Recenti acquisizioni nel campo del miglioramento genetico della

Recenti acquisizioni nel campo del miglioramento genetico della qualità nutraceutica del
latte ovino.
Antonello Carta, Sara Casu, Sotero Salaris, Mario Graziano Usai, Stefania Sechi, Tiziana Sechi,
Sabrina Miari
Unità di Ricerca : Genetica e Biotecnologie AGRIS Sardegna.
Introduzione.
L’attività di miglioramento genetico delle specie di interesse zootecnico ha ottenuto nella seconda
metà del secolo scorso formidabili risultati in termini di incremento di potenziale produttivo in
particolare nei bovini e nei suini. Tali progressi sono stati realizzati nonostante la quota di
differenze tra gli animali dovute alla componente genetica fosse relativamente bassa per la
maggior parte dei caratteri produttivi. Ad esempio la porzione di variabilità genetica del latte è
quantificabile attorno al 10% se si considerano la totalità delle cause di variazione delle produzioni:
gestione, alimentazione etc. Il notevole incremento genetico per questo carattere è dovuto al fatto
che la genetica produce incrementi cumulativi nel tempo. Per tale ragione i limitati progressi
annuali diventano notevoli quando si accumulano nel tempo. L’approccio utilizzato è stato, ed è
tuttora per la maggior parte dei caratteri e delle specie, quello quantitativo classico. Esso postula
che i caratteri oggetto di selezione siano determinati per la loro componente genetica da un
numero infinito di geni, diffusi casualmente in tutto il genoma e con effetto additivo infinitesimale.
L’applicazione di tale modello genetico viene attualmente realizzata attraverso l’utilizzo di una
metodologia per la valutazione dei riproduttori detta BLUP - animal model che consente di ottenere
la miglior stima possibile del valore genetico additivo di un individuo attraverso la correzione del
fenotipo per gli effetti ambientali e la considerazione di tutte le covarianze genetiche additive
(derivate dalle parentele) tra animali. Dal punto di vista organizzativo l’applicazione di tale modello
implica la realizzazione dei controlli funzionali e delle attività di Libro Genealogico per la raccolta
delle informazioni necessarie:
i)
ii)
iii)
performance produttive individuali;
anagrafiche individuali;
altre informazioni utili per la stima degli effetti ambientali: allevamento, età, periodo di
parto etc.
Negli ovini in generale, ed in particolare in quelli da latte, l’applicazione degli strumenti suddetti ha
riscontrato maggiori difficoltà che in altre specie per ragioni legate al sistema di allevamento, a
particolarità anatomiche dell’ovino che rendono estremamente complicata la realizzazione
dell’inseminazione strumentale e al valore economico dei singoli animali che rende onerosa la
realizzazione dei controlli funzionali. In particolare, il prevalere di sistemi di allevamento estensivi
rende onerosa l’applicazione dei controlli funzionali anche quando vengono realizzati con
strumentazioni non particolarmente evolute. In ogni caso è infatti necessario che le aziende
abbiano un certo livello strutturale e organizzativo che consenta alle operazioni di controllo di
essere eseguite con la necessaria accuratezza e in tempi che, oltre a essere compatibili con
l’attività di allevamento, non ne compromettano la precisione. Tale problematica appare ancora più
evidente quando al controllo della quantità di latte si accompagna il prelievo per il controllo della
composizione chimica. In questo contesto, le possibilità offerte dalla genetica molecolare appaiono
particolarmente attraenti per un possibile rilancio del miglioramento genetico negli ovini anche in
considerazione del fatto che i recenti progressi tecnici e il continuo ridursi dei costi rendono
sempre più applicabili le tecnologie molecolari. Al contrario i costi di misurazione dei fenotipi che
sono sempre legati a un elevato impiego di manodopera aumentano e si rafforza contestualmente
la tendenza ad una riduzione del supporto pubblico per la realizzazione dei controlli funzionali.
Tali considerazioni appaiono ancora più evidenti se riferite ai caratteri di più recente interesse
selettivo quali quelli di resistenza alle malattie o legati alla qualità nutrizionale e igienico-sanitaria
del latte Tutti questi caratteri hanno in comune l’elevato costo di misurazione del fenotipo e dunque
una scarsa possibilità di essere migliorati con l’approccio selettivo classico, tanto più nella specie
ovina.
