Caratteristica fondamentale delle cellule vegetali
TOTIPOTENZA
È possibile rigenerare un’intera
pianta da singole cellule
differenziate
Tranne quelle che hanno perso il nucleo
(tracheidi, elementi del cribro)
Le cellule vegetali possono essere coltivate in vitro,
cioè un ambiente asettico in cui le condizioni chimicofisiche sono sotto controllo
LUCE (composizione spettrale, fotoperiodo)
TEMPERATURA
COMPOSIZIONE CHIMICA DEL MEZZO
(nutrienti minerali, carboidrati, vitamine,
regolatori di crescita)
DENSITA’ DELLA POPOLAZIONE CELLULARE
(numero di cellule per unità di volume)
Cellule in coltura private della parete
PROTOPLASTI possono propagarsi
indefinitamente
protoplasti di cellule del
mesofillo mantenute in
coltura in presenza di
mannitolo per evitare la lisi
Le colture cellulari possono essere impiegate:
• nella RICERCA DI BASE (studio della biologia cellulare)
• per SCOPI APPLICATIVI (produzione di metaboliti secondari)
RICERCA DI BASE
In natura le condizioni ambientali variano nello spazio e nel tempo
in modo non controllabile
In vitro è possibile variare uno specifico fattore ambientale
(mantenendo invariati gli altri) per studiare la sua influenza su
particolari aspetti della biologia cellulare
studio del ruolo di un componente del terreno di
coltura su una specifica via biosintetica
RICERCA DI BASE
le colture cellulari possono essere utilizzate
per lo studio di specifiche vie biosintetiche
precursore 1
prodotto
precursore 2
ESPERIMENTO 1
precursore
1 marcato
il prodotto deriva
dal precursore 1 o
dal 2?
ESPERIMENTO 2
prodotto
non
marcato
precursore
2 marcato
prodotto
marcato
IL PRODOTTO DERIVA DAL PRECURSORE 2
INTERESSE APPLICATIVO
le cellule in coltura possono essere utilizzate per produrre
sostanze utili per l’industria farmaceutica, agroalimentare,
cosmetica, ecc.
l’estrazione di metaboliti secondari dalla pianta comporta
generalmente la distruzione della pianta stessa
problema se:
RARA (difficile da reperire, protetta)
DI DIFFICILE COLTIVAZIONE
A CRESCITA LENTA (piante legnose)
Non sempre le cellule in coltura, indifferenziate, producono i
metaboliti di interesse. Alcune vie biosintetiche sono:
cellula-specifiche: sono attive solo in alcune cellule specializzate
(ghiandole, latticiferi, ecc.)
tessuto-specifiche: sono attive solo in alcuni tessuti (epitelio di
dotti e cavità secretorie, parenchima corticale, tegumento)
organo-specifiche: sono localizzate solo in uno specifico organo
(radice, foglia, fiore, frutto, ecc.)
In coltura possono essere mantenute
anche strutture organizzate
meristemi
germogli
radici
nodi
embrioni
antere
germoglio
radici
antere
Terreni di coltura per cellule e tessuti vegetali
• sali minerali
• fonte di carbonio
• vitamine
• regolatori di crescita
• altri composti organici
Optimum di pH 5.0 – 6.0
COMPOSIZIONE - SALI MINERALI
MACROELEMENTI: elementi richiesti ad una concentrazione
> 0.5 mM
Macroelementi essenziali: N, K, P, Ca, S, Mg, Cl
MICROELEMENTI: elementi richiesti ad una concentrazione
< 0.5 mM
Microelementi essenziali: Fe, Mn, B, Cu, Zn, I, Mo, Co
composizione in sali minerali di alcuni terreni
Funzione dei sali minerali nella crescita in vitro
Elemento Funzione
N
K
Ca
Mg
P
S
Cl
Fe
Mn
Co
Cu
Zn
Mo
Componente di proteine, acidi nucleici, alcuni coenzimi –
richiesto in elevate quantità
Regola il potenziale osmotico – principale catione inorganico
Parete cellulare, funzione della membrana, signalling
Cofattore enzimatico, componente clorofilla
Componente acidi nucleici, intermedi metabolismo del carbonio
Componente di alcuni amminoacidi e di alcuni cofattori
Richiesto nella fotosintesi, movimenti stomatici
Componente dei citocromi (trasferimento energia)
Cofattore enzimatico
Componente di alcune vitamine
Reazioni di trasferimento elettronico, cofattore enzimatico
Biosintesi clorofilla, cofattore enzimatico
Componente della nitrato-reduttasi (metabolismo dell’azoto)
SORGENTE DI CARBONIO E VITAMINE
Saccarosio o glucosio, concentrazione 2-5%
