Risultati della Ricerca Resistenza all`attacco di agenti patogeni

Risultati della Ricerca
Titolo
Resistenza all'attacco di agenti patogeni e fitofagi
Descrizione estesa del risultato
Nella specie Olea europaea una b-glucosidasi endogena, specifica per il fenolo secoiridoideo
oleuropeina, è espressa nei tessuti di foglie e frutti dove è coinvolta nei processi di sviluppo e
maturazione dei tessuti nonché nel complesso meccanismo di difesa multichimico contro agenti
patogeni e fitofagi, quale la larva di Bactrocera, che si esplica attraverso la produzione di molecole
ad
elevata
attività
antibatterica
e
antiossidante.
I nostri studi rilevano che la resistenza all'attacco della mosca è mediata da:
-attività specifica della beta-glucosidasi nei confronti dell'oleuropeina che risulta più elevata nelle
cultivar
resistenti.
-espressione differenziale della beta-glucosidasi durante la maturazione e in particolare una ridotta
espressione
durante
la
fase
verde
immatura.
-relazione tra compartimentazione dell'enzima a livello subcellulare (cloroplasto) e del substrato
oleuropeina (vacuolo) e timing della risposta di difesa costitutiva. La localizzazione cellulare e
tissutale di questo enzima riveste una notevole importanza nella comprensione del ruolo svolto dal
sistema b-glucosidasi/oleuropeina durante il processo di sviluppo foliare e di deamarizzazione del
frutto. Grazie alla collaborazione con la Dr. Yoshiko Minami (Department of Biochemistry,
Okayama University of Science, Japan) che ha fornito un anticorpo policlonale la b-glucosidasi è
stata localizzata a livello dello stroma del cloroplasto, mentre l’oleuropeina si trova nel vacuolo.
L’attività di ricerca ha riguardato lo studio della b-glucosidasi nella risposta iniziale all’attacco di
Bactrocera in cultivars che mostrano una diversa suscettibilità all’infestazione. Nelle cultivars
considerate, entro 20 min dopo l’attacco, si ha una forte attività dell’enzima nei tessuti danneggiati.
Successivamente l’attività decresce fino a non essere più rilevabile ad 1 ora dal danno e si stabilizza
dopo 3 ore dal danno. I livelli di oleuropeina, invece, non cambiano sensibilmente nelle cultivar
molto sensibili alla infestazione di B. oleae, mentre diminuiscono rapidamente nella cultivar che
mostra una bassa suscettibilità. I nostri risultati suggeriscono fortemente che la suscettibilità del
frutto di olivo verso l'infestazione della mosca è data dalla attività specifica della b-glucosidasi nel
degradare l’oleuropeina e produrre così le molecole reattive nei tessuti danneggiati.
I prodotti relativi a tale ricerca, che potrebbero essere trasferiti nelle pratiche colturali per la difesa
fitosanitaria
dell'olivo,
hanno
riguardato:
-identificazione molecolare di cultivar con maggiore efficienza del sistema di difesa
oleuropeina/b-glucosidasi.
-isolamento e caratterizzazione dell'enzima b-glucosidasi espresso nei frutti per studi di reazione in
condizioni controllate. Attraverso tecniche proteomiche sono state individuate e parzialmente
sequenziate tre diverse isoforme che presentano identico peso molecolare, ma diverso punto
isoelettrico. Ciò ha fatto supporre modificazioni post-trasduzionali delle tre isoforme espresse nella
drupa, che potrebbero derivare dallo stesso m-RNA amplificato in reazioni PCR e RT-PCR su
inneschi costruiti sulla unica sequenza di b-glucosidasi presente in banca dati. In particolare le tre
isoforme non sono espresse a 50 DAF (Day After Flowering), due di queste sono espresse a 120
DAF mentre l'espressione di tutte e tre le isoforme avviene a partire da 160 DAF.
-progettazione e realizzazione di un bioreattore a membrana caricato con l'enzima b-glucosidasi
nativo. La purificazione dell’enzima è stata ottenuta utilizzando il metodo di separazione
molecolare di diafiltrazione su membrana. Tale metodica è stata realizzata in collaborazione con
l’Istituto per le Tecnologie delle Membrane del CNR (ITM-CNR). Elettroforesi quantitative e
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qualitative hanno identificato un polipeptide di 65 kDa come banda polipeptidica più rappresentata
nel permeato della diafiltrazione a membrana di 50 KDa. La stabilità della ß-glucosidasi
parzialmente
purificata
è
stata
monitorata
utilizzando
il
substrato
D-nitrophenil-ß-D-glucopiranoside (pNPGlc) come standard di reazione. I dati ottenuti dimostrano
che la diafiltrazione degli estratti da frutto aumenta significativamente l’attività specifica della
ß-glucosidasi che risulta essere rappresentata da una singola forma con una apparente mobilità
elettroforetica di 65 kDa, identificata come -glucosidasi da analisi immunoblot. L’enzima isolato
ha mostrato una elevata affinità per il substrato oleuropeina e una moderata attività per altri
-D-glucosidi
sintetici
e
naturali.
- produzione di molecole bioattive derivanti dal'idrolisi enzimatica dell'oleuropeina nel bireattore. E'
stato un bioreattore catalitico a membrana usando l’enzima immobilizzato con metodi fisici. Al fine
di identificare le proprietà catalitiche della -glucosidasi immobilizzata e la sua distribuzione nel
bioreattore, modificando le tecniche citochimiche e immunocitochimiche, è stato sviluppato un
nuovo metodo combinato che rileva l’attività dell'enzima in situ e contemporaneamente la sua
immunolocalizzazione nelle membrane. Questo nuovo metodo presenta notevoli vantaggi rispetto ai
tradizionali metodi di stima indiretta dell’attività enzimatica basata sul rilevamento dei prodotti di
reazione nell’intera soluzione. Il metodo consente inoltre di monitorare la distribuzione dell’enzima
nella membrana, informazione di cruciale importanza nell’ottimizzazione delle metodologie di
immobilizzazione, nella modellizzazione dei bioreattori e nel loro sviluppo su larga scala. L’idrolisi
enzimatica dell’oleuropeina da parte di una b-glucosidasi specifica determina la produzione di
dialdeidi alfa,beta-insature ad elevata attività antimicrobica e antiossidante.
