Genetica Molecolare
I polimorfismi genetici sono utili nell’autismo, i l test molecolare viene condotto effettuando
l'analisi dei polimorfismi di eguito riportati. Per la genotipizzazione si opera inizialmente una
reazione enzimatica di amplificazione del DNA, conosciuta come Polymerase Chain Reaction
(PCR), che consente di amplificare in vitro una specifica regione della molecola, copiandola in
varie fasi successive, fino ad ottenerne milioni di copie. I prodotti di PCR così ottenuti vengono
sottoposti ad analisi di sequenza automatizzata mediante l'impiego di un sequenziatore automatico
a tecnologia fluorescente (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer). L'analisi di mutazione viene
effettuata mediante analisi comparativa tra le sequenza ottenute per il campione in esame e le
sequenze normali dei geni investigati, depositate nel database internazionale GeneBank.
Nell’ autismo è utile investigare sui seguenti polimorfismi genetici.:
Gene
NOS3
CBS
SUOX
MTHFR
MTR
MTRR
VDR
COMT
MAO A
MAO A
SHMT
Varianti genetiche
-786 T>C
Glu298Asp
VNTR introne 4
Y233Y (C699T)
T1080C(A360A)
Q364X
S370S
S370Y
Cod.381del TAGA
A222V (C677T)
E429A (A1298C)
A2756G
A66G
Fok1 (ATG ACG codon 1)
BsmI (A-G introne 8)
TaqI (T-C esone 9)
V158M
A72S
H62H
L136L
R297R
Q296X
C1420T
Ossido sintetasi endoteliale (eNOS): polimorfismi -786 T>C, Glu298Asp e VNTR introne 4
L’enzima Nos ha un ruolo importante nella detossificazione dell’ammoniaca nel ciclo dell’urea, la mutazione NOS++
induce una riduzione dell’attività
di questo enzima, può potenziare l’effetto dell’attività del CBS dovuta
all’incremento dell’ammoniaca prodotta .
Nel sistema vascolare, l’ossido nitrico (NO) esercita un ruolo importante producendo vasodilatazione, regolando il
flusso sanguigno e la pressione arteriosa, e conferendo proprietà protettive all’endotelio dei vasi s anguigni. La
vasodilatazione endotelio-dipendente è mediata dal rilascio di NO prodotto dall’ossido sintetasi endoteliale (eNOS).
Una ridotta sintesi di NO o nella sua minore bio-disponibilità potrebbe essere la causa della ridotta vasodilatazione
endotelio-dipendente che si osserva nei vasi sanguigni di soggetti fattori di rischio cardiovascolari, quali fumatori attivi
e passivi, pazienti con ipertensione o ipercolesterolemia. La mancanza di effetti NO-mediati può inoltre predisporre
allo sviluppo di arteriosclerosi. Il polimorfismo -786 T>C della regione promotore del gene codificante ossido sintetasi
endoteliale (NOS3) riduce la sintesi di NO endoteliale, suggerendo che i portatori di tale variazione nucleotidica sono
predisposti all’insorgenza di patologie coronariche. Ma l’indicazione più importante è data dal fatto che questa
riduzione è esacerbata dal fumo di sigaretta.
La variante missenso Glu298Asp, presente a livello dell’esone 7 del gene NOS3, agirebbe in sinergia con il
polimorfismo della regione promotore, aumentando ulteriormente il rischio di patologie coronariche.
Un raro polimorfismo VNTR localizzato a livello dell’introne 4 del gene NOS3 (Ins>Del Introne 4) rappresenta un
fattore di rischio di infarto al miocardio (MI). La frequenza di questa variante si è mostrata significativamente più
elevata (di circa 7 volte) in pazienti con MI senza conosciuti fattori di rischio secondari. Questa variante è stata inoltre
associata con stenosi arteriosa, specialmente in associazione con il tradizionale fa ttore di rischio del fumo di
sigaretta.Yoshimura (1998) Hum Genet 103, 65;Nakayama (1999) Circulation 99, 2864;Wang (1996) Nat Med;2:4145. È comunque utile nell’autismo.
