DuoFLEX Cocktail
Anti-CD3
Anti-CD20cy
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Codice IK002
Uso previsto
Per uso diagnostico in vitro.
DuoFLEX Cocktail Polyclonal Rabbit Anti-Human CD3 e Monoclonal Mouse Anti-Human CD20cy Clone L26,
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) sono destinati per essere utilizzati nell’immunoistochimica congiuntamente a
strumenti Dako Autostainer/Autostainer Plus. L’anticorpo anti-CD3 umano policlonale di coniglio è utile per
l'identificazione dei linfociti T e delle neoplasie correlate (1,2). L’anticorpo Anti-Human CD20cy marca le cellule
dei linfociti di ceppo B ed è utile per l'identificazione di neoplasie di derivazione dei linfociti B (3). L’interpretazione
clinica di un’eventuale colorazione o della sua assenza deve essere integrata mediante studi morfologici
avvalendosi di controlli adeguati e deve essere valutata nell’ambito dell’anamnesi del paziente e di altri test
diagnostici da parte di un patologo qualificato.
Sinonimi per
l'antigene
CD3: T3, complesso CD3 (4). CD20:L26 (5).
Riepilogo
e spiegazioni
CD3
CD3 consiste in almeno quattro componenti diverse (γ,δ,ε,ζ) di 20-28 kDa. Sulla superficie del linfocita, CD3 è
associato in maniera non covalente con il ricettore del linfocita T (TCR). Si ritiene che i componenti CD3 del
complesso TCR/CD3 medino la trasduzione del segnale al riconoscimento dell’antigene da parte di TCR (6).
CD3 è espresso dai linfociti T in timo, midollo osseo, tessuto linfoide periferico e sangue (7,8). L’unico altro tipo di
cellula normale che si sappia essere marcato dagli anticorpi al CD3 è costituito dalle cellule di Purkinje nel
cervelletto (9). L’antigene CD3 può essere individuato inizialmente nei timociti precoci. La sua comparsa
probabilmente è uno dei primi segni di "commitment" al ceppo dei linfociti T (7). Nei timociti immaturi,
l’espressione del CD3 è solamente citoplasmatica, il CD3 associato alla membrana compare successivamente,
alla maturazione della cellula (7).
La maggior parte delle neoplasie dei linfociti T esprime l’antigene CD3, mentre esso è assente dalle neoplasie
non linfoidi dei linfociti T (10). Coerentemente con il pattern di sintesi dell’antigene nei timociti normali, il primo
sito ove CD3 è rilevabile nelle cellule neoplastiche è il citoplasma cellulare (7). CD3 è stato ritenuto marcatore
essenziale della valutazione iniziale dei disturbi linfoproliferativi cronici (11). La leucemia dei linfociti granulari
grandi del tipo dei linfociti T (T-LGL) è caratterizzata dal riarrangiamento CD3+/CD57+/CD56- immunofenotipo e
clonale dei geni recettori dei linfociti T (12).
CD20
CD20 è una proteina transmembrana non glicosilata espressa sui precursori dei linfociti B e nei linfociti B maturi,
ma si perde a seguito della differenziazione nelle plasmacellule (13). Nei linfociti B restanti, la proteina CD20
appare con una forma non fosforilata a 33 kDa. A seguito della stimolazione mitogena, la proteina CD20 subisce
una forte fosforilazione (isoforme 35-37 kDa) ed è una fosfoproteina dominante nei linfociti B attivi, nelle linee
cellulari B e nelle leucemie a cellule capellute (5). Le lunghe estremità del terminale N e C della proteina si
trovano sul lato citoplasmatico della membrana e solo una minima parte della proteina viene esposta sulla
superficie cellulare (13). Gli anticorpi che reagiscono con gli epitopi citoplasmatici CD20 sono denominati
CD20cy (5). Si è ipotizzato che la proteina CD20 sia direttamente responsabile della regolazione del flusso Ca2+
dei linfociti B conduttivi transmembrana che indica una possibile funzione della proteina CD20 come regolatore
della proliferazione e della differenziazione (13).
Fare riferimento alle General Instructions for Immunohistochemical Staining (Istruzioni generali per la colorazione
immunoistochimica) di Dako o alle istruzioni sul sistema di rivelazione per le procedure IHC per: 1) Principio della
procedura, 2) Materiali necessari ma non forniti, 3) Conservazione, 4) Preparazione dei campioni, 5) Procedura
di colorazione, 6) Controllo della qualità, 7) Risoluzione dei problemi, 8) Interpretazione della colorazione,
9) Limiti generali.
