Colture Cellulari
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PRINCIPI PRATICI ED ESEMPI DI COLTURE CELLULARI Dott.ssa Valeria Berton Università di Verona Applicazioni delle colture cellulari Studi di biologia e biochimica Studi di interazione tra organismi patogeni e cellule Studi degli effetti di farmaci sulle cellule Studiare processi cellulari Studi di tossicologia Ricerca sui tumori Colture Colture d’organo: L’organo (o parte di esso) viene asportato, conservando l’architettura. Usate principalmente per studi di fisiologia e sviluppo. Colture di rene di ratto E13,5 (Martovetsky et al. 2013) Colture tissutali: o colture organotipiche. Fettine di tessuto vengono isolate dall’organo intero. Spessore minore rispetto alle colture d’organo; mantenuti solo gli aspetti principali dell’architettura del tessuto. Colture di ippocampo di ratto P7 (Armentano et al. 2010; Guy et al. 2011) Colture cellulari: l’architettura del tessuto (o dell’organo) viene distrutta, fino ad arrivare alla sospensione di singole cellule. Colture cellulari Cellule isolate dal tessuto d’origine e mantenute in vita in un ambiente definito Vantaggi e Svantaggi Vantaggi Svantaggi Sistemi semplici e riproducibili Stretto controllo sulle condizioni ambientali Sistema semplificato rispetto all’intero organismo Difficile correlazione tra le condizioni di coltura e le condizioni in vivo Possibili interazioni tra la molecola di studio e le condizioni di coltura Costi comunque abbastanza elevati Expertise Necessitano comunque di prelievo da animale o paziente Consentono analisi a livello molecolare Disponibilità di diversi tipi cellulari e reagenti per colture Relativamente economiche Ridotti problemi etici Tipi di colture Colture primarie: derivate dall’isolamento di uno o più tipi cellulari da un campione di tessuto o organo Colture secondarie: derivate dalla propagazione di colture primarie neuroni cellule endoteliali cellule cervice uterina Tipi di colture Linee cellulari continue: derivate cellule tumorali o ottenute da trasformazione (spontanea o indotta) di colture primarie Sono linee clonali Colture clonali: colture derivate da una singola cellula (clone) Colture cellulari: limite di Hayflick Cellule isolate da un tessuto e seminate in coltura Log n cellule Coltura primaria Cellule della coltura primaria rimosse e seminate ad una minore densità Coltura secondaria Proliferazione Cellule trasformate Immortalizzate Cellule derivate da tumori o trasformate (trasformazione spontanea o con agenti chimici o biologici) Acquisiscono la capacità di proliferare indefinitamente Cellule non trasformate Tempo Primo passaggio Secondo passaggio Colture cellulari primarie Colture primarie: colture cellulari derivate dalla dissociazione di un tessuto o un organo o isolate da fluidi biologici Dissociazione: meccanica enzimatica (tripsina, collagenasi, EDTA) Distrugge la matrice cellulare che tiene unite le cellule; si ottiene una sospensione di materiale extracellulare e cellule. Isolamento: Delle cellule dal materiale extracellulare (filtrazione) Del tipo cellulare di interesse dalla popolazione mista di cellule; si sfruttano le proprietà fisiche (dimensioni), le capacità di adesione a substrati specifici, specificità di legame con anticorpi, terreni di coltura selettivi Linee continue Linee continue: cellule tumorali o cellule non tumorali trasformate Dette anche linee cellulari immortalizzate Il programma genetico della senescenza è stato annullato: Mutazioni spontanee: cellule derivate da tumori o trasformazione in coltura di cellule da colture secondarie Trasformazione indotta: cellule da colture primarie immortalizzate tramite manipolazione genetica Agenti fisici (radiazioni o mutageni chimici) Virus codificanti porzioni di genoma modificate Colture primarie vs. immortalizzate Colture primarie Limitato numero di cicli cellulari Mantengono con maggiore probabilità le caratteristiche delle cellule in vivo Continui prelievi da animali/pazienti Colture immortalizzate Proliferazione rapida e continua dipendente solo dalla presenza di metaboliti Possono acquisire caratteristiche diverse dalle cellule in vivo (morfologia, fisiologia e corredo cromosomico) Disponibili commercialmente Coltura più semplice (minori esigenze trofiche, ridotta inibizione da contatto) Variabilità ridotta Condizioni di coltura più delicate Maggiore variabilità (isolate da soggetti diversi) Tipi di colture cellulari Aderenti: Cellule che fanno parte di tessuti solidi (es. cellule nervose, epiteliali, fibroblasti) Crescono aderendo alla superficie di coltura Spesso richiedono l’interazione tra recettori di adesione di membrana e proteine adesive adsorbite sulla superficie di coltura (es. fibronectina, lamimina, poly-L-lisina, matrigel) L’adesione è necessaria per la proliferazione Inibizione da contatto della proliferazione In sospensione: Cellule che crescono normalmente in mezzo fluido (es. cellule ematopoietiche) Crescono in sospensione, senza aderire alla superficie di coltura Esaurimento dei fattori di crescita Condizioni necessarie alla coltura cellulare Adeguato apporto di sostanze nutritive • zuccheri • amminoacidi • ormoni • vitamine • ioni • fattori di crescita Controllo e mantenimento di condizioni chimico-fisiche ottimali • sterilità • pH • concentrazione di anidride carbonica e ossigeno • temperatura • umidità • substrato Terreni di coltura Contengono i nutrienti essenziali al mantenimento e alla crescita delle cellule in coltura Cellule diverse hanno requisiti nutrizionali diversi diversi terreni di coltura Esempio: componenti Neurobasal medium (Gibco) Amminoacidi Vitamine Sali inorganici Glycine L-Alanine L-Arginine hydrochloride L-Asparagine-H2O L-Cysteine L-Histidine hydrochloride-H2O L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine hydrochloride L-Methionine L-Phenylalanine L-Proline L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine L-Valine Choline chloride Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) D-Calcium pantothenate Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) Folic Acid Magnesium Chloride (anhydrous) Niacinamide Potassium Chloride (KCl) Pyridoxine hydrochloride Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Riboflavin Sodium Chloride (NaCl) Thiamine hydrochloride Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) Vitamin B12 Zinc sulfate (ZnSO4-7H2O) i-Inositol Altri componenti D-Glucose (Dextrose) HEPES Phenol Red Sodium Pyruvate Terreno in uso In generale, al terreno di coltura vengono aggiunti: Supplementi o siero Glutammina Antibiotici Il terreno così composto può essere conservato a 4°C per un mese e mezzo al massimo (meglio un mese) Il terreno di coltura deve essere riscaldato a 37°C prima di essere messo in contatto con le cellule. Non riscaldare l’intero contenitore di terreno, solo la quantità necessaria Eventuali fattori di crescita (per stimolare la proliferazione o il differenziamento) vanno addizionati al terreno già riscaldato appena prima dell’uso, in quanto si degradano velocemente a 37°C Contaminazione Ambientale: Stanze per colture cellulari a norma Pulizia delle superfici Non portare materiale fuori dalla stanza colture Operatore: Le colture cellulari possono essere contaminate (virus) o trasformarsi durante l’uso Procedure e tecniche che riducono il rischio per l’operatore (cappe a flusso laminare, dispositivi di protezione individuale) Le colture cellulari di derivazione umana devono sempre essere considerate pericolose Colture: Più frequenti da lieviti, funghi e micoplasmi; possono uccidere le colture (lieviti, funghi e batteri) o alterare le caratteristiche delle cellule (micoplasmi) E’ necessario lavorare in condizioni di sterilità Contaminazione della coltura Terreno di coltura tendente al giallo e torbido Batteri Funghi Lieviti Virus Micoplasmi Hoechst: attraversa le membrana cellulare e si lega al DNA Sterilità Assenza di microrganismi inquinanti (batteri, funghi, micoplasmi, virus) Trattamento dei materiali con autoclavi e stufe Irraggiamento (UV) delle superfici Ultrafiltrazione dei liquidi (membrane con pori Ø 0,4 – 0,2 µm) Disinfettanti (prima di introdurre materiale sotto la cappa sterile) Addizione di antibiotici nei terreni (preventiva) Manipolazione in atmosfera sterile (cappe a flusso