Cistationina Beta Sintetasi (CBS): polimorfismi C699T e T1080C
La CBS è un enzima necessario per convertire l’Omocisteina in Cistatione, agisce fondamentalmente come ponte tra
l’aminoacido di partenza e il passaggio successivo del ciclo di metilazione che genera ammoniaca. Le mutazioni
investigate determinano una alterazione che impedisce al “ponte”• CBS di richiudersi; questa stato sbilanciato toglie
gruppi metilici al resto del ciclo provocando carenze importanti tra cui quella di vitamina B12. Sebbene in questa
situazione si producano elementi utili quali il glutatione e la taurina,vi sono però dei prodotti di scarto negativi come
l’ammoniaca e i solfiti. A causa dell’aumentata attività CBS,questi gruppi sulfurei necessari al ciclo della metilazione
vengono rilasciati nel s istema sotto forma di solfiti che sono tossici per l’organismo e determina un deterioramento dei
prodotti del SUOX; E’ stato dimostrato che i due polimorfismi del gene CBS (C699T e T1080C) determinano un
aumento dell’attività dell’enzima, riducendo la quan tità di omocisteina nel sangue. Tali polimorfismi sono inoltre
associati ad un rischio ridotto di insorgenza di patologie coronariche.
Individui con attività carente del CBS,alti livelli di taurina e bassi livelli di glutatione,diminuiscono l’escrezione
di metalli se assumono alti dosaggi di ALA (acido alfa lipoico ),non ne è consigliata quindi in questi individui la
supplementazione. Alimenti ricchi di zolfo andrebbero evitati in caso di mutazioni SUOX e CBS.
SUOX (Solfito Ossidasi) polimorfismi Q364X, S370S , S370Y e Cod.381del TAGA
Il gene SUOX è coinvolto nella attività di detossificazione dei solfiti nel nostro organismo;
La solfito ossidasi è l’enzima terminale prodotto da questo gene nel processo di degradazione ossidativa degli
aminoacidi contenenti Zolfo.
Sono state isolate quattro mutazioni del gene SUOX nelle linee cellulari di pazienti con insufficienza enzimatica di
solfito ossidasi ( Kisker et al,1997 606887.0001-606887.0004).
Il molibdeno contenuto nella solfito ossidasi catalizza la conversione d el solfito in solfato,il passaggio finale nella
degradazione ossidativa di cisteina e metionina. Negli esseri umani l’insufficienza di questo enzima in genere conduce
ad anomalie neurologiche.
Delle quattro varianti identificate ed associate a insufficienza enzimatica due sono legate al sito del solfato mentre le
altre si trovano nel dominio che ne media la dimerizzazione (PMID:8719749).
L’insufficienza da solfito ossidasi neonatale è caratterizzata da gravi disfunzioni neurologiche,atrofia del
cervello,dislocazione del cristallino,incremento nelle urine di solfiti,tiosolfato,taurina e S-cisteina,e una bassa
concentrazione di cisteina nel plasma.
Mutazioni nel gene Suox,compromettono seriamente l’ attività detossificante,creando intolleranze spesso con esiti
gravi.
I solfiti sono generati come sottoprodotti naturali del ciclo di metilazione dagli alimenti che ingeriamo o dalle sostanze
che possiamo inalare; vengono infatti utilizzati in grande quantità come conservanti per evitare lo scolorimento o
impedire la crescita dei microorganismi nell’industria alimentare ( frutta ,verdura, marmellate,cibi precotti,
,pesce,farine,vino ecc) ; sono impiegati per mantenere la stabilità e la l’efficacia di alcune medicine,per prevenire la
ruggine e le incrostazioni nell’acqua delle caldaie e persino per la produzione del cellophane per confezionare gli
alimenti.
