CORSO DI FORMAZIONE 2011
DEMENZE RARE E MALATTIE DEL
MOTONEURONE
UP TO DATE SULLE SINDROMI ATASSICHE
JOURNAL CLUB
Lamezia terme 30/05/2011
Dott.ssa Maria Anfossi
Le mutazioni nel gene Fragile X Mental
Retardation 1 (FMR1) sono responsabili di
due importanti fenotipi:
•Sindrome dell’X Fragile (FXS)
•Sindrome da tremore e atassia
associata all'X fragile (FXTAS)
Sindrome dell’X Fragile (FXS)
E’ la seconda causa di ritardo mentale di natura
genetica dopo la sindrome di Down
Si associa alla presenza di un sito fragile in
corrispondenza della banda Xq27. 3,
in questa regione mappa il gene FMR1 (17esoni)
FREQUENZA : 1/4000 maschi; 1/6000 femmine
Fenotipo
Ritardo mentale grave
Faccia allungata con mandibola larga
Grandi orecchie a sventola
Testicoli ingrossati (macro-orchidismo)
Alterazioni genetiche responsabili della
FXS
La sindrome è causata dall’espansione della tripletta CGG nella regione
non tradotta del gene FMR1, quando il numero delle triplette è > 200
l’intera regione viene metilata aggiungendo un gruppo metilico alle
citosine su entrambe le eliche, ciò comporta il silenziamento genico
(malattia da perdita di funzione) e la mancata produzione della
proteina FRMP (fragile X-mental redardation protein).
COSA FA FMRP?
FMRP è una proteina RNA-binding selettiva associata con i
poliribosomi ed espressa nei neuroni
E’ implicata nel controllo traduzionale nelle sinapsi, regolando il
rilascio dei neurotrasmettitori a livello post-sinaptico
Nelle spine dendritiche regola la traduzione degli mRNA codificanti
importanti proteine che hanno funzione cruciale per la plasticità
sinaptica e la maturazione neuronale
Assenza di FMRP comporta un defict nell’apprendimento e
nella memorizzazione responsabili del ritardo mentale
osservato nei pazienti affetti dalla Sindrome dell’X fragile
Le mutazioni nel gene FMR1 sono
riconducibili a mutazioni dinamiche
Cosa sono le mutazioni dinamiche?
espansione di trinucleotidi localizzati nelle regioni codificanti o noncodificanti di alcuni geni.
si originano per errori nella replicazione del DNA.
possono originare un sito fragile visibile citogeneticamente.
SINDROMI DA PREMUTAZIONE DI FMR1
Una mutazione completa sul gene FMR1, responsabile
della sindrome dell’X fragile, non insorge MAI
direttamente su un allele normale c’è bisogno di una
tappa intermedia la premutazione che conferisce
all’allele un’aumentata instabilità e la propensione a
diventare mutazione completa nel passaggio
attraverso la gametogenesi femminile
SINDROMI DA PREMUTAZIONE DI FMR1
Sindrome da Tremore-Atassia associata all’X
fragile (FXTAS)
Lievi sintomi psichiatrici
Insufficienza ovarica e menopausa precoci
(POF)
Atassia isolata adulti
Sindrome da Tremore-Atassia associata all’X fragile
(FXTAS)
La FXTAS venne descritta per la prima volta nel 2001 in 5
maschi con premutazione (PM) i cui sintomi erano:
tremore con deficit delle funzioni esecutive, disfunzioni
cerebellari, declino cognitivo e Parkinsonismo associato ad
atrofia cerebrale generalizzata (Hagerman et al.,2001).
Nel 2000 Tassone et al., aveva stabilito che i portatori di PM
presentavano elevati livelli di mRNA del gene FMR1 mentre i
livelli di proteina FMRP erano leggermente ridotti.
A tal proposito venne ipotizzato che la degenerazione del CNS
presente in questi pazienti era dovuto ad elevata livelli di mRNA
FMR1 (Hagerman et al.,2001).