indispensabile vitamina B1 (tiamina)
crescita aumentata da acido nicotinico e
vitamina B6 (piridossina)
alcuni terreni contengono: acido pantotenico,
biotina, acido folico, acido p-amminobenzoico,
colina, riboflavina e acido ascorbico
Dai tessuti in coltura è possibile rigenerare l’intera pianta
avventizi
germogli
caulogenesi
radici
rizogenesi
embrioni
embriogenesi somatica
embrioidi o embrioni somatici
caulogenesi
rizogenesi
embriogenesi somatica
MORFOGENESI DIRETTA
MORFOGENESI INDIRETTA
da cellule differenziate di tessuto
senza proliferazione di tessuto
indifferenziato
da cellule de-differenziate di
callo (proliferazione di tessuto
indifferenziato)
Tessuto vegetale
che si forma
intorno ad una
ferita
massa di tessuto amorfo formato da cellule
che si moltiplicano in maniera disorganizzata
si può ottenere da espianti di tessuto
sotto lo stimolo di regolatori di crescita endogeni o presenti
nel mezzo, le cellule di un espianto di tessuto vanno incontro
a de-differenziamento e formano un nuovo tessuto di cellule
non specializzate
embriogenesi
somatica diretta
sviluppo di embrioni
somatici su espianto di
tessuto
embriogenesi
somatica indiretta
sviluppo di embrioni
somatici su callo
sviluppo di germogli su callo
morfogenesi indiretta
callo nodulare
(embriogenico)
callo friabile
(non-morfogenico)
la capacità di formare un callo è diversa da specie a specie e da tessuto
a tessuto (particolarmente nelle monocotiledoni)
canna da
zucchero
la morfogenesi è stata osservata in numerose
specie, ma non può essere indotta universalmente,
anche all’interno di una stessa specie alcune
varietà sono recalcitranti
cellule che hanno la capacità di dar luogo a morfogenesi
sono dette COMPETENTI
la competenza è generalmente verso una specifica via di sviluppo:
una cellula competente per lo sviluppo dell’embrione somatico non
lo è anche per lo sviluppo del germoglio
Le cellule possono essere indotte a diventare
competenti aggiungendo nel mezzo di coltura
opportuni regolatori di crescita
Dal callo è possibile
ottenere cellule in
sospensione
pianta
• Prelievo degli espianti
Espianti
fogliari
• Sterilizzazione
Espianti
caulinari
• Inoculo in mezzo callogenico
callo
callogenesi
callogenesi
Inoculo in
mezzo liquido
SOSPENSIONE
CELLULARE
BIOREATTORE
COME SI RIGENERA UNA PIANTA?
ruolo fondamentale nel processo
morfogenetico è svolto da ormoni vegetali
auxina e citochinine intervengono nella
regolazione della divisione cellulare
Sovraespressione del gene che codifica
per la citochinina ossidasi (ridotti livelli
di citochinine) in tabacco
ritardo nello sviluppo del germoglio
dovuto alla riduzione della velocità di
proliferazione cellulare nel meristema
apicale
WT
transgeniche
Sovraespressione del gene che codifica
per la citochinina ossidasi (ridotti livelli
di citochinine) in tabacco
aumento della velocità di
crescita della radice
aumento della
proliferazione nel
meristema radicale
la carenza di auxina provoca
l’arresto in fase G1
la carenza di citochinine
provoca l’arresto in fase G2
auxina e citochinine partecipano alla regolazione del ciclo cellulare
controllando l’attività delle CHINASI CICLINA-DIPENDENTI
Cdc2
inattiva
Cdc25
Cdc2
attiva
auxina
citochinine
Cdc25 tirosin-fosfatasi
Recentemente è stato dimostrato che le citochinine
incrementano l’espressione del gene CYCD3 (negli
animali le cicline di tipo D regolano il passaggio in
fase G1)
In Arabidopsis CYCD3 è espresso in tessuti
proliferativi come i meristemi dei germogli
Skoog e Miller
(1957): alti livelli
di citochinine e
bassi libelli di
auxina inducevano
la formazione di
germogli in calli
di
tabacco
in
coltura
concentrazione di
chinetina (mg/L)
concentrazione di IAA (mg/L)
0
0
0,2
1,0
0,005
0,03
0,18
1,08
3,0
auxina
auxina + citochinina
Sviluppo del germoglio dal callo
Callo
+ citochinine
questo processo è
abbastanza semplice
per le dicotiledoni
sviluppo del germoglio
AUXINA
CITOCHININA
alta
bassa