La Food and Drug Administration stima che una persona su cento è sensibile ai solfiti ed il 5 per cento di questi soffre
d’asma. Una persona può sviluppare sensibilità ai solfiti in qualsiasi momento della sua vita; gli scienziati non hanno
evidenziato la concentrazione minima di solfiti necessaria per scatenare una reazione nelle persone sensibili. Il sintomo
più comune riportato dalle persone intolleranti è la difficoltà di respirazione ma i sintomi possono variare molto da
persona a persona;i solfiti possono essere causa di orticaria,nausea,dolore al petto, ed in alcuni casi di gravi reazioni
allergiche. I solfiti inoltre emanano un gas, l’anidride solforosa che causa irritazione nei polmoni e può portare a severi
attacchi di asma. Mutazioni del SUOX possono essere cause di rischio per alcuni tipi di cancro,compreso la leucemia. I
solfiti potrebbero stimolare la risposta adrenergica di “Attacco - Fuga”• del sistema nervoso autonomo e stimolare la
risposta allo stress del cortisolo.
Molte persone con mutazione SUOX+-, soffrono di reflusso acido che sembra non rispondere ai normali farmaci
antireflusso GER,è possibile che la radice del problema sia l’eccesso dei solfiti che producono effetti allergici similasma e che hanno come reazione secondaria il reflusso acido.
Soprattutto se associato ad una iperattività dell'enzima prodotto dal CBS (in caso di etero o omozigosi) è necessario
ridurre l'apporto dietetico dei cibi e supplementi contenenti zolfo come la metionina, taurina e cisteina, che sono
soprattutto concentrate nelle proteine animali (e che quindi conviene ridurre nell'alimentazione.)
Molti integratori come il GSH, MSM, NAC dovrebbero essere evitati, così come alcuni farmaci utilizzati come
antipertensivi o antibiotici o chelanti dovrebbero essere utilizzati con attenzione.
I solfiti pertanto risultano essere neurotossici e possono accumularsi in caso di difettoso funzionamento del SUOX
nella sua forma di eterozigote o di omozigote. Per accelerare il funzionamento del SUOX è consigliabile la
supplementazione con Molibdeno, Boro, Vitamina E e VitaminaB12.
MTHFR (Metilentetraidrofol atoreduttasi): polimorfismi C677T e A1298C
La metilentetraidrofolatoreduttasi (MTHFR) è un enzima coinvolto nella trasformazione del 5-10
metilentetraidrofolato in 5 metiltetraidrofolato che serve come donatore di metili per la rimetilazione della omocisteina
a metionina tramite l'intervento della vitamina B12. E’ un punto focale del ciclo della metilazione e riveste inoltre un
ruolo fondamentale sui livelli dei neurotrasmettitori serotonina e dopamina.
Rare mutazioni ( trasmesse con modalità autosomica recessiva) possono causare la deficienza grave di MTHFR con
attività enzimatica inferiore al 20% e comparsa di omocisteinemia ed omocistinuria e bassi livelli plasmatici di acido
folico. La sintomatologia clinica è grave con ritardo dello sviluppo psico -motorio e massivi fenomeni trombotici.
Accanto alla deficienza grave di MTHFR è stato identificato un polimorfismo genetico comune, dovuto alla
sostituzione di una C (citosina) in T (timina) al nucleotide 677 (C677T), che causa una sostituzione di una alanina in
valina nella proteina finale ed una riduzione dell'attività enzimatica della MTHFR pari a l 50% ,fino al 30% in
condizioni di esposizione al calore (variante termolabile).Tale variante comporta livelli elevati nel sangue di
omocisteina specie dopo carico orale di metionina. La frequenza genica in Europa della mutazione è del 3-3,7% che
comporta una condizione di eterozigosi in circa il 42-46% della popolazione e di omozigosi pari al 12-13% .
Recentemente, una seconda mutazione del gene MTHFR (A1298C) è stata associata ad una ridotta attività enzimatica
(circa il 60% singolarmente; circa il 40% se presente in associazione alla mutazione C677T). Questa mutazione, in
pazienti portatori della mutazione C677T, determina un'aumento dei livelli ematici di omocisteina.
Livelli aumentati di omocisteina nel sangue sono oggi considerati fattore di rischio per malattia vascolare,
(trombosi arteriosa) forse attraverso un meccanismo mediato dai gruppi sulfidrilici sulla parete endoteliale dei vasi.
Inoltre in condizioni di carenza alimentare di acido folico la variante termolabile della MTHFR porta a livelli molto
bassi l'acido folico nel plasma ed è pertanto un fattore di rischio per i difetti del tubo neurale nelle donne in gravidanza.
