTO, PUO’ ESSERE SECRETO IN CORPI APOPTOTICI INFIAMMAZIONE DELLE AREE ADIACENTI FREQUENTE NO RUOLO FISIOLOGICO O PATOLOGICO SEMPRE PATOLOGICO SPESSO FISIOLOGICO, MEZZO PER ELIMINARE LE CELLULE Nabissi2016 CARATTERISTICHEBIOCHIMICHEDELL’APOPTOSI LecelluleapoptoIchemostranodellecaraFerisIchebiochimichechesonoalla basedellemodificazionistruFutalidescriFe. CLIVAGGIODELLEPROTEINE LadegradazionedelleproteinecoinvolgeleCASPASI,proteasicisteina-dipendenI, chesonopresenI,comeproenzimi,nellacellulaincondizionefisiologicaedevono essereaKvaIperindurreapoptosi.Lecaspasioltrechedistruggerealtreproteine aKvanoDnasichedegradanoilDNA. AUMENTODELLACONCENTRAZIONEDICa2+INTRACELLLULARE LemodificazionibiochimichedellamembranaplasmaIcainduconovariazioni osmoIcheeddellaconcentrazioneeleFroliIcanellacellulaapoptoIca.Tali variazioniinduconoentratadiCa2+dall’ambienteextracellulareerilasciodiCa2+ daideposiIintracellulari(reIcoloendoplasmaIcoliscio,mitocondri).L’aumento diCa2+èallabasedell’aKvazionedidiversienzimiconaKvitàdegradaIviverso proteineeDNA. Nabissi2016 MECCANISMIdia8vazionedell’APOPTOSI L’APOPTOSIE’INDOTTADASTIMOLIESTERNIE/OINTERNI,INGRADODI ATTIVAREDUEVIE(PATHWAYS)INPARTEDISTINTECHEVENGONOIDENTIFICATI COME: PATHWAYINTRINSECO,controllatodallapermeabilizzazionedellamembrana mitocondriale PATHWAYESTRINSECO,nelqualereceForidimortesImolanolacascata dievenIapoptoIci. ImediatoridientrambiipathwayssonoLECASPASI,infaKilprocesso apoptoIcoconsisteinunafaseiniziatrice(durantelaqualevengonoaKvate lecaspasiiniziatrici)einunafaseeffeFriceincuiilsecondogruppodicaspasi (effeFrici)agisconoperindurrelamortecellulare. Nabissi2016 CASPASI • C=cisteinanelcentroreaKvo;ASP=riconosconounresiduodiacidoasparIco nell’ambitodiunasequenzadi4aminoacidi;ASI=sonoenzimiproteoliIci • LecaspasisonopresenInelcitoplasmainformadizimogenievengonoaKvate successivamenteall’aKvazionedeipathwaysapoptoIci. • Lecaspasi“iniziatrici”(2,8,9,10)sonoaKvatedagli“adaFatori”;alorovolta aKvanolecaspasi“effeFrici”(3,6,7).(Lacaspasi1,4,5sonocoinvoltenella maturazionedicitochine). • L’aKvazioneconsisteneltaglioproteoliIco,conformazionedidueframmenI;i2 frammenIbreviei2frammenIlunghididuecaspasiugualiformanountetramero (formaaKva). Nabissi2016 Nabissi2016 ROTTURADELDNA IlDNAvienetagliatoinmulIplidi180-200bpdaendonucleasiMg2+eCa2+dipendenI RICOGNIZIONEFAGOCITARIA LecelluleapoptoIcheesprimonofosfaAdilserinasullaparteesternadellamembrana (evidenziabilecolorandolecelluleconannexinaV). Questemodificazionialivellodimembranapossonoesserericonosciutedaimacrofagiche fagocitanocosìlecelluleapoptoIche. A-DNAcelluleintegre B-DNAdicelluleinapoptosi C-DNAdicelluleinnecrosi Nabissi2016 Apoptosis and Necrosis analysis Annexin + PI Facs Analysis Nabissi2016 APOPTOSI ESTRINSECA Nabissi2016 ViaApoptoIcaEstrinseca LaviaestrinsecaopathwaydeireceForidimorteèaKvatadallafamigliadei receSoridelTNF(tumornecrosisfactor),laqualeècompostadareceForiche inoltrehannounruolofondamentalenelmantenerel’omeostasicellulareenel riconoscimentoimmunitario.L’aKvazionediquestaviasihaquandounligandodi mortesilegaaldominioextracellularedelsuoreceForeconconseguente aKvazionedellecaspasiiniziatrici. LafamigliaditalireceForiècompostadadiversimembri,iqualisono differentementeespressinellevariepopolazionicellulari.QuesIreceForisono: -TNFR1(receForedelTNF) -CD95(denominatoancheApo1oFas) -TRAIL-R1,-TRAIL-R2,NGFR Nabissi2016 Nabissi2016 TNF;tumornecrosisfactoroFasL;ligandodelreceFore Fas)siassociaallaporzioneextracellularedelreceFore,il IlreceForetrimerizzaelaPorzioneintracellulare, caraFerizzatadaundominioDD(DeathDomain),dirige laformazionediuncomplessoProteicodenominatoDISC (death-inducingsignalingcomplex)medianteil reclutamentodiunaspecificaproteinaadaFatriciFADD (Fas-associateddeathdomain,perilFas)oTRADD(TNFR- associateddeathdomain)perilTNFR.Questaproteina trasportaundominioDED(deatheffectordomain)che permeFedireclutarelepro-caspasi8el’aKvano (induzioneperprossimità).Lacaspasi-8aKvataagisce aKvandolapro-caspasi3cheagiscesuisubstraIsensibili. Nabissi2016 InalcuniIpicellularilecaspasi8nonsonoparIcolarmenteefficacinelclivaggiodellacaspasi3e quindiagisconosullaproteinaBIDchetroncatadallacaspasi8,informacorta(t-BID)traslocanella membranamitocondrialedovesilegaedaKvaBAXeBAD.QuestaaKvazionepermeFela traslocazionediBAXnellostratoesternodellamembranamitocondriale,causando l’oligomerizzazionediBAXeBADconconseguenterilasciodicitocromocedinibizionedelleIAP (inhibitorofapoptosispathways)stabilendounlegamefraviaestrinsecaeviaintrinseca. Nabissi2016 INIBITORIDELL’APOPTOSI(cFLIP) Un’altraproteinacheregola negaIvamentel’apoptosi interferendoconl’aKvazionedelle caspasièlaproteinaFLICE(cFLIPo usurpina),checonIeneundominio DEDmancantedel sitocataliIcoaKvoedeiresidui aminoacidicicheformanoilpaccheFo diproteine necessarie(DISC)peraKvarelaprocaspasi8. Nabissi2016 L’INIBIZIONE DEL SEGNALE APOPTOTICO PUO’ INDURRE PROLIFERAZIONE CELLULARE Nabissi2016 APOPTOSI INDOTTA DAI LINFOCITI CITOTOSSICI Nabissi2016 SUBSTRATIDELLECASPASIEFFETTRICI Nabissi2016 Substrati sensibili CAD (deossiribonucleasi caspasi-sensibile): presente nel citosol in forma inattiva e mediante distacco dell’inibitore causato dalla caspasi 3, la CAD migra nel nucleo degradando i nucleosomi, frammentando il DNA in frammenti di circa 180 bp. Nabissi2016 PARP-1 (poli-ADP-ribosio polimerasi) che inaKvata dalla caspasi 3 , non puo’ piu’ svolgerelafunzionedienzimaresponsabiledellariparazionedelDNAed’inibitoredelle endonucleasi. Nabissi2016 Casp-3edegradazionedelleproteinedelcitoscheletro Nabissi2016 VIA INTRINSECA La via intrinseca è attivata da stress cellulari (deprivazione di fattori di crescita, ipossia, danno al DNA) o agenti antitumorali. Nelle cellule normali, il danno al DNA puo’ indurre due possibili reazioni; la riparazione e/o la tolleranza del danno, oppure la stimolazione della cascata di segnali che inducono la morte della cellula danneggiata. Nella trasformazione neoplastica queste reazioni sono normalmente alterate. Le principali lesioni letali al DNA sono le rotture del doppio filamento (double strand breaks; DSB), le quali sono riconosciute da proteine (chinasi) con capacità di riparazione. Una di queste proteine è ATM (ataxia telangiectasia mutated) attivata dopo lesione del DNA indotta da radiazioni ionizzanti. ATM induce la fosforilazione di diversi substrati coinvolti con il blocco del ciclo cellulare e nell’induzione dell’apoptosi (p53, CHK1, CHK2, p21). In base al danno o alla capacità di riparazione p53 puo’ indurre la trascrizione di geni pro-apoptotici (Bax, PUMA) Nabissi2016 Nabissi2016 Laviamitocondriale L’aKvazionedellaviamitocondrialesiaKvamedianteuna permeabilizzazionedellamembranamitocondrialeinternacon conseguentedissipazionedelgradientediprotonicheè responsabiledelpotenzialetransmembranamitocondriale.La permeabilizzazionecoinvolgeanchelamembranamitocondriale esternaconconseguenteperditadiproteinesolubili,normalmente confinateneglispaziointermembranalideimitocondri. QUALEMECCANISMOINDUCELAPERMEABILIZZAZIONE? Nabissi2016 Laformazionediporiditransizionedimembranaalivellomitocondrialecoinvolge proteinepro-apoptoIchedellafamigliaBcl-2(es.Bax,tBid) Lapermeabilizzazionedellamembranainternaavvienecomeconseguenzadella formazionediporinonspecifici(indoKdasImoliapoptoIci). Canalianionicivoltaggio-dipendenI(VCAD),chesonoleproteinemaggiormente presenInellamembranamitocondrialeesterna.IncondizionenormalequesI canalisonopermeabiliaproteineconunpesomolecolarefinoa5kD. La formazione dei pori di transizione di membrana nasce dalla fusione dei VCAD con i poriaspecifici(modello2),soFoilcontrollodelleproteinedellafamigliaBcl-2. QUALUNQUE SIA IL MODELLO, LA PERMEABILIZZAZIONE DELLE MEMBRANE MITOCONDRIALI INDUCONO LA FUORIUSCITA DEL CITOCROMO C NEL CITOPLASMA. Nabissi2016 intermembranespace(IMS) proteinsthatdirectlybind XIAPandantagonizeitsability toinhibitcaspases Nabissi2016 Viaintrinseca LosImolocheinducelaviaintrinsecainducelapermeabilizzazione dellamembranamitocondrialeesternaerilasciodelcitocromoc chesilegaalfaForeApaf-1(apoptoIcprotese-acIvaIngfactor-1) inducendooligomerizzazioneecambiandonelasuaconformazione. Questocambiamentocomportal’esposizionedelDOMINIODI RECLUTAMENTODELLECASPASI(ARD),inpresenzadiATP. Apaf-1,ècosi’ingradodireclutareedaKvarelapro-caspasi9 formandouncomplessochiamatoAPOPTOSOMA,ilqualeaKvala pro-caspasi9,cheasuavoltaaKvalecaspasieffeFrici(3,6,7)con conseguenteiniziodeifenomeniapoptoIci(frammentazionedel DNA,disgregazionedelcitoscheletro,ecc..). Nabissi2016 Nabissi2016 MODULATORIDELL’APOPTOSI • Localizzandosi sulla membrana esterna del mitocondrio, favoriscono (se proapoptoIci)orendonomenofacile(seanI-apoptoIci)laformazionedimegacanali elaconseguentefuoriuscitadimolecolepro-apoptoIche • SonostruFuralmentesimilitraloro(dominiBH1-4+dominiotransmembrana) • AnI-apoptoIci:Bcl-2,BclXL, • Pro-apotoIci:Bad,Bax,Bak,Bid • SImoliendogeniedesogeniagisconosullapropensioneall’apoptosidellacellula alterandolaloroquanItà,localizzazioneestatodiaKvità Nabissi2016 LafamigliaBcl-2 • Il gene Bcl-2 (B-cell leukemia/lymphoma 2) fu idenIficato nelle cellule B del linfoma follicolare e la sua over-espressione antagonizza l’induzione dell’apoptosi mediata da diversi sImoli, compresi quelli da chemioterapici. La suaover-espressioneindiversiIpiditumorecontribuisceallacrescitacellulare ed in combinazione con l’over-espressione di altri oncogeni (c-myc), alla trasformazioneneoplasIca. • Diversi membri della famiglia Bcl-2 sono staI idenIficaI e caraFerizzaI per la lorofunzionepro-apoptoIcaequindipotenzialioncosoppressori(Bax,Bak,Bim, Bid….),ofunzioneanI-apoptoIcaequindipotenzialioncogeni(Bcl-2,Bcl-XL,..). • Inoltreilgenomadialcuniviruspatogeni(Epstein-Barr,sarcomadiKaposivirus) codificanoperproteinesimiliaBcl-2. Nabissi2016 LeproteineanI-apoptoIcheBcl-2contengonoquaFrodominiconservaI