Purificazione e caratterizzazione della β

Purificazione e caratterizzazione della β-glucosidasi, un enzima chiave nei meccanismi di difesa
da patogeno nell’olivo, mediante tecniche di separazione molecolare ed imunocitochimiche.
Introduzione
Le β-glucosidasi (β-D-glucoside glucoidrolasi) sono enzimi ampiamente diffusi nel regno dei viventi
procarioti ed eucarioti. Esse calatizzano l’idrolisi di aril- e alchil-β-D-glucosidi come anche di glucosidi
in solo mezzo carboidratico. Le β-glucosidasi di ordini e regni diversi si differenziano per la loro
specificità all’aglicone che è legato con il gruppo glucoside tramite un legame β-glicosidico. Quasi tutte
le β-glucosidasi hanno più o meno lo stesso peso molecolare compreso fra 55 a 65 kDa, un optimum di
pH acido (pH 5-6) ed una assoluta richiesta di β-glucosidi come substrato (Esen A., 1993).
Le attuali ricerche sulle β-glucosidasi hanno assunto sempre più rilevante interesse scientifico, medico
ed economico. Ad esempio, una β-glucosidasi acida umana (glucocerebrosidasi) ha attualmente
acquistato un potenziale terapeutico nel trattamento della sindrome di Gaucher e nei disordini ereditari
causati dalla deficienza di questa β-glucosidasi acida localizzata nei lisosomi; una β-glucosidasi citosolica
umana è implicata nel metabolismo della piridossina-5’-β-D-glucoside, così come nell’idrolisi dei βglucosidi ingeriti con alimenti di origine animale e vegetale; applicazioni di sistemi βglucosidasi/glucosidi cianogenici trovano positivo riscontro nella terapia antitumorale. Tali enzimi hanno
un grande interesse in campo economico sia perché le β-glucosidasi di funghi e batteri appaiono come
candidati naturali per creare una β-glucosidasi ideale da utilizzare nella conversione della cellulosa in
glucosio su scala industriale sia perchè risultano coinvolte nella modulazione delle qualità organolettiche
e sensoriali di prodotti agroalimentari.
Le β-glucosidasi delle piante sono conosciute da oltre 160 anni dalla descrizione dell’azione
dell’emulsina (β-glucosidasi di mandorlo) sull’amigdalina, una β-D-gentiobiside cianogenica, da parte di
Liebig e Wöhler nel 1837. Solo negli ultimi vent’anni, però, è stato fatto un progresso considerevole nella
biologia molecolare e nella biochimica di tali enzimi. Nelle piante, le β-glucosidasi sono coinvolte in una
varietà di eventi chiave del metabolismo ed in risposte relative alla crescita. Si passa dall’idrolisi di
fitormoni coniugati e quindi all’attivazione degli ormoni stessi (ad esempio, glucosidi di gibberelline,
auxine, acido abscissico e citochinine) al coinvolgimento nei processi di lignificazione fino alla difesa
contro alcuni patogeni ed erbivori attraverso il rilascio di sostanze tossiche (quali cumarine, tiocianati,
terpeni e cianidi).
La validità dell’applicazione di queste nuove molecole bioattive in campo medico e farmacologico è
testimoniata dai tentativi sempre più frequenti di purificare e stabilizzare i prodotti della reazione
enzimatica attraverso bioreattori catalitici che utilizzano β-glucosidasi di mandorlo e dall’archeobatterio
Sulfolobus solfataricus over-espresso in E. coli. Questi enzimi, pur dimostrando una buona specificità per
il substrato oleuropeina, limitano la produzione dei suoi derivati aldeidici insaturi, gli unici che hanno
dimostrato una forte azione antibatterica in vitro.
Da qui la necessità di disporre dell’enzima β-glucosidasi nativo che troverebbe applicazioni
biotecnologiche nella produzione di piante transgeniche resistenti e nella produzione delle molecole ad
elevata attività biologica con vaste applicazioni in campo industriale nella produzione degli agroalimenti
ed in applicazioni farmaceutiche.
Il progetto proposto ha come scopo la ricerca di metodi avanzati di separazione e purificazione di
proteine con attività catalitica e di derivati, di particolare interesse industriale, a partire da un estratto
proteico di Olea europaea. Sono state confrontate diverse modalità estrattive dai tessuti di olivo in
relazione sia alla quantità che alla qualità del prodotto proteico ottenuto. E’ stato verificato che
l’isolamento della β-glucosidasi da olivo mediante i metodi tradizionali (quali precipitazione con solventi
organici e dialisi), origina un prodotto purificato, ma molto spesso compromesso nelle normali attività
biologiche. Per questo motivo si è ricorso alla purificazione per mezzo della tecnologia a membrana, che
offre un'allettante alternativa, rispetto ai metodi tradizionali. Tale metodologia, sfruttando il diverso peso
molecolare del proteoma presente nell’estratto proteico di Olea europaea, consente (variando il cut-off
della membrana) di trattenere determinate molecole proteiche preservandone l'attività enzimatica ed,
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inoltre, consente di allontanare dagli estratti i composti interferenti e non proteici, quali complessi lipidici,
fenolici e pigmenti, consentendo così la purificazione della frazione proteica enzimaticamente attiva
(Zwijnenberg H.J. et al., 2002).
