Acidi nucleici – 5

Acidi nucleici – 5
presentazione del prof. Ciro Formica
Immagini e testi tratti dai website di: genome.wellcome.ac.uk, dnaftb.org, unipv.it, unimi.it,
wikipedia.it, unibs.it, unina.it, uniroma2.it, nih.gov, zanichelli.it, sciencemag.org
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1- La reazione a catena della
polimerasi/Polymerase Chain
Reaction – PCR
2- Gli enzimi di restrizione
3- L’estrazione del DNA
eucariote
DNA polimerasi
innesco
stampo
primer
template
allungamento catena
3
5’  3’
monomeri
dNTP
Kary Mullis, USA, 1944-vivente
4
Biochimico USA, Nobel per la Chimica nel 1993
per aver sviluppato e migliorato –nell’83- la
tecnica PCR – Polymerase Chain Reaction, che
era stata già introdotta da Khorana (Nobel ’68).
Ha studiato e lavorato a Berkeley ed è
considerato uno scienziato eccentrico.
Beliefs (convinzioni): Science, like nothing else
among the institutions of mankind, grows like a
weed every year.
http://www.karymullis.com/pcr.shtml
Componenti della PCR (1986)
• DNA stampo;
• tampone specifico di reazione contente sali;
• primers (oligonucleotidi) specifici;
• deossinucleotidi trifosfati (dATP, dCTP, dGTP e dTTP);
• Taq polimerasi, enzima ad attività DNA Polimerasi ricavato da
Thermus aquaticus (Taq), attività 5’3’. Non ha attività
esonucleasica 3’ 5’. Caratteristiche: termoresistenza,
specificità, fedeltà (1 nt sbagliato ogni 2x104)
Thermus aquaticus batterio termofilo isolato per la prima volta
nelle pozze di acqua calda del parco nazionale di Yellowstone, negli
Stati Uniti.
La reazione avviene in un termociclatore con un blocco di
alluminio che può essere riscaldato e raffreddato rapidamente
Taq Polymerase
Il Grand Prismatic Spring nello Yellowstone
Park (USA). Il colore si deve alla presenza dei
batteri termofili
I cicli della PCR
+
II ciclo
III ciclo
denat.
T = 94°C
anneal.
exten.
T = 72°C
nuovo
DNA
23 = 8
8 molecole di DNA in 3 cicli
Schema generale della PCR
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Schema della PCR – Polymerase Chain Reaction
DNA stampo
1° ciclo
2° ciclo
3° ciclo
4° ciclo
2 copie
4 copie
8 copie
16 copie
Animazioni della PCR
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http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html
http://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-thepolymerase-chain-reaction-PCR-3D-animationwith-no-audio.html
Gli enzimi di restrizione
-rompono i legami fosfodiesterici tra i nucleotidi
-riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di
DNA a doppio filamento.
-le sequenze sono generalmente palindromi, cioè identiche se
lette in direzione 5'--> 3' sia su un filamento che sull'altro.
-servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile
-sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti
-riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche
(sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi).
Il loro nome deriva dal batterio da cui sono stati isolati:
EcoRI: E. coli  sequenza GAATTC/CTTAAG
BamHI : Bacyllus amyloliquefaciens: GGATCC/CCTAGG
Scoperta del primo enzima di restrizione (1970)
prima molecola di DNA ricombinante, Paul Berg (1972)
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Tipi di taglio




-BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO
Es. SmaI
5’-CCC GGG-3’
5’-CCC-3’
5’- GGG-3’
3’-GGG CCC-5’
3’-GGG-5’
3’-CCC-5’
 -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE:
 -5’ PROTRUDING (5’ SPORGENTE)
 -3’ PROTRUDING
(3’ SPORGENTE)

Es. Eco RI (5’ PROTRUDING)



5’-G/AATTC-3’
3’-CTTAA/G-5’
5’-G-3’
5’-AATTC-3’
3’-CTTAA-5’
3’-G-5’
Es. Kpn I (3’ PROTRUDING)


5’-GGTAC/C-3’
3’-C/CATGG-5’
5’-GGTAC -3’
5’-C-3’
3’-C-5’
3’-CATGG-5’
Estrazione del DNA eucariote
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Scopo dell’esperienza:
Estrarre il materiale genetico da un organismo vegetale
Materiale occorrente
• Reagenti
• Etanolo assoluto
• Acido acetico glaciale
• acido cloridrico diluito
• cloruro di sodio
• succo di ananas
• rosso fenolo
• blu di metilene/toluidina
• 1-2 banane o kiwi
• detergente liquido per piatti
• ghiaccio
Estrazione del DNA: procedura
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1.Raffreddare con ghiaccio in becher da 1000 un volume pari a 100 mL di
etanolo
2.Miscela n. 1 (becher 100 mL): 10 g. NaCl, 10 ml detergente liquido, 90 ml
acqua demineralizzata
3.Miscela n. 2 (becher 100 mL): 5 mL di succo d’ananas, 95 mL acqua
demineralizzata
4. Sbucciare e tagliare kiwi o banane, pestarli nel mortaio, aggiungere 10 mL
di soluzione 1, mescolare, versare in un becher da 100 – scopo: allontanare
proteine e carboidrati
5. Porre il becher a bagnomaria a 60°C per 15 minuti (termometro)
6. Subito dopo porre in ghiaccio (becher da 1000) per 5 min con una
bacchetta di vetro ridurre in poltiglia
7. Filtrare e suddividere il filtrato in 3-4 provette
8. Aggiungere a ciascuna provetta 3-4 mL di miscela 2. Scopo: la bromelina
dell’ananas è una proteasi atta a demolire le proteine istoniche, il che
favorisce la purificazione del DNA
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10 Aggiungere 10 mL di etanolo freddo. Si formeranno 2 fasi, da non
mescolare e far riposare per 10 min a temperatura ambiente
12 In etanolo a freddo precipitano gli acidi nucleici, che verranno estratti con
la bacchetta di vetro e posti in un tubo
13 Per evidenziarli meglio si aggiungono 5 gocce di rosso fenolo, che farà
colorare il materiale genetico
ingredienti
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Bagnomaria e filtrazione
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Fase finale: il DNA è estratto
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