La nuova sindrome venne chiamata sindrome da tremore ed atassia
associata all'X fragile (FXTAS)
[Jacquemont et al., 2003]
La sindrome da tremore ed atassia associata all'X fragile (FXTAS) è
dovuta alla presenza di un'espansione da premutazione con 55-200
ripetizioni CGG nel gene del ritardo mentale da X fragile 1
(FMR1; Xq27. 3)
(Hagerman et al., 2001; Jacquemont et al., 2003, 2004a)
Dal punto di vista clinico…
E’ una malattia neurodegenerativa progressiva caratterizzata
da tremore intenzionale ad esordio tardivo e andatura
atassica ed è clinicamente e neuropatologicamente distinta
dalla sindrome dell’X fragile causata da full mutation in FMR1
(Hagerman et al., 2001; Jacquemont et al., 2003, 2004)
Tremore ed Atassia sono presenti insieme nel 75% dei casi
Solitamente compare prima il tremore e progredisce verso l’atassia
Il tremore compare prima nella
mano dominante e con il tempo
interessa anche la mano opposta.
L’atassia è di entità più
moderata e risulta meno intensa
rispetto al tremore
E’ un tremore intenzionale a carico
degli arti sup. che aumenta
d’intensità quando si prende o si
manipola un oggetto.
La sua complicanza più grave
riguarda il rischio di cadute
Altri segni clinici:
• Parkinsonismo (amimia facciale, lieve rigidità,
lieve bradicinesia)
• Neuropatia periferica con riduzione di
sensibilità delle gambe
• Coinvolgimento cognitivo (quando presente) va
da una media alterazione delle funzioni esecutive
a livello frontale e deficit di memoria ad una
demenza globale simile fvFTD, ma non ad AD
(Grigsby et al., 2006, Grigsby et al.,2007)
• Ai disturbi cognitivi spesso si associano segni
psichiatrici quali disturbi comportamentali,
emotivi e del tono dell’umore (Bacalman et
al.,2006; Hessl et al., 2005)
Dal punto di vista neuroradiologico…
Alla risonanza
magnetica cerebrale si
osserva un quadro
molto caratteristico
(anche in fase precoce)
dato dall’iperintensità
dei peduncoli
cerebellari medi
definita “MCPsign”
Iperintensità dei MCPs
Perdita di volume con un aumento
dell’intensità di segnale nella
sostanza bianca a livello frontale e
parietale
In fase avanzata ed in presenza di declino cognitivo, si
osserva una diffusa atrofia corticale.
Brunberg et al., 2002
Dal punto di vista neuropatologico…
Inclusioni eosinofile intranucleari in cellule neuronali ed astrocitarie
in diverse regioni cerebrali.
Tutto ciò fa si che la FXTAS sia definita dal punto di vista
neuropatologico un disordine legato alle inclusioni.
Greco et al., 2002; Brain
Inclusioni neuronali ed astrocitarie sono presenti anche nelle
femmine affette da FXTAS (evento raro dovuto ad una
inattivazione sbilanciata del cromosoma X)
Hagerman et al.,2004b
Le inclusioni presenti in FXTAS sono simili a quelle presenti nei
disordini con repeat CAG
FXTAS: espansione
CGG repeat
SCA3: espansione
CAG repeat
CRITERI DIAGNOSTICI*
Criterio clinico (CC)
Criterio radiologico (CR)
Maggiore (M)
-Tremore intenzionale
- Atassia
Minore (m)
- Parkinsonismo
- Deficit medio-grave di
memoria a breve termine
- Deficit delle funzioni esecutive
Maggiore (M)
- “MCP sign”
Minore (m)
- Lesioni della sostanza bianca
cerebrale alla risonanza magnetica
- Atrofia cerebrale generalizzata
moderata-grave
Categorie diagnostiche
Definita
1CCM e 1CRM
*In presenza di premutazione
Probabile
2CCM/1CCm e 1CRM
Possibile
1CCM e 1CRm
Hagerman and Hagerman, 2004
Qual è la base molecolare del
FXTAS?
Presenza di “espansione
da 55 a 200 ripetizioni
CGG” nella regione non
tradotta 5’-UTR di
FMR1.
Questa regione e’
polimorfica: varia da 7 a
52 ripetizioni.