-determinazione dell’ambiente chimico per la stabilizzazione delle molecole bioattive.
Responsabile del risultato
Silvia Mazzucca
, – ()
Tel.:
E-mail:
Anno
2010
Classificazione del risultato
Comparto produttivo: Produzioni vegetali fresche e trasformate
COMPARTO OLIVICOLO-OLEARIO
Comparto olivicolo-oleario in generale
Particolari categorie PARTICOLARI CATEGORIE DI PRODOTTI IN GENERALE
di prodotti/comparti Particolari categorie di prodotti/comparti produttivi in generale
produttivi:
Categorie di ambiti di TEMATICHE TECNICHE SU SPECIFICHE FASI DELLE FILIERE
ricerca:
PRODUTTIVE
Piante, coltivazione e produzione primaria (varietà, genetica, coltivazione
biologica, agrotecniche, difesa, ecc.)
DIFESA E RELATIVI INPUT
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Difesa e relativi input in generale
Parole chiave
difesa della coltura, oleuropeina
Trasferibilità del risultato
Si, trasferibilità previa sperimentazione
Natura del risultato
di processo-prodotto
Aree interessate
Calabria
Impatto dal punto di vista tecnico
resistenza alle avversità biotiche
Impatto dal punto di vista socioeconomico
miglioramento qualitativo
Impatto dal punto di vista ambientale
riduzione input chimici ed energetici
sostenibilità ambientale delle produzioni
Presupposti di contesto
presenza politiche di incentivo
Soggetti istituzionali da coinvolgere
Industrie di settore
Industrie di trasformazione
Enti di ricerca
Potenziali utilizzatori
Divulgatori
Ditte di agrofarmaci
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Modalità di diffusione
Progetti comuni con i vari soggetti, istituzionali e non, interessati
Progetti comuni con industrie di trasformazione
Pubblicazioni
Spadafora, A.; Mazzuca, S.; Chiappetta, F.F.; Parise, A.; Perri, E.; Innocenti, A.M. (2008):
Oleuropein-Specific-B-Glucosidase Activity Marks the Early Response of Olive Fruits(olea
europaea)To Mimed Insect Attack, Vol. 7 p. 101-105
Mazzei, R.; Giorno, L.; Spadafora, A.; Mazzuca, S.; Drioli, E. (2006): Improvement of
β-glucosidase activity of Olea europea fruit extracts processed by membrane technology, Vol. p.
58-66
Mazzuca, S.; Giorno, L.; Spadafora, A.; Mazzei, R.; Orioli, E. (2006): Immunolocalization of
β-glucosidase immobilized within polysulphone capillary membrane and evaluation of its activity
in situ, Vol. p. 152–158
Mazzuca, S.; Spadafora, A.; Innocenti, A. M. (2006): Cell and Tissue localization of β-glucosidase
during the ripening of olive fruit (Olea europaea) by in situ activity assay, Vol. p. 726-733
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Progetto / Ricerca di riferimento
Titolo del progetto
Ricerca ed innovazione per l'olivicoltura meridionale - RIOM
Coordinatore del progetto
Enzo Perri
C/da Li Rocchi Vermicelli, 87036 – RENDE ()
Tel.: +39-0984-4052
E-mail: [email protected]
Ente finanziatore
Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali, MiPAAF
Breve descrizione del progetto e dei suoi obiettivi
Gli obiettivi generali del progetto sono i seguenti:
- caratterizzazione del germoplasma olivicolo delle sei regioni dell’obiettivo uno;
- miglioramento genetico e sanitario di ecotipi di germoplasma di olivo di interesse dell’Italia
meridionale per produrre accessioni da avviare alla certificazione volontaria;
- studio e valorizzazione della biodiversità dell’olivo;
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- caratterizzazione, valorizzazione e miglioramento quali-quantitativo delle produzioni olivicole
(olio e olive da mensa);
- sviluppo di strategie, agronomiche e tecnologiche, per la riduzione dei costi di produzione;
- sviluppo di sistemi di produzione olivicolo-oleari sostenibili per l’ambiente;
- sviluppo di innovazioni in alcune tecniche colturali (gestione del suolo, nutrizione delle piante,
difesa fitosanitaria, ecc.) finalizzate ad incrementi quantitativi e qualitativi della produzione;
- analisi di mercato ed analisi economica della filiera;
- riduzione dell’impatto ambientale dei sottoprodotti dell’industria olearia;
- maggiore sicurezza alimentare a tutela della salute del consumatore;
- studiare e promuovere lo sviluppo delle imprese olivicole multifunzionali per lo sviluppo rurale,
in accordo con la nuova politica agricola comune;
- sviluppare nuovi modelli di rinnovamento e ristrutturazione degli impianti olivicoli;
- studiare le proprietà salutistico-nutrizionali delle olive e degli oli;
- studiare le caratteristiche di tipicità degli oli di oliva e sviluppare tecniche per la loro
rintracciabilità, anche con l’ausilio della Spettroscopia di Risonanza Magnetica.
U.O. / Partner coinvolti nella realizzazione del risultato
Università degli Studi di Reggio Calabria
Referenti istituzionali già coinvolti nella ricerca
Non sono presenti Referenti già coinvolti per il risultato
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