Condizioni di eterozigosi doppia, specie con la variante Leiden del fattore V comporta o della variante 20210 della
protrombina, può aumentare il rischio relativo per il tromboembolismo venoso, già alto per la presenza dell'altra
variante.Frosst et al. (1995) Nature Genet. 10: 111-113; Van der Put et al. (1998) Am. J. Hum. Genet.62: 1044-1051.
Metionina sintetasi gene (MTR): polimorfismo A2756G
Il gene MTR codifica per un enzima che è coinvolto nella conversione dell’omocisteina in metionina. Il polimorfismo
A2756G aumenta l’attività di questo enzima, incidendo sui livelli ematici di folato ed omocisteina Ridotti livelli di
omocisteina riducono il rischio di insorgenza di patologie cardiovascolari..
Mutazioni in MTR possono aumentare l’attività dei prodotti dei geni COMT e VDR Bsm/Taq,determinando un
aumentato fabbisogno di B12,poiché l’enzima ne utilizza molto.
E’ stato dimostrato che la presenza del polimorfismo A2756G determina una diminuzione delle probabilità di difetti
del tubo neurale durante la gravidanza ed un rischio diminuito di trombosi venosa.Leclerc (1966) Hum. Molec. Genet.
5: 1867-1874
Metionina sintetasi reduttasi (MS_MTRR): polimorfismo A66G
La Metionina sintetasi reduttasi è un enzima necessario per la formazione di un derivato della vitamina B12. Tale
enzima è indispensabile per mantenere un adeguata quantità di vitamina B12 cellulare, di metionina e di folato, e per
mantenere bassi i livelli di omocisteina.L’MTRR fa parte della grande famiglia di enzimi conosciuti come diflavin osidoreduttasi.L’attività del MTRR può quindi essere svolta da un altro enzima di questa famiglia il citocromo P-450reduttasi.gli enzimi di questa famiglia hanno struttura simile. in essi sono presenti l’MTRR, il P450reduttasi,l’emossigenasi ,l’ossido nitrico-sintetasi ,l’NR1-reduttasi.
L’indol-3-carbinol favorisce la formazione di citocromo ”“P-450-reduttasi.
Grazie a questa capacità di sostituire la funzione del MTRR,l’utilizzo di indil-3 carbinol può essere utile in caso di
mutazione MTRR.
L’acido alfa lipoico (ALA) può invece ridurre l’azione del citocromo ”“P450,reduttasi,quindi si deve considerare una
riduzione di ALA, per coloro che hanno una mutazione MTRR.
I geni MTR E MTRR ,lavorano insieme per rigenerare e utilizzare la vitamina B12,nel ciclo della metilazione,aiutando
a convertire l’omocisteina in metionina. Persone che presentano mutazioni di questi geni dovrebbero aumentare
l’utilizzo di vitamina B12
Il polimorfismo A66G è associato con un aumento del rischio di malattie cardiovascolari, indipendenti dai livelli di
omocisteina. E’ stato inoltre dimostrato che tale polimorfismo aumenti il rischio di difetti del tubo neurale, spina bifida
e sindrome di Down durante la gravidanza.
Brown (2000) J Cardiovasc Risk7, 197.
Recettore della Vitamina D (VDR): polimorfismi Fok1, e TaqI
I recettori della vitamina D sono polipeptidi intracellulari che interagiscono con i nuclei delle cellule target per
produrre una serie di effetti biologici. La Vitamina D promuove l’assorbimento intestinale e renale del calcio ed è
indispensabile per lo sviluppo ed il mantenimento della massa ossea. La vitamina D è anche coinvolta nei processi di
controllo della proliferazione e della differenziazione cellulare, nonchè nella immuno-modulazione. Nel sistema
immunitario, ad esempio, la vitamina D promuove la differenziazione dei monociti ed inibisce la proliferazione dei
linfociti attraverso l’increzione di citochine come IL-2 , l’IL12 e l’ interferon ”“γ. In alcuni tipi di cellule di carcinoma,
la vitamina D ha dimostrato un’attività antiproliferativa.