L’allele più frequente ha
30 ripetizioni, stabili
nella trasmissione e
interrotte da 2 triplette
AGG.
Le triplette AGG
prevengono eventi di
“scivolamento” nella
replicazione avendo così
un ruolo stabilizzante.
Espressione del gene FMR1
Lo stato di
premutazione nel
gene FMR1 non
comporta la mancata
produzione della
proteina come in
FXS, ma livelli
proteici leggermente
inferiori alla norma.
Questa ridotta
efficienza viene in
parte compensata da
una maggiore
produzione di mRNA.
Questo dettaglio è importante perché è la causa della FXTAS alla
quale i maschi portatori di premutazione possono andare incontro
Si è ipotizzato che
l’espansione di CGG nel
trascritto FMR1
impedisce la migrazione
della subunità ribosomiale
40S, con conseguente
alterata traduzione;
Di conseguenza la cellula
nervosa produce bassi
livelli di FMRP; per
compensare questi bassi
livelli proteici viene
aumentata la trascrizione
del gene FMR1.
La cellula nervosa tenta di eliminare le eccessive quantità di mRNA di FMR1
utilizzando il pathway ubiquitina-proteosoma, ma non sempre ci riesce ed il
risultato è la formazione di inclusioni intranucleari, con conseguente
neurodegenerazione.
La patogenesi della FXTAS è associata ad un eccessiva produzione di
mRNA, alla precipitazione del medesimo all’interno del nucleo e alla
conseguente formazione di corpi inclusi con effetto tossico che porta
alla morte cellulare (RNA gain-of-function model)
Tassone et al.,2000; Hargerman et al.,20001; Greco et al., 2002 Iwahashi et al, 2002
Chi è affetto dalla FXTAS?
•
Premutazione (55-200 repeats) sono trovate in 1:259 F e 1:813 M.
•
La premutazione è instabile quando viene trasmessa per via materna
•
Sebbene siano stati descritti sia pazienti maschi che femmine, la
FXTAS colpisce prevalentemente i maschi di età superiore ai 50
anni. La prevalenza della malattia in questa popolazione è stata
stimata in circa 1:3.000.
•
FXTAS rappresenta il 2.2% delle atassie dell’età adulta; 4.4% delle
atassie ad esordio > 50 aa
•
Un piccolo sottogruppo di femmine portatrici della premutazione
sviluppano lievi difficoltà di apprendimento, ansia, depressione.
•
Il 20% femmine portatrici sviluppano menopausa precoce POF
(premature ovarian failure): cessazione del ciclo mestruale prima dei
40 anni in presenza di elevati livelli di FSH
•
Alcuni bambini maschi con premutazione presentano ritardo mentale
ed autismo
PJ Hargerman and RJ Hargerman, 2004
Penetranza di FXTAS:
nei maschi premutati con età superiore ai 50 anni è
circa del 40%, con una penetranza età-legata:
17% a 60 aa
38% a 70 aa
47% a 80 aa
75% oltre gli 80 aa
Jacquemont et al., 2004 JAMA
Modalità di trasmissione:
Il locus del gene responsabile della FXTAS e della FXS mappa
sul cromosoma X , quindi la modalità di trasmissione dovrebbe
essere X-linked, manifestandosi in modo diverso nei due sessi
Premutazione trasmessa dalla madre
Premutazione trasmessa dal padre
Metodi di analisi molecolare del gene FMR1
Ad oggi non esiste un singolo test che
permetta da solo di riconoscere tutte le
caratteristiche molecolari delle
mutazioni presenti nel gene FMR1
Metodi di analisi molecolare del gene FMR1
• Southern blot di DNA digerito con
specifici enzimi di restrizione
• PCR della sequenza CGG ed analisi dei
microsatelliti.
Le due tecniche
forniscono informazioni complementari,
entrambe debbono essere applicate per
l’identificazione dei soggetti normali, dei premutati
e degli affetti.