Tra le sostanze di efficacia nutraceutica del latte, il profilo acidico del grasso del latte è
sicuramente uno dei più investigati. La composizione in acid grassi (AG) del latte influenza le
proprietà tecnologiche ed il valore nutrizionale dei prodotti caseari. Il formaggio ovino è altamente
apprezzato per il suo gusto e aroma ma è comunemente considerato potenzialmente negativo per
la salute umana a causa del suo elevato contenuto in grasso. In generale, l’intero profilo in AG
dovrebbe essere considerato per i suoi effetti sulla salute umana. I dati dal latte di pecora
mostrano che il livello di AG saturi nel grasso del latte è abbastanza elevato (più del 60%) mentre i
livelli degli AG monoinsaturi e polinsaturi sono approssimativamente 28 e 6%, rispettivamente. Un
profilo di AG più favorevole alla salute umana dovrebbe presentare meno AG saturi e più AG
monoinsaturi e polinsaturi sebbene non tutti gli AG di una classe specifica abbiano lo stesso effetto
sulla salute umana. In questa condizione, al fine di soddisfare le nuove esigenze dei consumatori,
sarebbe interessante modificare la composizione in AG del latte ovino per migliorare il valore
dietetico e nutrizionale del formaggio senza influire negativamente sul tipico gusto ed aroma dei
prodotti. Recentemente, l’interesse maggiore è ricaduto sul contenuto in acido linoleico coniugato
(CLA) a causa dei suoi vari effetti benefici sulla salute umana. Con la generica definizione di CLA
si indicano tutti gli acidi octadecanoici (18:2) con un doppio legame coniugato. E’ noto che la
maggior parte del CLA nel latte ovino corrisponde al cis-9 trans-11 (il cui nome comune è acido
rumenico), che rappresenta più del 75% del CLA totale. Una porzione di CLA, formata nel rumine
attraverso una bioidrogenazione dell’acido linoleico, sfugge ad un’ulteriore bioidrogenzione e viene
assorbita nel tratto digestivo. L’entità di tale processo è minima mentre si accumula il composto
intermedio [trans 11-C18:1; acido vaccenico (VA)] della bioidrogenzaione del CLA. L’altra
importante fonte di VA nel rumine è la bioidrogenazione dell’acido linolenico (C18:3). Questo
processo non ha CLA come composto intermedio. Il VA prodotto nel rumine è desaturato a CLA
nei tessuti della ghiandola mammaria dall’enzima Stearoil-CoA desaturasi (SCD). Lo Stearoil-CoA
desaturasi può utilizzare differenti AG come substrato ed influenza la quantità di diversi AG
insaturi. In generale, è evidente che il CLA nel latte proviene essenzialmente dalla sintesi
mammaria attraverso l’azione del SCD sul VA di origine ruminale.
Con questa relazione ci si propone di valutare le possibilità di migliorare la composizione acidica
del grasso del latte ovino attraverso la genetica sia con l’approccio quantitativo classico che con le
nuove metodologie proposte dalla genetica molecolare. In particolare verranno riassunte le
sperimentazioni del gruppo di genetica animale di AGRIS Sardegna.
Approccio quantitativo.
Diversi studi mostrano ampie variazioni nel contenuto in CLA del grasso del latte e evidenziano
l’importanza della nutrizione nel modificare il profilo in AG sia nei bovini che negli ovini e caprini.