Gli effetti della Vitamina D sono mediati dal suo recettore nucleare (VDR); questo è strettamente correlato ai recettori
steroidei ma soprattutto a quelli degli ormoni tiroidei; È ormai ampiamente dimostrato inoltre un coinvolgimento
funzionale degli alleli del VDR nell’omeostasi del calcio e nella mineralizzazione dell’osso. Gli studi iniziali hanno
consentito di riscontrare l’interazione tra il gene del VDR, l’assorbimento di calcio e i livelli di calcio nella dieta. Le
variazioni alleliche del gene VDR spiegano per il 70% gli effetti genetici sulla densità ossea. Vengono qui presi in
considerazione tre polimorfismi (Fok1, Taq,I BsmI):
Il polimorfismo Fok1
Fok1(consiste in una sostituzione nucleotidica T-C a livello del codone di inizio della traduzione del gene VDR
(ATGACG). Tale polimorfismo determina la traslazione di tre aminoacidi dal sito d'inizio della traduzione del
gene con conseguente alterazione della relativa proteina, mancante di tre aminoacidi. Il nucleotide T viene anche
definito allele f, mentre il nucleotide C viene definito allele F. La combinazioni di questi alleli può produrre i genotipi
ff (TT), Ff (CT) e FF (CC). ) Mutazioni del Fok sono correlate al controllo della concentrazione dello zucchero nel
sangue,in caso di mutazione è consigliabile prestare attenzione a supportare il pancreas per mantenere i livelli di
zucchero nel sangue nella norma.
In letteratura sono noti alcuni lavori che correlano l’associazione del polimorfismo VDR Fok1 con il genotipo FF, con
il rischio di sviluppo del carcinoma del colon, in rapporto all’apporto di calcio e grasso nell’alimentazione. In
particolare, è stato evidenziato come, sebbene il calcio o il grasso alimentari non correlano normalmente con il rischio
di sviluppo di carcinoma del colon nei soggetti con genotipo FF, in quelli con genotipo a combinazione allelica
multipla ff/Ff, un diminuito apporto del calcio o del grasso nell’alimentazione aume nterebbe tale rischio. Per individui
con genotipo ff e dieta povera di grasso e calcio, il rischio di sviluppo del carcinoma del colon era di circa 2.5 volte
maggiore rispetto agli altri.Morrison et al. (1994) 367(6460):284-7.Arai (1997) J Bone Miner Res 12, 915.
Il polimorfismo TaqI
(localizzato nell’esone 9 del gene VDR, a livello del codone 352, consiste in una variazione nucleotidica T -C. . Il
nucleotide T viene anche definito allele T, mentre il nucleotide C viene definito allele t.
La combinazioni di questi alleli può produrre i genotipi TT (TT), Tt (TC) e tt (CC).)
Mutazioni del Taq possono influenzare i livelli di dopamina.
E’ importante per questa ragione guardare complessivamente allo stato del COMT e del Vdr/Taq e suggerire
integratori o supplementi nella dieta in base ai risultati dei due siti..
Il polimorfismo BsmI,
localizzato nell’introne 8 del gene VDR e consistente in una variazione nucleotidica A -G, è associato invece alla
variazione della stabilità del trascritto e ad una diminuzione dei valore della BMD. Il nucleotide A viene anche definito
allele B, mentre il nucleotide G viene definito allele b. La combinazioni di questi alleli puo produrre i genotipi BB
(AA), Bb (AG) e bb (GG). I valori di densità più elevati sono risultati a carico dell’allele b, mentre il meno frequente
allele B è risultato associato con valori di BMD inferiori. Quindi il genotipo BB predisporrebbe ad un basso livello di
massa ossea. Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato che il genotipo BB predispone ad un ridotto assorbimento di calcio
a livello intestinale.
COMT (Catecolo-O-metiltransferasi): polimorfismi V158M A72S H62H L136L
Il COMT è un importante mediatore del metabolismo delle catecolamine nonchè un modulatore dei pathway
adrenergici e dopaminergici compresi quelli coinvolti nella trasmissione del dolore.