laminare) Incubatori Norme di comportamento in stanza delle colture uso dei dispositivi di protezione individuale; divieto di mangiare o bere all’interno della stanza; non parlare mentre si lavora sotto la cappa sterile; pulire la cappa prima e dopo l’utilizzo; controllo periodico dei filtri della cappa; uso di materiali monouso sterili, ad esempio pipette, fiasche e piastre petri etc, pH pH fisiologico: 6.8 – 7.8 (dipende dall’origine della coltura cellulare) Ma il terreno di coltura tende ad acidificarsi a causa dei prodotti del metabolismo cellulare Nei terreni di coltura si trovano: Sistemi tampone (comunemente bicarbonato di sodio) Rosso fenolo (indicatore di pH) Giallo = pH acido Rosso-arancio = pH neutro Viola = ph basico Se il terreno di coltura tende al viola, non deve essere usato! Concentrazione CO2 e O2 Incubatori mantengono costante CO2 pCO2 (pressione parziale CO2) solitamente 5% Corrisponde alla pressione parziale di CO2 media nei tessuti (4.6% - 5.9%) Contrasta l’acidificazione del terreno dovuta al metabolismo cellulare La pCO2 ottimale per la coltura cellulare dipende dal tipo di cellule coltivate Nell’incubatore: 5% CO2 e 95% aria Se all’interno dell’incubatore, il terreno di coltura tende al giallo, significa che il metabolismo cellulare (proliferazione) sta acidificando il terreno Se invece il terreno tende al viola, la regolazione della pCO2 dell’incubatore non è ben calibrata o le cellule stanno morendo Temperatura Il mantenimento della temperatura ottimale è garantito dagli incubatori termostatati La temperatura ottimale dipende dal tipo di cellule in coltura Generalmente è 37°C, ma può essere inferiore In generale, le cellule possono sopravvivere a lievi ipotermie rispetto alla temperatura ottimale, ma lievi ipertermie portano a morte o alterazioni Umidità Il mantenimento di un corretto grado di umidità impedisce al terreno di coltura di evaporare (la temperatura all’interno di un incubatore è superiore ai 30°C) Il fondo degli incubatori termostatati viene riempito di acqua (sterile) Il livello dell’acqua deve essere monitorato costantemente Supporto di coltura La plastica per coltura è generalmente in polistirene, trasparente al microscopio. Viene trattata per essere sterile e atossica nei confronti delle cellule. La superficie è idrofila e carica negativamente, in modo da favorire il legame dei fattori di adesione presenti nel siero o aggiunte dall’operatore in un secondo momento, Nel caso di colture cellulari in sospensione è necessario usare plastica trattata appositamente allo scopo di inibire l’adesione delle cellule alla superficie. I supporti di coltura maggiormente usati sono le piastre multiwell, le piastre Petri e le fiasche Substrato Tipi diversi di cellule richiedono la presenza (o l’assenza) di un substrato proteico che favorisca l’adesione delle cellule stesse alla superficie Esempi: cellule endoteliali e cellule neuronali richiedono un substrato più comuni: laminina, fibronectina, collagene, poli-L-lisina, gelatina, Matrigel (mix di proteine) cellule ematopoietiche (linfociti), alcuni tipi di cellule staminali vengono coltivate in sospensione Vitalità Una densità di cellule in coltura troppo alta provoca sofferenza, e spesso alterazioni, delle cellule Cellule in adesione crescono fino ad occupare l’intera superficie a disposizione: sono confluenti. Regola generale: non superare l’80% della confluenza Cellule in sospensione, non aderendo alla superficie di coltura, non offrono un segnale così chiaro del raggiungimento della densità massima E’ necessario contare le cellule Conta delle cellule Camera di Burker Contare le cellule vitali nei 4 quadranti Il numero di cellule/ml è: Numero di cellule contate x Fattore di diluizione x 104 4 Coloranti vitali Trypan Blue: internalizzato solo dalle cellule morte, che quindi diventano blu opaco; le cellule vive sono bianche e “luminose” (rifrangono la luce emessa dal microscopio) Un’aliquota di sospensione cellulare viene mescolata con Trypan Blue al rapporto desiderato (1:10, 1:2, a seconda della densità delle cellule in coltura) e lasciata riposare a T. amb. per 5-10 minuti. Coloranti vitali Ioduro