BH(1-4),omologhiaBcl-2,mentreimembripro-apoptoIcipossonoessere suddivisiinquellicontredominiomologhi(Bax,Bak)oconsoloildominioBH3 conservato(Bid,Bim,Bad). InoltremolIdiquesImembricontengonoregionicarbossi-terminalichehanno affinitàperlemembrane,inparIcolarequellaesternadeimitocondri. Inassenzadisegnalidimorte,molImembripro-apoptoIcisonolocalizzaInel citosolonelcitoscheletroesolodoposegnalidimorteassumonouna modificazioneconformazionalechelirendecapacidimigrareversolemembrane mitocondriali. LeinterazioniframembriproedanI-apoptoIcimodulalaredistribuzionedel citocromocnelmitocondrio. Nabissi2016 a) Leproteinepro-apoptoIchepossonoesseresuddiviseineffeSori(causanodepolarizzazione)osolo BH3(sensibilizzatori,trasmeFonoilsegnaleapoptoIcoaglieffeFori). b) Modello indireSo: BAX e BAD sono legaI ed inibiI da Bcl-2 quando sono nello stato cosItuIvamente aKvo e il legame di BH3 a Bcl-2 è sufficiente per liberare Bad/BAX. Modello direSo: Bad/Bax sono aKvaI da BH3 e Bcl-2 previene la depolarizzazione della membrana mitocondrialesequestrandoBH3oinibendoBad/BaxaKvaI. Nabissi2016 Nabissi2016 VIA INTRINSECA Fattori stimolanti l’apoptosi Le altre proteine pro-apoptotiche, (come BID), cooperano con BAX e BAD nell’indurre il rilascio di citocromo c. Inoltre il dimeri Bax-Bid induce il rilascio di AIF (Apoptosis Inducing Factor) e Smac/DIABLO che blocca i fattori IAP (proteine inibitrici l’apoptosi). AIF collabora nell’indurre il rilascio di citocromo c, ma ha anche la capacità di traslocare nel nucleo ed indurre la condensazione della cromatina e l’apoptosi mediante una via caspasi indipendente (attivazione di endonucleasi). Nabissi2016 Inibitoridell’apoptosi (IAPfamily) LeproteineIAP(InhibitorofApoptosisProtein)sonoproteinealtamente conservateesonocaraFerizzatedaalmenoundominioBIR(baculovirus inhibitorofapoptosisrepeat). QuestodominioèpresenteindiverseproteinefracuicIAP1,cIAP2,XIAPe Survivina. LamaggiorpartedelleproteineIAPsonaltamenteespresseneitessuI embrionaliequasiassenInellecelluledifferenziate,mentrelaloroespressione aumentanellecelluletumorali. LeIAPsileganoerendonoinaKvelecaspasi,mapossonosvolgereunruolo inibitoriodelprocessoapoptoIcoanchelegandosialleproteinepro-apoptoIche Smac/DIABLO(proteinechepromuovonol’aKvazionedellecaspasi,riducendo l’inibizionedellecaspasiIAP-mediata). Nabissi2016 Nabissi2016 Il citocromo c si lega ad APAF-1 monomero e ne induce la eptamerizzazione, formando l’apoptosoma.LivellifisiologicidiATPotRNAbloccanoillegamedelcitocromocadAPAF-1 CitocromocrichiedeunamolecoladiFe,fornitadallaspaziointermembranale,perpotersi legareadAPAF-1. La fosforilazione della caspasi-9 da parte delle chinasi cicline dipendenN (CDK)-B [ciclo cellulare] e ERK 1/2 [proliferazione], inibiscono la caspasi 9, mediante un meccanismo ancorasconosciuto. Nabissi2016 APOPTOSIDOVUTAADANNODELDNA Laduplicazionecellulareèaccuratamenteregolatadauncomplessodiproteinechesonole ciclineelechinasiciclinadipendenI(CDKs). PerevitarelareplicazionediDNAdanneggiatodurantelafaseSolasuasegregazione durantelafaseM,l’integritàdelDNAèmonitoratadaunaseriedivieditrasduzionedel segnalechepossonoinibirelaprogressionedelciclocellularemedianteinibitoriche