La reazione a catena della polimerasi (PCR)

SCHEDA
2.2
La reazione a catena della polimerasi (PCR)
In che modo gli investigatori della serie televisiva CSI possono risalire all’identità dell’assassino da una microscopica traccia di
sangue o di altro liquido biologico? Una domanda come questa ha una risposta ben
precisa. Kary Mullis, un brillante studioso,
è stato insignito del premio Nobel nel 1993
per aver messo a punto la metodica nota
come reazione a catena della polimerasi
(PCR), che ha rivoluzionato il mondo della
genetica molecolare. Se è nota la sequenza
anche di una piccolissima parte di un segmento di DNA, è possibile ottenerne l’amplificazione fino a milioni di volte grazie
alla PCR.
Kary Mullis
La PCR richiede la sintesi chimica di due
brevi oligonucleotidi, ognuno dei quali è
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Stefani-Taddei Percorsi di biochimica © Zanichelli 2011
complementare a una breve sequenza di
uno dei due filamenti della doppia elica in
cui è presente il segmento di DNA che deve
essere amplificato. Gli oligonucleotidi servono per iniziare la sintesi in vitro del DNA
catalizzata dall’enzima DNA polimerasi e
costituiranno le estremità 5⬘ dei due segmenti di DNA complementari che si otterranno alla fine del processo.
L’enorme potere di amplificazione della metodica risiede nella duplicazione, a
ogni ciclo, dei frammenti ottenuti dal ciclo
precedente. Ogni ciclo di reazione comporta
un breve riscaldamento del materiale per
ottenere la separazione dei due filamenti
del DNA. Il successivo raffreddamento permette l’unione dei due oligonucleotidi, aggiunti in forte eccesso, ai filamenti contenenti il segmento di DNA che interessa. L’incubazione della miscela con la DNA polimerasi e i quattro desossiribonucleosidi trifosfati determina la sintesi delle regioni di
DNA a valle degli oligonucleotidi iniziatori
(figura a pagina seguente). Un’efficace amplificazione richiede da 20 a 30 cicli replicativi, ognuno della durata di circa 5 minuti. L’automatizzazione del processo consente di effettuare l’amplificazione di un
segmento di DNA in poche ore.
La PCR è estremamente sensibile e può
rivelare la presenza di una sola molecola di
DNA in un intero campione. È dunque così
che gli indizi impercettibili di CSI diventano rivelatori e consentono di ottenere un
quadro preciso della situazione. Per la sua
specificità, sensibilità, riproducibilità e rapidità, la PCR trova attualmente largo impiego in vari campi, dalla diagnosi prenatale di malattie genetiche alla rivelazione di
infezioni virali asintomatiche, dalla medicina forense all’industria farmaceutica, dalla chimica ambientale alla biologia molecolare, dalla ricerca agroalimentare alla ricerca di base.
Il frammento di
DNA contenente
la sequenza da
amplificare viene
riscaldato per
ottenerne la
la denaturazione.
Quindi il frammento
viene raffreddato
per appaiarvi
gli iniziatori.
Vengono aggiunti
oligonucleotidi e DNA
polimerasi per sintetizzare
due nuovi filamenti di DNA.
Il processo viene ripetuto
ottenendo la duplicazione
del DNA originario.
Ripetendo il processo, il
DNA originario può essere
amplificato molte volte
in breve tempo.
Iniziatore Nuovo DNA
5'
3'
3'
5'
Sequenza
bersaglio
Nuovo DNA
Figura Schema delle fasi della reazione a catena della polimerasi (PCR).
Stefani-Taddei Percorsi di biochimica © Zanichelli 2011
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