di Propidio: intercalante del DNA, diventa fluorescente solo quando va ad inserirsi tra I filamenti di DNA. Le cellule sane non sono permeabili al PI diventano fluorescenti solo le cellule non vitali Coloranti vitali Diacetil fluoresceina: tutte le cellule incorporano la forma esterificata (non fluorescente), ma solo le cellule vitali sono in grado di produrre la forma idrolizzata fluorescente (verde). Le cellule non vitali possono essere evidenziate con PI (rosse) Applicazioni delle colture cellulari: studio di farmaci Farmaco Cambiamenti (RNA, proteine, studi funzionali) Vitalità Applicazioni delle colture cellulari: organi su chip Applicazioni delle colture cellulari: polmoni su chip http://www.elveflow.com/microfluidictutorials/cell-biology-imaging-reviews-andtutorials/microfluidic-for-cell-biology/a-reviewabout-organs-on-chip/ Huh, D. et al., Reconstituting organ-level lung functions on a chip, Science, 2010 Applicazioni delle colture cellulari: fegato su chip https://ncats.nih.gov/tissuechip/chip/liver https://ncats.nih.gov/tissuechip/chip/liver Applicazioni delle colture cellulari: uomo su chip http://youngzine.org/news/technology/organs-chip Oligodendrociti Gli oligodendrociti sono cellule formanti mielina, la quale ricopre gli assoni migliorando efficienza e velocità di trasmissione dei potenziali d’azione. La guaina mielinica ha il principale compito di isolare gli assoni, è ricca di lipidi che le conferiscono caratteristiche di isolante ed è costituita da particolari proteine che la caratterizzano. Danno agli oligodendrociti Demielinizzazione da parte degli oligodendrociti perdita della funzionalità degli assoni Danno agli oligodendrociti oligodendrocytes from meningeal stem cells can be used regenerative medicine Oligodendrociti dalle meningi 1st: obtain stem cells from meninges Isolation of meninges In vitro culture Oligodendrociti dalle meningi 2nd: obtain oligodendrocytes from meningeal cells Oligodendrocytes from meningeal stem cells Cells in culture Add PDGF and T3 Oligodendrociti dalle meningi: protocollo NS: A small spinal cord meningeal biopsy is isolated and cultured in neurosphere expansion medium OliGo1 : Neurosphere dissociation and culture in oligodendrocyte induction medium in floating conditions OliGo2 : Oligosphere dissociation and cell culture in oligodendrocyte differentiation medium in adherent condition OliGo3 : Final differentiation with oligodendrocyte maturation medium Oligodendrociti dalle meningi: protocollo Oligodendrociti dalle meningi: davvero? Nestin, Vimentin and other stemness and neural progenitor markers are expressed at low levels by the end of the protocol Neural Progenitor-related genes Relative Gene Expression Expression of stemness-related genes Nanog, Oct4, Sox2 and Pax6 was detected only at very low levels at every step of the protocol NS OliGo1 OliGo2 OliGo3 Vimentin Nestin One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *p<0.05 n=5 Diffused Nestin protein expression Cellular morphology increased in complexity Oligodendrociti dalle meningi: davvero? Pre-oligodendrocyte and immature oligodendrocyte markers are expressed in the intermediate stages of the differentiation protocol Oligodendrocyte Progenitors Relative Gene Expression NS OliGo1 OliGo2 OliGo3 Olig1 Olig2 Nkx2.2 Cspg4 One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *p<0.05 n=5 NS OliGo1 NG2 TOPRO3 OliGo2 OliGo3 Maximal expression of O4 at the OliGo2 stage confirmed progression to immature oligodendrocytes NG2 maximal expression was observed at the OliGo1 stage. Scale bar: 50 um Oligodendrociti dalle meningi: davvero? Expression of myelin-specific genes: 1- high increase by the end of the protocol Mature Oligodendrocyte - High Increase Relative Gene Expression NS OliGo1 OliGo2 OliGo3 Mag Mbp Mog Plp1 One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *p<0.05; **p<0.01 n=5 MBP immunofluorescence to show oligodendrocyte morphological changes Oligodendrociti dalle meningi: davvero? Expression of myelin-specific genes: 2- Cnp increases by the end of the protocol Mature Oligodendrocyte - Low Increase NS Relative Gene Expression OliGo1 OliGo2 