Reagente fornito
Il cocktail di anticorpo di coniglio policlonale e di topo monoclonale pronto per l’uso fornito in forma liquida in un
tampone contenente la proteina stabilizzante e 0,015 mol/L sodio azide.
Polyclonal Rabbit Anti-Human CD3
Monoclonal Mouse Anti-Human CD20cy, Clone L26, Isotipo: IgG2a, kappa
Immunogeno
CD3: Peptide sintetico comprendente gli aminoacidi 156-168 dalla parte citoplasmatica della catena CD3ε umana
accoppiata a tiroglobulina (1)
CD20: Linfociti B di tonsilla umana (14)
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Specificità
CD3:
Nei test Western blotting, l’anticorpo CD3 rileva bande del peso molecolare previsto per l’antigene CD3 (2).
L’anticorpo riconosce CD3ε sia in una linea di linfociti T (Jurkat) che in una linea di cellule natural killer (NK11),
ma non reagisce con i lisati preparati da varie linee di linfociti B (Raji, Ramos e JY), da una linea di cellule
mieloidi (U937) o da una linea di cellule del carcinoma del colon (Colo-205) (15).
Nell’immunoprecipitazione da lisati Nonidet P40 di linfoblasti T superficie-iodati, l’anticorpo precipita la catena
γ (26 kDa), δ (21 kDa) e ε (19 kDa) della molecola CD3, analogamente al pattern di precipitazione visto usando il
CD3 anti-umano monoclonale di topo ben caratterizzato, clone UCHT1 (1).
Nel test ELISA, l’anticorpo marca il peptide CD3 usato come immunogeno.
CD20:
L'anti-umano CD20cy, clone L26, è stato inserito in un cluster come anti-CD20 al Fifth International Workshop
and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (5° gruppo di lavoro e conferenza internazi onale
sugli antigeni di differenziazione dei leucociti umani) (5).
L'analisi SDS-PAGE degli immunoprecipitati che si formano tra i lisati delle cellule di tonsilla marcati con
l'anticorpo ha evidenziato una reazione primaria con i polipeptidi 30 kDa e 33 kDa (14).
125
Ie
Gli studi che utilizzano cellule COS-1 transfettate con cDNA che codifica la molecola CD20, indicano che
l'anticorpo marca un epitopo intracitoplasmatico localizzato nella molecola CD20 (16).
Precauzioni
1.
Per uso professionale.
2.
Questo prodotto contiene sodio azide (NaN3), una sostanza chimica fortemente tossica in forma pura.
Sebbene non sia classificato come prodotto rischioso, il contenuto di sodio azide alle concentrazioni indicate
può reagire con il rame e il piombo delle tubature formando azidi metalliche fortemente esplosive. Durante
lo smaltimento, sciacquare le tubature con abbondante acqua per prevenire l’eventuale accumulo di azide
metallica.
3.
Adottare le normali procedure previste per il trattamento dei prodotti di origine biologica.
4.
Indossare indumenti di protezione personale adeguati, per evitare il contatto con gli occhi e la pelle.
5.
Smaltire la soluzione inutilizzata nel rispetto delle disposizioni locali, regionali e nazionali in materia.
Conservazione
Conservare a 2–8 °C. Non utilizzare dopo la data di scadenza stampata sulla fiala. Se i reagenti sono conservati
in condizioni diverse da quelle specificate, le loro condizioni dovranno essere verificate dall'utente. Non sono stati
osservati segni evidenti che suggeriscano l'instabilità di questo prodotto, pertanto è opportuno analizzare un
controllo positivo e un controllo negativo insieme ai campioni dei pazienti. Qualora si ottenga una colorazione
imprevista, che non sia cioè giustificata da un cambiamento delle procedure di laboratorio ma sia dovuta ad un
probabile problema dell'anticorpo, contattare l'Assistenza Tecnica di Dako.
Specimen preparation
(Allestimento tessuto)
compresi i materiali
necessari ma non
forniti
Il cocktail di anticorpi può essere utilizzato per marcare sezioni di tessuto fissate in formalina, incluse in paraffina.
I campioni di tessuto devono essere tagliati in sezioni di approssimativamente 4 µm.
È necessario pretrattare con smascheramento termoindotto dell'epitopo (HIER, Heat-Induced Epitope Retrieval).
Si ottengono ottimi risultati pretrattando i tessuti con EnVisionTM FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
(codice K8004).
Sezioni deparaffinate: si consiglia il pretrattamento di sezioni di tessuto deparaffinate fissate in formalina, incluse
in paraffina, utilizzando Dako PT Link (Codice PT100/PT101). Per i dettagli, vedere la Guida Utente PT Link.