Inoltre, sono disponibili molte pubblicazioni sugli effetti di differenti essenze foraggere sul profilo in
AG nel latte ovino. Al contrario, fino ad ora esistono pochi lavori sul determinismo genetico di
questi caratteri. Questo è principalmente dovuto al fatto che la realizzazione di accurati studi
genetici comporta la misura di un elevato numero di fenotipi e, fino a poco tempo fa, la sola tecnica
disponibile era la costosa e laboriosa gas-cromatografia. Recentemente, utilizzando una tecnica
più semplice basata sulla spettrometria ad infrarossi si è dimostrato che esiste variazione genetica
sia entro che tra razze del profilo in AG del latte bovino. Il gruppo di genetica animale di AGRIS ha
stimato le quote di variabilità tra individui e tra famiglie di mezze sorelle paterne per i 17 AG più
importanti nonchè per alcune somme e rapporti in una popolazione Sarda x Lacaune. Il contenuto
in AG era stato determinato attraverso la gas-cromatografia su due campioni individuali raccolti
alla mungitura della mattina nel mezzo della seconda e terza lattazione. L’andamento generale
delle correlazioni grezze ha mostrato che il profilo in AG è un sistema molto complesso che risulta
da molte interrelazioni tra AG di base. Questi risultati suggeriscono che le strategie per migliorare
la composizione in AG devono considerare che la variazione in un AG implica variazioni correlate
di altre variabili, cosicchè l’intero profilo in AG può risultare modificato. Per quanto riguarda le
stime di ripetibilità, tutte le variabili analizzate hanno mostrato un’importante variabilità individuale
(14,1 – 57,3%). La componente della varianza associata al fattore casuale famiglia paterna variava
dal 3 al 23%. In particolare, le stime di ripetibilità di CLA e del rapporto tra CLA e VA sono state di
29,7 e 34,6%, rispettivamente. I corrispondenti componenti della varianza famiglia paterna sono
stati 8,3 e 5,6%. Questi risultati suggeriscono che una certa quantità di varianza genetica additiva
della maggior parte degli AG è disponibile per la selezione attraverso il classico approccio
quantitativo. Tuttavia, questo approccio richiede la raccolta su larga scala dei fenotipi a costi
ragionevoli. Al momento i costi per la raccolta dei campioni di latte e delle analisi gascromatografiche sono elevati. Tuttavia, la tecnica ad infrarossi utilizzata per la determinazione del
contenuto in AG nel latte bovino potrebbe essere una strategia promettente anche negli ovini da
latte.
Prospettive della genetica molecolare.
Il potenziale impatto della genetica molecolare può fondamentalmente realizzarsi sotto due punti di
vista. Da un lato, essa può consentire una maggiore efficacia degli schemi di selezione classici
incrementando l’accuratezza delle valutazioni genetiche o accorciando l’intervallo di generazione.
Dall’altro, molte aspettative sono riposte nella possibilità di ridurre la necessità di misure individuali
dei caratteri oggetto di selezione. Per quanto esposto in precedenza, questo secondo aspetto
risulta estremamente interessante per gli ovini da latte e per i caratteri legati alla qualità
nutrizionale del latte.
I due approcci attualmente più studiati sono la selezione assistita da marcatori o geni e la
selezione genomica. Nel primo caso si tratta di selezionare gli animali sulla base del genotipo in
posizioni del genoma vicine o direttamente in geni di interesse. Le selezioni assistita da marcatori
o da geni sono più o meno equivalenti con una maggiore efficacia della seconda che non implica
alcun rischio di ricombinazione tra alleli favorevoli e marcatori. Evidentemente in entrambi i casi il
vantaggio selettivo sarà direttamente proporzionale all’effetto del gene sul carattere e
all’importanza economica del carattere oggetto di interesse. Per contro i costi analitici non
dovrebbero essere estremamente elevati se si considera che si tratterebbe in ogni caso della
determinazione di pochi polimorfismi. Inoltre, in entrambi i casi vi è il vantaggio di considerare geni
di cui presumibilmente si conosce l’effetto sul carattere di interesse ed eventuali effetti pleiotropici
su altri caratteri consentendo di fatto di predire esattamente gli effetti della selezione sul valore
genetico globale della popolazione. L’applicazione di tali approcci è attualmente in atto nelle specie
bovina e suina sebbene limitatamente a pochi loci. Nella specie ovina la selezione per la
resistenza alla Scrapie è l’unica applicazione in atto.