OliGo3 Cnp, Mag, Mbp, Mog and Plp1 are considered the signature of mature oligodendrocytes in vivo and in vitro GalC Sox10 CaII Cnp One-way ANOVA and Bonferroni post-test. *p<0.05; **p<0.01 n=5 GalC protein expression: growing morphological complexity Oligodendrociti dalle meningi: davvero? Under our culture conditions, LeSCs do not differentiate into neurons or astrocytes Neurons Relative Gene Expression NS OliGo1 OliGo2 OliGo3 Dcx Tub3 Syt1 One-way ANOVA and Bonferroni post-test. n=5 Gene expression of the mature marker Mtap2 and the astrocytic markers Gfap and Aqp4 were detectable only at low levels Immunofluorescence analysis detected rare expression of the neuronal markers Tuj1 and MAP2, while the astrocytic marker GFAP was never observed Cellule Nestina+ nelle corteccia di ratto Immunofluorescenza su campioni di cervello di ratto in diverse fasi dello sviluppo Nestina: filamento intermedio tipico delle cellule progenitrici neurali SVZ: nicchia riconosciuta di cellule staminali/progenitrici neurali Isolamento delle cellule da tessuto Cervello di ratto Sprague-Dawley al 15° giorno dopo la nascita (P15) Prelievo delle leptomeningi Dissociazione delle meningi: Enzimatica: Collagenasi (10 minuti 37°C) Tripsina e DNAsi (5 minuti 37°C) Meccanica: pipetta 10ml pipetta 5ml pasteur di vetro Azione degli enzimi bloccata dall’aggiunta di terreno contenente siero Centrifugazione Filtrazione (per eliminare i frammenti di tessuto rimasti) Caratterizzazione delle cellule FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting Cellule in sospensione in PBS Incubazione con anticorpo anti-Nestina coniugato con un fluoroforo Valutazione della percentuale di cellule Nestina+ nella popolazione cellulare Neurosfere: Aggregati cellulari sferici derivati dalla proliferazione di singole cellule in colture in sospensione La capacità di formare neurosfere è una delle caratteristiche principali delle cellule staminali/progenitrici neurali Le cellule isolate dalle meningi sono state coltivate nel terreno di coltura solitamente usato per indurre la generazione di neurosfere da cellule dell’SVZ Le cellule isolate dalle leptomeningi formano neurosfere Neurobasal Glutammina Pen/Strep B27 N2 bFGF EGF Colony-Forming Unit Colony-Forming Unit (CFU): Cellula in grado di dare generare una colonia di cellule derivate dalla replicazione della cellula di origine Molte cellule dell’organismo sono in grado di proliferare in vitro, ma solo per un numero limitato di volte (piccole colonie). Le cellule staminali/progenitrici sono invece in grado di formare colonie molto numerose. Una coltura di cellule staminali/progenitrici comprende un alto numero di CFU Importante: • Una coltura di cellule staminali/progenitrici mantiene un alto numero di CFU anche dopo diversi passaggi • Se le cellule sono staminali/progenitrici, una cellula isolata da una colonia forma a sua volta una colonia Analisi dell’immunofenotipo della coltura La coltura in vitro può modificare le proprietà delle cellule stesse. L’analisi con FACS consente di verificare il livello di espressione di un marker di interesse Nestin MAP2 GFAP CD106 CD31 CD34 CD45 CD90 CD106: marker cellule staminali mesenchimali CD31: marker cellule endoteliali CD34: marker cellule staminali ematopoietiche CD45: marker leucociti CD90: marker non specifico cellule staminali marker isotype control Analisi dell’espressione proteica Le neurosfere sono formate da una popolazione cellulare eterogenea, composta da cellule staminali/progenitrici (nel core della neurosfera) e cellule in via di differenziamento negli strati più superficiali. Nestina: marker cellule staminali/progenitrici MAP2: Microtubule-Associated Protein 2 marker neuronale GFAP: marker astrociti Differenziamento in vitro Coltura in terreno di differenziamento in senso neuronale Diminuisce l’espressione di Nestina Aumenta l’espressione di MAP2 Immunofluorescenza per studiare la morfologia delle cellule MAP2+ BrdU: analogo della Timidina viene incorporata dalle cellule in replicazione, sostituendosi alla Timidina Le cellule MAP2+ derivano da cellule proliferanti nella coltura, non sono neuroni pre-esistenti