PROGETTO DI RICERCA
SINDROME DI TURNER: TERAPIA CON GH E INFLUENZA DEL GENE SHOX
Coordinatore del progetto: Prof.ssa Laura Mazzanti
Ambulatorio di Malattie Rare, Sindromologia ed Auxologia; U.O. Pediatria Pession,
Dipartimento della Salute della Donna e del Bambino.
Premesse
La Sindrome di Turner è caratterizzata dall’assenza parziale o totale di uno dei cromosomi
sessuali con o senza linee cellulari in mosaico, e colpisce esclusivamente il sesso femminile. La
prevalenza è di 1 caso su 2500 nate vive. I segni clinici caratteristici sono ampiamente
variabili: ritardo di crescita con diminuita satura definitiva, disgenesia gonadica con infertilità
o alternativamente una prematura insufficienza ovarica, ed alcuni segni del fenotipo esterno.
Nella Sindrome di Turner si possono evidenziare problematiche a livello multisistemico, che
necessitano di attento follow up e l’attuazione di azioni preventive per assicuare una buona
condizione di salute in età adolescenziale ed adulta, ed una normale aspettativa di vita.
Difetto di crescita - La causa del ritardo di crescita non è nota, ma si pensa che si tratti di un
difetto primitivo dell’osso. Geni determinanti la statura sono localizzati sulle braccai corte del
cromosoma X (Xp22) e Y (Yp11). Numerosi studi hanno riportato un significativo guadagno
staturale e un decisivo miglioramento della statura definitiva con il trattamento dell’ormone
della crescita (GH), usato ad alte dosi e per lunghi periodi di tempo.
E’ dimostrato che un inizio precoce di terapia con GH permette un migliore guadagno
staturale. Dati preliminari indicano inoltre che un inizio precoce è più efficace, non rischioso e
permette di poter progredire nella pubertà ad un’età più fisiologica.
Avviamento della pubertà – L’assenza dello sviluppo puberale spontaneo è un segno clinico
comune; circa il 30% delle bambine ha qualche segno di sviluppo. In via definitiva comunque
circa il 90% dei soggetti va incontro ad insufficienza ovarica. L’induzione della pubertà con
estrogeni deve riflettere il normale processo puberale e lo schema terapia va individualizzato.
Studi recenti hanno evidenziato che l’inizio degli estrogeni attorno ai 12 anni non interferisce
con l’effetto positivo del GH sulla crescita.
Un dato che si è visto influenzare negativamente la statura definitiva è la precoce comparsa di
menarca spontaneo.
Progetto di ricerca
Determinazione dell’influenza del gene SHOX sulla statura definitiva
La bassa statura è la caratteristica fenotipica più comune nella Sindrome di Turner e
riconosce molteplici cause: fattori genetici, quali l’aploinsufficienza del gene SHOX (Short
Stature Homeobox gene), localizzato a livello della regione pseudoautosomica in Xp22.3 e
Yp11.3). L’aploinsufficienza di SHOX, gene dose-dipendente, sembra essere il principale
fattore causale del disturbo di crescita di questi soggetti.
In particolare nella sindrome di Turner la monosomia dei geni presenti sul cromosoma X
comporta, molto probabilmente l’elevata letalità embrionale, la disgenesia gonadica e la
bassa statura. Quest’ultima caratteristica è verosimilmente correlata alla presenza di una sola
copia del gene SHOX.
Lo studio verrà condotto attraverso una stretta collaborazione tra Ambulatorio di Malattie
Rare Pediatriche ed Auxologia, diretto dalla Prof. Laura Mazzanti, ed il Laboratorio di
Genetica Molecolare di cui è responsabile la Dr.ssa Lilia Baldazzi.
Pazienti e Metodi
Pazienti - La casistica attuale si compone di 153 soggetti con sindrome di Turner seguite in
follow-up presso l’Ambulatorio di Malattie Rare Pediatriche ed Auxologia del Policlinico
ospedaliero-universitario S.Orsola-Malpighi, che hanno raggiunto la statura finale, suddivisi
nei seguenti gruppi:
Gruppo A - 22 soggetti senza alcun trattamento per implementare la crescita (gruppo
storico di controllo), se non la terapia sostitutiva con estro-progestinici introdotti in
età puberale.
131 pazienti sottoposte a terapia con GH per 6.7 ± 2.92 anni (range 2-13.4) a dosi varianti tra
45-50 g/kg/die, sono state suddivise in base agli anni di terapia con GH:
Gruppo B - 52 pazienti trattate per meno di 6 anni di terapia
Gruppo C - 79 pazienti trattate per un periodo superiore o uguale a 6 anni.
Metodi di valutazione:
1. Valutazione auxo-antropometrica pre-terapia ed al raggiungimento della statura
finale (SF), i dati accrescitivi verranno espressi in centimetri ed in SDS.
Le misure sono state rilevate con strumentazione a lettura digitale fornita dalla
“Harpenden e Holtain” Antropometric Instruments London.
Gli strumenti utilizzati di volta in volta sono stati: lo statimetro, il tavolo per la statura
seduta, l’antropometro a branche ricurve oppure diritte e lo “sliding caliper”.