interagisconoconicomplessiC/CDK,permeFendolariparazionedelDNA. QuesIcontrolliavvengonoinduefasidelciclo(G1eG2). IlcontrollodelDNAnellafaseG1coinvolgeduechinasi(ATReATM)chefosforilano p53aKvandoloodistaccandoilsuoinibitoreMDM2. IlfaForetrascrizionalep53aKvalatrascrizionedigeni(p21)ilcuiprodoFoinibiscela sintesidiciclineelafosfoforilazionediRb. Nabissi2016 RegolazionetrascrizionaledeiBcl-2 UnulImomeccanismocheregolal’espressioneelafunzionediBcl-2èla suaregolazionetrascrizionale.p53silegaalpromotoredelgeneBax mentredown-regolal’espressionediBcl-2. Nabissi2016 CaspasieHSP Hsp70eHsp27agisconosequestrandoAPAF-1eCit.C,prevenendola maturazionedellacasp-9ediconseguenzainibendol’apoptosi.L’effeSo inibitorioagisceanchealivellodellacas-3 Nabissi2016 NF-kBedApoptosi PerquantoriguardailruolodelfaForetrascrizionaleNF-kB nell’ambitodelprocessoapoptoIco,èbendescriFocomeNF-kB inibiscal’apoptosimedianteaKvazionedifaForianI-apoptoIci dellafamigliaBcl-2(inparIcolareilgeneBcl-xL)odelgeneFLIP (faForeinibitoredell’apoptosi).Comunqueinaltresituazioni fisiologicheNF-kBinducelamortecellularemedianteaumento dell’espressionedip53oaKvandol’espressionedeigeniperFaso FasL.InsintesiilruolodiNF-kBnelprocessoapoptoNcosembrasia regolatodallacondizionefisiologicaedalNpodipopolazione cellulare. Nabissi2016 Nabissi2016 AUTOFAGIA Autofagia (autodigesIone) si riferisceapathwayscellulariche coinvolgono il trasporto di porzioni citoplasmaIche ai lisosomi. 1)vesiclenucleaIon (formazionedimembrane (fagofori). 2)Allungamentodellevescicole ecompletamento(crescitae chiusura). 3)Fusionedell’autofagosoma conillisosoma. 4)Lisidellemembranadell’ autofagosomaedegradazione delsuocontenuto 1 2 3 4 Nabissi2016 Autofagiaaumenta: 1. Perturnoverdelleproteinee organellicitoplasmaIci 2. Generazioneintracellularedi nutrienIedenergia(es.duranteil digiuno,riduzionedifaForidi crescita,aumentodelladomanda bioenergeIca) 3. Temperatura,concentrazionediO2, densitàcellulare REGOLATORICHIAVEDELL’AUTOFAGIA: TORkinasecomplex, ClassIIIPI3K Nabissi2016 Nabissi2016 L’alterazione nei differenI sTeps dell’autofagiahadiverseconseguenze: reduced off-rate: risulta in una d e g r a d a z i o n e l i s o s o m i a l e compromessa, con accumulo di autofagosomi. decreased on-rate : nei dife8 (mutazioni, delezioni) di geni ATG si ha riduzione di vacuoli autofagici e accumulo di proteine aggregate e danniagliorganuliintracellulari. Nabissi2016 Fluorescencemicroscopy(Acidotropicdyes) LysotrackerRed WeaklybasicaminesselecIvelyaccumulate incellularcompartmentswithlowinternal pHandcanbeusedtoinvesIgate thebiosynthesisoflysosomes. Nabissi2016 Invecchiamentocellulare • L’invecchiamentoèunprocessodeterminato esclusivamentedaFATTORIGENETICI(teoria geneIca) • L’invecchiamentodipendedaevenIcasuali checolpisconogliorganismivivenInelcorso dellaloroesistenza(TeoriaStocasIca) • faSoriesogeni+faSoriendogeni Nabissi2016 LECARATTERISTICHEDELL’INVECCHIAMENTO • LecaraSerisBchesono: 1. Instabilitàgenomica 2. Logoramentodeitelomeri 3. AlterazioniepigeneIche 4. Perditadiproteostasi 5. De-regolazione dell’assorbimentodinutrienI 6. Disfunzionimitocondriali 7. Senescenzacellulare 8. Esaurimentocellulestaminali 9. Alterazionedella comunicazioneintercellulare Nabissi2016 Instabilitàgenomica • AccumulodidannigeneIcidurantelavita: 1. MutazionipunIformi 2. Traslocazionigeniche 3. Perditaoguadagnodicromosomi 