Attenersi alla procedura di pretrattamento delineata nel foglietto illustrativo di EnVisionTM FLEX Target Retrieval
Solution, High pH (50x) (Codice K8004). Per PT Link, bisogna attenersi ai seguenti parametri: Temperatura di
preriscaldamento: 65°C, temperatura e tempo di recu pero dell’epitopo: 97 °C per 20 (±1) minuti; lascia re
raffreddare a 65 °C. Rimuovere ogni rack per vetrin i Autostainer con i vetrini dal serbatoio PT Link e immergere
immediatamente i vetrini in un vaso/serbatoio (ad es., PT Link Rinse Station, Codice PT109) contenente
EnVisionTM FLEX Wash Buffer (20x) diluito, a temperatura ambiente (codice K8007). Lasciare i vetrini nel Wash
Buffer per 1-5 minuti.
Sezioni incluse in paraffina: per il montaggio dei vetrini coprioggetto si consiglia l’utilizzo di un mezzo acquoso (Dako
Faramount Codice S3025). come preparazione alternativa del campione, è possibile effettuare sia la
deparaffinazione che il recupero dell’epitopo in PT Link utilizzando una procedura modificata. Per le istruzioni, fare
riferimento alla Guida Utente PT Link. Una volta completata la procedura di colorazione, le sezioni devono essere
disidratate a 60 °C per un’ora, immerse in xilene e montate utilizzando un mezzo di montaggio permanente. Con il
montaggio permanente, evitare l’utilizzo di alcol, poiché potrebbe diminuire la reattività del Chromogen Red.
Prima del montaggio, evitare che le sezioni di tessuto si secchino durante il pretrattamento o nella successiva
fase di colorazione immunoistochimica. Affinché le sezioni di tessuto aderiscano perfettamente ai vetrini, si
consiglia di utilizzare Dako FLEX IHC Microscope Slides (codice K8020).
Procedura per la
colorazione
compresi i materiali
necessari ma non
forniti
Il sistema di visualizzazione consigliato è EnVision DuoFLEX Doublestain System, (Codice K6807). I cicli di
colorazione e i tempi di incubazione sono preimpostati nel software di Dako Autostainer/Autostainer Plus con i
seguenti protocolli:
Protocollo modello: DuoFLEX2 (200 µL volume da dispensare) o DuoFLEX3 (300 µL volume da dispensare)
Autoprogram: CD3CD20 (senza colorazione di contrasto) o CD3CD20H (con colorazione di contrasto)
Tutte le fasi di incubazione devono svolgersi a temperatura ambiente. Per dettagli, fare riferimento al manuale
dell'operatore relativo allo strumento dedicato. Se i protocolli non sono disponibili sullo strumento Dako
Autostainer utilizzato, rivolgersi all'Assistenza Tecnica Dako.
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Le condizioni ottimali possono variare a seconda del tipo di campione e del metodo di preparazione adottato,
pertanto dovranno essere definite autonomamente da ogni laboratorio. Se il patologo che effettua la valutazione
desidera una diversa intensità di colorazione, è possibile contattare un Esperto delle Applicazioni/Esperto dei
Servizi Tecnici di Dako per ricevere informazioni su come riprogrammare il protocollo. Verificare che l’esecuzione
del protocollo ritoccato sia ancora valida valutando che lo schema di colorazione sia identico allo schema di
colorazione descritto in “Caratteristiche prestazionali”.
Si consiglia la colorazione di contrasto in ematossilina utilizzando EnVision FLEX Hematoxylin (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) (codice K8018). Una volta completata la procedura di colorazione, le sezioni devono
essere asciugate all’aria, immerse in xilene e montate utilizzando un mezzo di montaggio permanente. Con il
montaggio permanente, evitare l’utilizzo di alcol, poiché potrebbe diminuire la reattività del Chromogen Red.
I controlli positivi e negativi devono essere analizzati contemporaneamente utilizzando lo stesso protocollo dei
campioni dei pazienti. Il tessuto di controllo positivo deve comprendere cellule di tonsille e le cellule/strutture
devono evidenziare gli schemi di reazione descritti per il tessuto in questione in “Caratteristiche prestazionali” in
tutti i campioni positivi.
Interpretazione dei
risultati della
colorazione
Caratteristiche
prestazionali
CD3: Le cellule marcate dall'anticorpo CD3 presentano una colorazione citoplasmatica rossa e/o della membrana.