2. Valutazione dismorfologica per la valutazione del fenotipo, esterno ed interno.
3. Analisi citogenetiche e Molecolari
a. Analisi citogenetica - Il cariotipo costituzionale è stato determinato su colture
di sangue periferico, riportando per ogni caso di mosaicismo anche le
percentuali delle diverse linee cellulari. Negli anni più recenti, quando ritenuto
utile, l’analisi citogenetica tradizionale è stata accompagnata da analisi di
ibridazione in situ, la FISH, eseguita con sonde specifiche per i cromosomi X ed
Y.
b. Analisi molecolare - Per la quantificazione del gene SHOX è stata utilizzata
l’MLPA (Multiplex ligation dependent probe amplification). Si tratta di
un’indagine di laboratorio di tipo quantitativo, ovvero una PCR fluorescente
mediante la quale è possibile valutare le variazioni del numero di copie target
predefinite. Questa tecnica si basa principalmente sull’utilizzo di sonde
oligonucleotidiche complementari a determinate sequenze geniche, formate
ognuna da due oligonucleotidi che si ibridano a regioni adiacenti alla sequenza
target e che vengono successivamente uniti mediante “ligazione” enzimatica.
La metodica fornisce risultati in tempi nettamente migliori rispetto a quelli del
cariotipo, e per di più con una sensibilità significativamente maggiore. Nel
nostro studio è stata utilizzata l’MLPA per quantificare la dose di SHOX
presente nel genoma delle pazienti selezionate presso il nostro Ambulatorio,
mediante l’uso di kit contenenti 30 sonde. Esse si legano a 34 regioni specifiche
per i cromosomi X e Y, la maggior parte localizzate nelle regioni Xp22.32 e
Yp11.3, evidenziando l’eventuale aploinsufficienza di una di esse. In particolare
le nostre sonde avevano come bersaglio geni presenti sulla regione PAR1 a
livello delle estremità del braccio corto del cromosoma X, altri a livello
centromerico, altri ancora a livello della regione PAR2 e Xq2.5. Il razionale di
utilizzare un numero di sonde così cospicuo è quello di fornire un dato il più
accurato possibile sulle caratteristiche del cromosoma.
4. Elaborazione dei dati citogenetici e molecolari presso il Laboratorio di Genetica
molecolare (responsabile: Dott.ssa L. Baldazzi). I biologi (in particolare la dott.sa A.
Nicoletti) hanno raccolto tutti i cariotipi delle nostre pazienti con mosaico con le
percentuali specificate. Nel caso in cui mancasse questo dato è stata eseguita l’MLPA
(Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification). Chiaramente, avendo utilizzato
due metodiche differenti dal punto di vista tecnico, essendo l’indagine del cariotipo un
esame citogenetico e l’MLPA un’indagine molecolare, il metodo utilizzato è di tipo
empirico.
5. Analisi statistica
Tutte le misure riportate sono state calcolate in SDS rispetto alla popolazione generale
(Prader et al. 1989). La statura in SDS è stata inoltre calcolata sugli standards specifici
per la sindrome di Turner. Per l’analisi statistica è stato utilizzato un personal
computer IBM ed ANOVA test e l’analisi della regressione multipla generale.
Il numero delle pazienti verrà man mano implementato aggiungendo
raggiungimento della loro statura definitiva.
soggetti al
Il nostro studio si propone i seguenti obiettivi:
1. Valutazione della possibile esistenza di una correlazione tra la dose di SHOX e la
statura definitiva nella Sindrome di Turner.
2. Definizione di un cut off ipotetico di dose di SHOX oltre il quale sia possibile fornire ai
genitori ed al paziente stesso una previsione di crescita staturale e di raggiungimento
della SF in centimetri più soddisfacente rispetto a chi possiede un valore al di sotto del
cut-off stesso. Essendo infatti la SF uno dei parametri più compromessi per questa
condizione, ed enormemente incisivo sulla qualità di vita di chi ne è portatore, è
evidente che potere fornire un’informazione più precisa dell’evoluzione
dell’accrescimento risulta essere un dato molto rilevante.
3. Possibilità di scelta del modo più accurato di come e quando avviare la terapia con GH
utilizzando questo parametro.
4. E’ noto che la presenza di una dose di SHOX maggiore di 1 induce una maggiore
probabilità di menarca spontaneo e parallelamente espone ad un maggior rischio che
la crescita staturale sia influenzata negativamente da una precoce saldatura epifisaria
legata alla pubertà. Il contributo in centimetri della dose di SHOX sulla statura,
potenzialmente favorito da un maggior quantitativo del gene, potrebbe essere
antagonizzato dall’effetto negativo del menarca sulla crescita.
Un ulteriore obiettivo dello studio sarà la valutazione degli effetti sulla statura
definitiva di agonisti dell’LHRH per frenare l’avvio della pubertà nei soggetti con
pubertà spontanea e dose SHOX maggiore di 1.
Prof.ssa L. Mazzanti, responsabile
Ambulatorio di Malattie Rare,
Auxologia e Sindromologia