Inoltre, per la caratterizzazione della β-glucosidasi si farà ricorso all’elettroforesi bidimensionale, che
permette di ottenere una maggiore risoluzione di una miscela complessa di proteine. Tale tecnica, infatti,
è in grado di separare migliaia di proteine differenti in funzione di due variabili in due diversi steps: la
prima dimensione, isoelettrofocalizzazione (IEF), separa le proteine in base al loro punto isoelettrico; la
seconda dimensione, SDS-PAGE, separa le proteine in base al loro peso molecolare.
La β-glucosidasi nelle Oleaceae
Nella famiglia delle Oleaceae una β-glucosidasi endogena (β-D-glucoidrolasi, E.C. 3.2.1.21)
specifica per il biofenolo oleuropeina attiva un complesso meccanismo di difesa multichimico i cui
prodotti mostrano una spiccata attività antiossidante e antibatterica. L’oleuropeina è presente in alte
quantità nelle foglie dell’ulivo (Le Tutour e Guedon, 1992), anche se è stata trovata in tutto l’albero,
incluso i frutti (Servili et al., 1999). Al momento sia la qualità che la quantità di composti fenolici e
secoiridoidei e dei loro derivati risulta essere ben documentata in Olea europaea (Bianco et al., 1999;
Savourin et al., 2001) come anche la variazione dipendente dalla varietà, dalla stagione, dallo stadio di
maturazione del frutto e dall’età della foglia (Ryan et al., 2003; Briante et al., 2002; Esti et al., 1998). I
componenti agliconici, derivati dall’idrolisi dell’oleuropeina sono responsabili del tipico sapore amaro e
pungente che caratterizza frutti e foglie delle Oleaceae. Tale principio amaro diminuisce
significativamente durante la maturazione del frutto e nella senescenza foliare e deve essere attenuato o
eliminato nei prodotti agroalimentari da essi derivanti. Perciò, recentemente l’interesse dell’industria
agroalimentare si è rivolto alla chimica dei composti biofenolici della drupa attraverso lo studio della
trasformazione molecolare dell’oleuropeina.
Le piante superiori hanno sviluppato strategie difensive per proteggersi da insetti, erbivori e patogeni.
Migliaia di prodotti chimici presenti nelle varie specie, spesso associati al metabolismo secondario, sono
in relazione ai meccanismi di difesa. Il modello di difesa in Olea europaea è di particolare interesse, non
solo per botanici, biologi e biochimici ma anche per agronomi e operatori nel settore olivicolo, in quanto
conoscenze sull’azione e regolazione dei meccanismi di difesa avrebbero una positiva ricaduta
nell’impiego di nuove strategie di lotta contro gli agenti infestanti dell’olivo, migliorando la qualità e la
quantità del frutto e dei prodotti da esso derivanti.
Alla luce di quanto esposto e vista l'importanza economica che riveste nella nostra regione la
coltivazione dell'olivo, il presente progetto di ricerca si occuperà di raccogliere dati utili per la
caratterizzazione della componente enzimatica presente nel frutto di cultivars calabresi, Carolea e
Cassanese, di notevole interesse agronomico e commerciale. Questo studio darà interessanti indicazioni
sull'influenza del fattore varietale sui livelli dell’attività β-glucosidasica e, quindi, del grado di
“resistenza”all’attacco da patogeni di una cultivar. .Inoltre, sulla base di dati sperimentali, si cercherà di
elaborare un modello di azione dell’enzima durante un attacco patogeno simulato.
Gli obiettivi del presente progetto possono, quindi, essere riassunti in
i) Caratterizzazione dell'attività enzimatica di drupe delle cultivars Carolea e Cassanese in relazione
allo stadio di sviluppo e maturazione del frutto, in cui sono previste le seguenti fasi:
a)
Estrazione e purificazione dell’enzima nativo mediante tecniche di base (PAGE) e tecnologie
a membrana
b)
Purificazione mediante processi di diafiltrazione
c)
Saggio dell’attività enzimatica specifica nelle fasi di purificazione
d)
Zimogramma per la detection degli isozimi
e)
Caratterizzazione elettroforetica dell’enzima purificato mediante analisi 1D e 2D ed
immunoblotting, utilizzando l’anticorpo anti-β-glucosidasi. Gli spots individuati dall’analisi
westernblot verranno isolati per la determinazione della sequenza amminoacidica mediante
MS/MS e/o microsequenziamento. Allineamento e confronto delle sequenze amminoacidiche
con quelle presenti in banca dati, compresa quella per una putativa β-glucosidasi di olivo. La
specificità di substrato verso l’oleuropeina e la stima dell’attività enzimatica dell’enzima
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purificato, verrà monitorata sempre mediante tecniche PAGE integrandola con l’analisi in
spettrofotometria mediante saggio cromogenico (X-GLU) e saggio glucosio OssidasiPerossidasi.