Spine dendritiche, tipiche dei neuroni Analisi dell’espressione genica RT-PCR: Reverse Transcriptase PCR Consente di retrotrascrivere cDNA a partire dall’RNA In questo modo si può valutare l’espressione dei geni effettivamente espressi dalla cellula Si preleva una quantità di cellule (minimo 105) dalla popolazione in coltura Le cellule vengono sospese in TRIzol (soluzione chimica che favorisce la rottura delle membrane e delle componenti cellulari mantenendo al contempo l’integrità degli acidi nucleici) Conservate a -80°C Misurata la quantità di RNA contenuta nei campioni PCR e quantificazione (relativa) Time course in coltura aderente Osservazione delle colonie derivate da cellule delle meningi a diversi time-points: Nelle prime fasi della coltura sono visibili cellule Nestina+ e qualche cellula NG2+ Durante le diverse fasi, le cellule Nestina+ continuano a proliferare formando colonie omogenee. Non ci sono cellule NG2+ o GFAP+ Anche in condizioni di aderenza, le cellule isolate dalle leptomeningi mantengono la capacità proliferativa e l’espressione di Nestina Differenziamento in vitro Sinaptofisina: proteina pre-sinaptica GAD67: enzima coinvolto nel metabolismo del glutammato; marker neuroni GABAergici GluR2: recettore per il glutammato il recettore più comune nel CNS Differenziamento in vitro Calcium Imaging: misurazione dei livelli cellulari di ioni Calcio tramite uso di indicatori Gli ioni Calcio fungono da segnali intracellulari in tutti i tipi cellulari. Nei neuroni regolano l’esocitosi dei neurotrasmettitori, la plasticità sinaptica e la trascrizione genica. Fura-2: indicatore fluorescente; eccitato a 350/380 nm emette fluorescenza proporzionale al livello di ioni Calcio. Consente valutazione quantitativa. La depolarizzazione (KCl) attiva i canali del Calcio voltaggio-dipendenti che si aprono e fanno entrare ioni Calcio. I neuroni derivati dalle cellule delle leptomeningi mostrano livelli di Calcio simili a quelli misurati da colture primarie di neuroni Possono essere differenziate in neuroni funzionali Potenziale differenziativo in vivo Riconoscimento delle cellule trapiantate Espressione di EGFP Cellule isolate dalle leptomeningi di ratti transgenici EGFP Trapiantate nell’ippocampo di ratti adulti McCaffery P, Zhang J, Crandall JE J Neurobiol. 2006 Cheung and Cardinal BMC Neuroscience 2005 Potenziale differenziativo in vivo 4 settimane Analizzate tramite immunofluorescenza Doppia immunofluorescenza: anticorpo anti-EGFP (verde) e anticorpo anti-GFAP, -MAP2 o -NG2 (rosso) Cellule EGFP+ nella zona di iniezione Astrociti (GFAP) circondano le cellule EGFP+ nella zona dell’iniezione Real time PCR: espressione di EGFP solo nei ratti trapiantati Potenziale differenziativo in vivo 4 settimane Molte cellule EGFP+ sono anche Nestina+ Rare cellule EGFP+/GFAP+ Rare cellule EGFP+/NG2+ Potenziale differenziativo in vivo 8 settimane La maggior parte delle cellule EGFP+ (49,8%) sono MAP2+ La maggior parte delle cellule EGFP+/MAP2+ si trovano nella regione CA1 dell’ippocampo Alcune cellule EGFP+ mostrano morfologia complessa e simile a quella dei neuroni piramidali dell’ippocampo Neuronal Dynamics Laboratory University of Utah Potenziale differenziativo in vivo 8 settimane Cellule EGFP+/MAP2+ nello strato piramidale e nello stratum oriens dell’ippocampo Alcune cellule EGFP+/MAP2+ sono migrate nella sub-granular zone (SGZ) del giro dentato Conclusioni Le cellule isolate dalle leptomeningi sono Nestina+ e possono essere coltivate in vitro sottoforma di neurosfere Le cellule delle leptomeningi (in colture aderenti e di neurosfere) esprimono alti livelli di geni correlati alla staminalità Le cellule possono proliferare in coltura per diversi mesi e possono essere indotte a differenziare con alta efficienza in cellule della linea neuronale Una volta trapiantate nell’ippocampo del ratto adulto, le cellule delle leptomeningi si integrano nel tessuto e acquisiscono caratteristiche simili a quelle dei neuroni maturi (espressione di MAP2 e morfologia) Presenti nell’adulto Proliferazione in vitro Differenziamento in neuroni in vitro e in vivo Leptomeningeal Stem/progenitor Cells (LeSCs)