L’approccio più comunemente utilizzato negli ovini per l’identificazione di geni o regioni
cromosomiche è stato fondamentalmente quello della creazione di popolazioni sperimentali ad
hoc. Per la realizzazione di tali esperimenti è necessario avere la disponibilità di marcatori
molecolari anonimi (microsatelliti, SNPs) localizzati in tutto genoma in quantità tale da costituire
una mappa di densità intermedia. Per la copertura del genoma ovino sono stati utilizzati panel di
circa 150 microsatelliti a una distanza media di 20 cM. Approcci di questo tipo consentono
normalmente una localizzazione imprecisa dei geni di interesse che non ne consente l’utilizzo
immediato in selezione. Usualmente si procede dunque saturando la mappa delle regioni
cromosomiche di interesse sino a 1-3 cM di intervallo tra marcatori per consentire una
localizzazione più precisa del gene. Con questo approccio è stato identificato il gene DGTA1 e la
mutazione responsabile di un effetto molto importante sul tenore in grasso nel bovino da latte.
Attualmente, la selezione per la mutazione favorevole viene realizzata per i bovini da latte in
parecchie nazioni.
AGRIS Sardegna ha creato una popolazione sperimentale sulla quale è stato applicato un
approccio di tipo genome scan con microsatelliti. Questa prima fase della sperimentazione ha
condotto all’identificazione di zone con effetti importanti ma non precisamente localizzate
Attualmente è in corso la fase di saturazione della mappa per alcuni delle regioni identificate.
In particolare sono stati identificate numerose regioni di interesse per la loro associazione con
differenti AG o combinazioni degli stessi. In particolare, per il contenuto in CLA è stata identificata
una regione nel cromosoma 22 nelle vicinanze del gene SCD. Il sequenziamento del gene ha
condotto alla identificazione di una variante fortemente positiva. Con lo stesso approccio si sta
attualmente studiando il gene FASN (Fatty Acid Synthase) che è localizzato in una regione
associata al contenuto in acido miristico e palmitico nel cromosoma 11 e codifica per un
complesso enzimatico multifunzionale che catalizza la sintesi de novo degli acidi grassi saturi nelle
cellule. L’attenzione è stata inizialmente concentrata sul dominio tioesterasi (TE), compreso nel
complesso enzimatico FASN. Il TE è responsabile del rilascio e della terminazione della sintesi
degli acidi grassi saturi neosintetizzati, e gioca quindi un ruolo essenziale nella determinazione
della lunghezza della catena degli acidi grassi di nuova sintesi. E’ localizzato in posizione 3’ del
FASN ed è codificato da quattro esoni. Attualmente sono stati sequenziati quasi completamente 3
dei 4 esoni del dominio catalitico e sono stati individuati 3 SNP di cui uno silente e due non
sinonimi. Parallelamente sono state sequenziate anche altre porzioni del gene, sia esoniche che
introniche e, in totale, sono stati identificati 7 SNP, 5 negli introni e 2 negli esoni (uno SNP silente e
uno SNP non sinonimo). E’ in corso il sequenziamento della parte restante del gene per
identificare nuovi polimorfismi e ottenere la sequenza completa del FASN ovino.
Nei prossimi anni le ricerche in atto saranno notevolmente accelerate dalla disponibilità di una
tecnologia molecolare che consentirà l’analisi di circa 54.000 posizioni genomiche
contemporaneamente. Il gruppo di genetica di AGRIS attraverso la partecipazione al progetto
europeo 3SR e il suo ruolo nel costituito Centro di Competenza della Biodiversità Animale ha la
disponibilità finanziaria per realizzare questa tipologia di analisi su i circa 3000 animali delle sue
popolazioni sperimentali. L’elevata precisione di questa metodologia lascia intravvedere la
possibilità nei prossimi anni di proporre per alcune delle sostanze di interesse nutraceutico del latte
ovino modelli di selezione analoghi a quelli attualmente in atto per la resistenza alla Scrapie. La
disponibilità di queste nuove applicazioni non deve tuttavia indurre a ritenere che gli schemi
attualmente in atto possano essere smantellati o in qualche misura ridimensionati. L’esperienza
della selezione per la resistenza alla Scrapie ha infatti dimostrato come la struttura selettiva
costruita per il miglioramento dei caratteri produttivi costituisca ancora il pilastro fondamentale per
l’applicazione delle nuove conoscenze genomiche.