ii) Localizzazione istologica e citologica della β-glucosidasi nei tessuti di foglia e drupa mediante
tecniche citoistochimiche e immunoistochimiche, tramite l’utilizzo di un anticorpo policlonale diretto
contro la β-glucosidasi (fornito da Yoshiko Minami, Okayama University, Japan).
iii) Analisi del pattern di localizzazione in relazione allo stadio di sviluppo e maturazione della drupa
nelle due cvs.
iv) Analisi del pattern dell’attività della β-glucosidasi in seguito ad attacco patogeno.
Risultati raggiunti
L’insieme dei risultati ottenuti, utilizzando tecniche citoistologiche, immunocitochimiche e
biochimiche per la caratterizzazione dell’enzima β-glucosidasi sia nei tessuti foliari che del frutto in
maturazione, ha permesso di identificare almeno quattro isoforme di cui tre, a peso molecolare di 65 kDa,
identificabili mediante anticorpo specifico e una quarta, a peso molecolare di circa 30 kDa, identificata
mediante processi di separazione su sistemi a membrana a cut-off differenziali. Le tre isoforme
evidenziate attraverso la separazione 2-DE di estratti provenienti da foglia e frutto, differiscono in pIs e
sono localizzate, una a livello stromatico nei cloroplasti, le altre due, invece, sono citoplasmatiche, come
risulta dalla localizzazione con la tecnica Immunogold nei tessuti fotosintetizzanti. Le analisi
immunocitochimiche nei tessuti di foglia e frutto hanno evidenziato una espressione differenziale durante
le fasi di sviluppo e maturazione di questi organi. In particolare, le tre isoforme sono assenti nelle foglie
giovani del primo nodo e la loro espressione aumenta in funzione del grado di maturazione e sviluppo
foliare; nel frutto in maturazione verde si è, invece, rilevata la presenza di un gradiente negli strati
superficiali e profondi del frutto, in relazione al grado di differenziazione cloroplastica. Questi risultati
suggeriscono che l’espressione dell’enzima è fortemente influenzata dallo stadio di sviluppo foliare e
maturazione del frutto, che risultano associati alla capacità fotosintetica dei tessuti. Ciò dimostra che in
olivo, analogamente a quanto riscontrato in altre specie e generi, i sistemi di difesa costitutiva che
utilizzano enzimi glicosidici sono esclusivamente attivi nei tessuti fotosintetizzanti.
Dosaggi dell’attività β-glucosidasica hanno rilevato la maggiore concentrazione nelle drupe verdi
mature e pertanto è stato selezionato come tessuto di partenza per la purificazione dell’enzima mediante
processi di diafiltrazione a membrana. E’ stata effettuata la parziale purificazione dell’enzima nativo
partendo da estratti grezzi di drupe con elevata attività enzimatica, mediante diafiltrazione attraverso
membrane asimmetriche di poliammide con cut-off di 50 kDa e di polisulfone con cut-off di 30 kDa.
Elettroforesi quantitative e qualitative hanno identificato un polipeptide di 65 kDa come banda
polipeptidica più rappresentata nella diafiltrazione a membrana di 50 KDa. I dati ottenuti dimostrano che
la diafiltrazione degli estratti da frutto aumenta significativamente l’attività specifica della β-glucosidasi.
L’enzima isolato ha mostrato una elevata affinità per il substrato oleuropeina e una moderata attività per
altri β-D-glucosidi sintetici e naturali.
Risultati attesi
¾ Individuazione dei tessuti vegetali a maggior contenuto enzimatico (organo e stadio di
sviluppo).
¾ Estrazione proteica e monitoraggio della stabilità enzimatica mediante saggio dell’attività
catalitica.
¾ Caratterizzazione elettroforetica delle isoforme enzimatiche presenti nel tessuto individuato e
analisi MALDI/TOF degli spots.
¾ Individuazione dell’isoforma specifica per l’oleuropeina.
¾ Purificazione degli estratti proteici attraverso processi di diafiltrazione.
¾ Cristallizzazione a membrana degli estratti purificati.
¾ Immobilizzazione dei composti in situ.
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