PCR & analisi dei microsatelliti
DNA
sangue
Amplificazione DNA
Separazione frammenti di lunghezze diverse
ABI 3130
Genescan Analysis
Valutazione del numero CGG
PCR & analisi dei microsatelliti (1)
• Richiede piccole quantità di DNA
(dell’ordine dei nanogrammi),
• Tempi di esecuzione brevi
• Il numero di CGG è determinato in modo
più preciso rispetto al Southern
• Molteplici protocolli di analisi sono stati
pubblicati usando differenti sets di
primers, condizioni di amplificazione e
metodi di separazione dei frammenti
PCR & analisi dei microsatelliti (2)
• L’amplificazione di grandi frammenti ricchi in GC
è particolarmente difficoltosa e richiede l’uso di
Taq polimerasi specifiche.
• I metodi pubblicati consentono l’amplificazione
degli alleli normali e di quelli premutati inferiori
a 100-120 CGG.
• Ad oggi non permette di identificare le
mutazioni complete (assenza amplificato).
Southern blot
DNA
DNA + EagI + EcoRI + Buffer
37° o.n.
sangue
Digestione DNA enzimi di restrizione
Corsa elettroforetica
su gel di agarosio
Separazione frammenti di lunghezze diverse
+
Trasferimento DNA su membrana
Southern blot
Rilevazione bande specifiche
Ibridazione con sonda StB12.3
32P
(marcata con
oppure con digossigenina)
Southern blot (2)
• E’ la tecnica d’elezione per l’identificazione di tutte
l’espansioni.
• Richiede alta qualità del DNA estratto e quantità
considerevoli (5-10 microgrammi)
• L’esecuzione necessita di più giorni (varie tappe)
• La corsa elettroforetica deve essere sufficientemente
prolungata (oltre 20 ore), in modo da permettere il
riconoscimento di piccole premutazioni
Chi sottoporre al test genetico
• soggetti con anamnesi familiare positiva per la
sindrome dell’X Fragile o ritardi mentali da lievi a gravi
con eziologia sconosciuta
• soggetti con menopausa precoce e/o anamnesi familiare
positiva per menopausa precoce (mamma, sorella, zia,
nonna)
• soggetti con anamnesi familiare per disturbi neurologici
(tremori, FXTAS)
Consulenza Genetica
La consulenza genetica per i disturbi della FXTAS è impegnativa a
causa dell’eredità multigenerazionale complessa, per il fenotipo
variabile e per le implicazioni sulle famiglie.
•Tutte le donne con premutazione possono avere figli con mutazione
completa e quindi FXS
•Tutte le figlie di maschi con premutazione saranno portatori
obbligati della premutazione.
•Il pedigree relativo alla famiglia è utile per calcolare il rischio
genetico relativo allo stato di portatore, alla possibilità di ammalarsi
e alla possibilità di trasmettere la premutazione alla prole.
Quando un paziente di sesso maschile con FXTAS è identificato, la
madre del paziente è un portatore obbligato. Di conseguenza la prole
e i parenti della madre e del paziente potrebbero essere a rischio
per la FXS o essere portatori della premutazione. I fratelli del
paziente sono a rischio per la FXTAS.
Conclusioni (1)
La scoperta del gene FMR1 e delle mutazioni responsabili della
sindrome dell’X fragile ha permesso di comprendere molte
caratteristiche delle patologie dovute a espansione di triplette (es.
fenomeno dell’anticipazione). Tuttavia alcuni punti non sono stati ancora
chiariti.
Non è noto, infatti, il momento esatto in cui avviene l’espansione
delle triplette, né si sa con esattezza perché la trasmissione della
malattia avvenga esclusivamente per via materna.
Inoltre la funzione della proteina FMRP non è stata ancora del tutto
chiarita.
Conclusioni(2)
FXTAS potrebbe essere uno dei più comuni
“disturbi neurologici progressivi” associati ad un difetto
genetico nei maschi, ma è attualmente sotto-diagnosticata
perché solo recentemente è stata descritta.
Inoltre, la manifestazione clinica è spesso non-specifica e i
sintomi possono essere ignorati, considerati secondari o
semplicemente legati all'invecchiamento.
Per una corretta diagnosi di FXTAS l’individuazione dello stato
di premutazione gioca un ruolo importante e, per questo motivo,
i pazienti con le caratteristiche cliniche e neuroradiologiche
descritte dovrebbero sottoporsi al test genetico.