4. Dis-regolazionegenicacausatada integrazioneviraleotrasposoni DDR:DNADamageResponsemeccanismiingradodi controllareeriparareidanni Nabissi2016 AlterazioniepigeneIche • I cambiamenI epigeneIche coinvolgono alterazioni nella meIlazione del DNA, modificazioni post-traduzionali degli istoni e rimodellamento della cromaIna. • H4K16:istoneaceIlasi • H4K20:trimeIlazione • H3K9:meIlazione • SIR2:deaceIlasi Sonogeni,consideraBmarkersepigeneBci,associaBall’invecchiamento Nabissi2016 Logoramentodeitelomeri I telomeri sono legaN ad un complesso mulNproteico denominato Shelterin e il logoramento dei telomeri è associato a perdita della funzionalità di questo complesso proteico. In modelli sperimentali (loss of FuncBon) si ha un rapido declino della rigenerazioneBssutaleedunacceleramentodeiprocessid’invecchiamento Nabissi2016 PerditadiProteostasi Perditadeimeccanismidicontrollodellaqualità,stabilitàefunzionalità. QuesN sistemi funzionano in modo coordinato per ristabilire la struZura delle proteine appaiate in modo non correZo, rimuovere e degradare quelle danneggiate Nabissi2016 Disfunzionimitocondriali Nabissi2016 De-regolazionedell’assorbimentodinutrienI L’assesomatotropico,comprendeilGH, prodoFo dall’ipofisi anteriore e il mediatore secondario IGF-1 (prodoFo damolIIpicelluari). IGF-1 signaling è fortemente correlato con l’invecchiamento, in parIcolare aFraversoFOXOemTOR. Polimorfismi o mutazioni che riducono il sistema IGF sono correlaI con la l o n g e v i t à ( p a t h w a y s t r o fi c i e bioenergeIci). La restrizione calorica è correlata all’invecchiamento normale e alla longevità. Nabissi2016 Senescenzacellulare • La senescenza cellulare è definita come l’arresto stabile del ciclo cellulareaccoppiataacambiamenI fenoIpici. • L a s e n e s c e n z a è c a u s a t a dall’accorciamento dei telomeri e da fenomeni indipendenI dai telomeri. • Danni al DNA e de-repressione del l o c u s I N K 4 / A R F a v v e n g o n o p r o g r e s s i v a m e n t e e c r o n o l o g i c a l m e n t e c o n l’invecchiamento Nabissi2016 Senescenzacellulare • Le cellule in senescenza in un tessuto sono circa un 20% (analisi del DNA danneggiato e della beta-galaFosidasi (SABG)) • Quindi la senescenza cellulare non è un conceFo generalizzatodituKitessuIdiunorganismo • L e c e l l u l e i n s e n e s c e n z a s o n o s o g g e F e a immunosorveglianzaefagocitate. • La senescenza, previene la propagazione di cellule danneggiateesImolailsistemaimmunitario. • Quindi la senescenza è una risposta compensatoria che contribuisceaproteggereitessuIdacelluledanneggiatee celluletumorali Nabissi2016 DelezionediINK4/ARF BubR1progeroidmouse BubR1progeroidmouselackingp16Ink4a SABGstaining Nabissi2016 MeccanismiaFraversocuilarimozionedellecelluleinsenescenzadaitessuIinvecchiaIpuo’ influiresullafunzionalitàIssutale. Le cellule invecchiate mantengono comunque caraFerisIche e danni anche in assenza di cellule in senescenza, dimostrando che i tessuB non possono regredire a condizioni preinvecchiamento. Nabissi2016 Metodiperanalizzarel’aMvitàdellaSA-βgal Cytochemical assay uses the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3- indoyl β-Dgalactopyranoside(X-gal),whichyieldsaninsolublebluecompoundwhencleavedby β-galactosidase. Nabissi2016