La funzione primaria del gene COMT (Catecolo-O-metiltransferasi) è quella di favorire la degradazione della
dopamina, nonché quella delle epinefrine e norepinefrine modulando la risposta dei farmaci utilizzati nel trattamento
dell’ipertensione,dell’asma e nella terapia per il Parkinson. La dopamina aiuta a generare le sensazioni piacevoli che
rinforzano i comportamenti positivi e motivando la persona ad agire in determinati modi per ottenere ricompensa. Il
COMT è anche coinvolto nel metabolismo degli estrogeni. Recentemente la sensibilità al dolore è stata correlata
all’attività del COMT, gli individui omozigoti COMT++,possono essere più sensibili al dolore. Un frequente
polimorfismo di questo gene è il V158M, che contribuisce alla regolazione della funzionalità del recettore degli
oppioidi ; lo stesso è stato inoltre associato ad una diminuzione della funzionalità dell’enzima di tre -quattro volte
(Zubieta et al., 2003). E’ stato osservato che pazienti affetti da dolore cronico cons eguente a neoplasia con la variante
V158M, necessitavano di una dose inferiore di morfina rispetto ai pazienti “wild -type”• (Rakvag et al., 2005). Sembra
che la ridotta funzionalità enzimatica induca una ridotta degradazione della dopamina con conseguente deplezione
della encefalina. Per effetto compensatorio l’espressione del recettore degli oppioidi viene aumentata (Zubieta et al.,
2003)
MAO (Monoaminossidasi)-MAOA
Il gene MAOA , localizzato nel cromosoma X , metabolizza le amine tra cui la dopamina,la no repinefrina e in
particolar modo la serotonina, un neurotrasmettitore sintetizzato nei neuroni serotoninergici del sistema nervoso
centrale,e strettamente implicato nella fisiologia delle emozioni.
Il MAOA è stato associato in numerosi studi alla depressione,all’aggressività, all’ansia ed ai disturbi OCD ( ossessivocompulsivi ); ha un ruolo fondamentale nei disturbi da panico,in quanto nella cura vengono utilizzati efficacemente gli
inibitori della monoaminoossidasi .L'interesse verso questi polimorfismi è stato ulteriormente accresciuto dalla
dimostrazione che non tanto la loro espressione, quanto la combinazione tra essi e fattori ambientali si dimostrava
particolarmente significativa. Altri approcci basati sulla complementarietà suggeriscono un ruolo de l poliformismo
MAOA nella regione promoter, nei rischi della Sindrome di iperattività di disturbo di concentrazione (ADHD)
PMID.12140786.
E’ stato inoltre riscontrato un nuovo polimorfismo nel promotore del gene MAOA,associato ai disordini da panico in
due casi distinti:in Germania su 80 pazienti,e in Italia su 129 pazienti. Due alleli ( 3 e4 repeat) sono i più comuni e
costituiscono più del 97% degli alleli osservati.(Deckert et all 1999).
SHMT (Serinaidrossimetiltrasferasi) C1420T
Il gene SHMT interviene nel ciclo di metilazione durante il trasporto dei blocchi necessari per la sintesi di nuovo
DNA,e nel processo di sintesi dell’omocisteina. Mutazioni nell’SHMT possono così influenzare la capacità di regolare
i prodotti di questo gene e interferire con il delicato bilanciamento del ciclo di metilazione,causando accumulo di
omocisteina e di altre sostanze intermediarie nell’organismo.
L’ enzima SHMT contenente il fosfato piridossale,catalizza la conversione reversibile della serina e del teidrafolato a
glicina e a 5,10 metilentetraidrofolato. Alcune cellule eucariote,incluse le cellule umane,contengono entrambe le forme
di SHMT,,mitocondriale e citosolico,è stato ipotizzato che la sintesi della glicina a partire dalla serina avviene nei
mitocondri,mentre l’SHMT citosolico può catalizzare la conversione di glicina in serina.(Garrow et alt.1993)
Il metabolismo dei folati è un punto critico per la sintesi di numerosi costituenti cellulari richiesti per la crescita
cellulare e l’SHMT è un punto focale di questo processo.
E’stata dimostrata una associazione tra i polimorfismi dell’MTHFR C677T e dell’SHMT C1420T e il rischio di ESCC
o carcinoma squamoso esofageo e la sindrome GCA.
Fonte: laboratorio genoma Roma