CD20: I linfociti B marcati dall'anticorpo CD20 visualizzano una colorazione marrone del lato citotoplasmatico
della membrana superficiale della cellula.
Tessuti normali:
CD3:
l'anticorpo CD3 marca i linfociti T in vari tessuti, tra cui la tonsilla ed il colon. I linfociti T nelle zone interfollicolari
delle tonsille mostrano una reazione di colorazione da moderata a forte, mentre i linfociti T nei centri germinali
della tonsille e nell’epitelio del colon mostrano una reazione di colorazione rossa da debole a moderata.
CD20:
nel tessuto linfoide normale, l'anticorpo CD20 marca le cellule del centro germinativo, linfociti mantellari e linfociti
interfollicolari sparsi, ma non linfociti T, istiociti e plasmacellule (17,18). Non è visibile alcuna marcatura
dell'epidermide, delle ghiandole sebacee, dei follicoli piliferi e delle ghiandole eccrine nella cute, dell'epitelio
follicolare nella tiroide, dei pneumociti e dell'epitelio bronchiale del polmone e numerosi altri tessuti non linfoidi
normali testati (17). I linfociti B della zona mantellare e del centro germinativo nelle tonsille mostrano una
reazione alla colorazione da moderata a forte, mentre i linfociti B isolati nel fegato mostrano una reazione alla
colorazione marrone da debole a moderata.
Tessuti patologici:
CD3:
l’anticorpo ha marcato 73 casi su 96 di neoplasmi dei linfociti T, compresi 7 casi su 9 linfoblastici, 25 casi su 35
pleomorfici, 5 casi su 5 immunoblastici, 5 casi su 5 angioimmunoblastici del tipo linfadenopatia, 2 casi su 2 di
linfomi delle zone T, 19 casi su 19 di micosi fungoide/sindrome di Sézary, 2 casi su 3 di linfomi di Lennert, 4 casi
su 13 di linfomi anaplastici a cellule grandi positivi all’anticorpo Ki-1, 3 casi su 4 di papulosi linfomatoide, 1 caso
su 1 di linfoma celiaco-associato (1). L’anticorpo ha marcato 149 casi su 149 si leucemia/linfoma linfoblastico acuto
dei linfociti T (precursore) (ALL). In 131 casi su 149, il 100% delle cellule sono state positive, in 14 casi tra il 50% ed
il 90% delle cellule sono state positive, mentre in 4 casi meno del 50% delle cellule sono state positive. Non è stata
osservata marcatura in 68 casi su 68 di ALL dei linfociti B (precursori), eccetto i linfociti T reattivi infiltranti (2).
CD20:
L’antigene CD20 è stato marcato nella maggior parte dei 131 neoplasmi dei linfociti T analizzati (3). La marcatura
con l'anticorpo ha mostrato che nella differenziazione dei linfociti B, l'antigene CD20 non era espresso su cellule
linfoidi molto immature (0 su 6 leucemie acute non differenziate), ma iniziava ad essere espresso su stadi
precocemente maturativi (14 su 34 leucemie linfoblastiche acute comuni e 7 su 9 leucemie linfoblastiche acute
dei pre-linfociti B), e quindi, l'antigene CD20 era completamente espresso su linfociti B maturi (15 su 15 leucemie
croniche linfocitiche, 3 su 3 prolinfocitiche, 3 su 3 a cellule capellute, 6 su 7 linfosarcomi e 45 su 46 linfomi
maligni di linfociti B compresi i linfomi di Burkitt, Waldenström e dei linfociti B immunoblastici. L'antigene CD20
scompare sulle plasmacellule e solo 1 su 2 leucemie plasmacellulari e 0 su 12 mielomi sono stati marcati con
l'anticorpo (3). Altri studi hanno fornito risultati che mostrano una marcatura positiva di 44 su 44 linfomi a grandi
cellule e di linfociti B immunoblastici (17) e tutti i 40 linfomi dei linfociti B, ad eccezione delle comuni leucemie
linfoblastiche acute e dei linfomi plasmacellulari maligni. Nel morbo di Hodgkin, è stata osservata una forte
colorazione superficiale della membrana delle cellule di Reed-Sternberg in 9 casi su 27 (18). 0 su 73 casi di
malattie linfoproliferative del ceppo dei linfociti T sono stati marcati dall'anticorpo (3), mentre altri studi hanno
mostrato 1 su 18 (18) e 1 su 111 (19) casi positivi. Sono stati documentati casi rari di linfomi dei linfociti T
periferici positivi all'antigene CD20 (18, 19).
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Edizione 03/09
(119822-001)
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