formazione di radici su espianti
induzione callo nelle monocotiledoni
I stadio embriogenesi
formazione radici avventizie
su callo
induzione callo nelle dicotiledoni
formazione germogli avventizi
proliferazione di gemme
ascellari in colture di germogli
bassa
alta
IAA
AUXINE
IBA (acido 3-indolbutirrico)
NAA (acido 1-naftalenacetico)
2,4 D (acido 2,4-diclorofenossiacetico)
CITOCHININE
Come si propagano le piante
Riproduzione
sessuale
Riproduzione
asessuale
PROPAGAZIONE VEGETATIVA
riproduzione asessuale
cactus
opuntia bigelovii
kalanchoe
la progenie è costituita
da “cloni” geneticamente
identici
alla
pianta
madre
stoloni
fragola
patate
Specie propagate vegetativamente
banana
alberi da frutto (mele, pere, agrumi)
manioca
patata
fragole
cacao
canna da zucchero
INNESTO
il portainnesto determina
l’altezza dell’albero da
frutto
portainnesto
selezionati per la resistenza
a malattie
propagazione
mediante TALEA
auxina per indurre la
formazione delle
radici
PROPAGAZIONE IN VITRO
(MICROPROPAGAZIONE)
Permette di ottenere un elevato numero di
piantine identiche sia genotipicamente che
fenotipicamente alla pianta madre
gemma
apicale
foglia
gemma
ascellare
internodo
radici
Materiale di partenza
per la
micropropagazione
micropropagazione
moltiplicazione di germogli da gemme ascellari
formazione di germogli avventizi
formazione di embrioni somatici avventizi
direttamente
indirettamente
su espianti della
pianta madre
da colture in
sospensione o calli
la crescita e la proliferazione di gemme
ascellari è indotta in seguito alla diminuzione di
dominanza apicale
rimozione dell’apice
aggiunta di citochinina nel terreno di coltura
impatiens
ciclamino
orchidea
pino
VANTAGGI della micropropagazione
specie che non si possono propagare altrimenti
spazi ristretti
condizioni asettiche: assenza di
batteri, funghi e altri microorganismi
metodiche per ottenere piante prive di virus (orchidee)
produzione indipendentemente dalla stagione vegetativa
maggiore possibilità di variare i fattori che
influenzano la crescita
acquisizione di nuove caratteristiche (es. stoloni fragole)
SVANTAGGI della micropropagazione
le piantine hanno bisogno di un periodo di
adattamento per diventare autotrofe
cresciute in alta umidità sono più
suscettibili alla perdita di acqua
epigenetica
variazione somaclonale
transiente
non si
eredita
ereditabile
perdita della richiesta
di ormoni e vitamine
VARIAZIONE SOMACLONALE
Aberrazioni cromosomali
- alterazioni nel numero e nella struttura dei
cromosomi
- riarrangiamenti cromosomici
- differenze nel numero di copie di sequenze di DNA
(amplificazione o diminuzione di sequenze ripetute)
- metilazione del DNA
camera climatica
Spesso la limitazione
maggiore alla
trasformazione delle
piante non è la
metodica di
trasferimento del
DNA, quanto la
rigenerazione della
pianta
Quando si effettua una trasformazione, sia con
Agrobacterium che con il sistema biolistico, vista la
bassa efficienza della rigenerazione, sarà necessario
utilizzare un numero elevato di espianti per essere
certi di ottenere piantine trasformate
I cloni trasformati ottenuti vengono poi
MICROPROPAGATI
E’ possibile evitare la coltura dei tessuti
e la rigenerazione della pianta?
Trasformazione “in planta”
non richiede coltura di tessuti e rigenerazione della pianta
Esclusivamente per Arabidopsis thaliana
- trasformazione di semi
- inoculazione DNA in pianta
Agrobacterium
- infiltrazione nel fiore
(floral dip)
co-coltivazione dei
semi con
Agrobacterium
rimozione del germoglio
apicale e infiltrazione con
Agrobacterium del
tessuto meristematico
ferito
5% dei nuovi germogli
sono trasformati
immersione dei fiori
nella sospensione
batterica o
infiltrazione sotto
vuoto nel periodo della
fecondazione
Floral dip
immersione delle infiorescenze
nella sospensione batterica
Floral dip
Si produrranno semi transgenici da cui si
otterranno le piante trasformate senza dover
passare per la fase di rigenerazione e coltura
in vitro dei tessuti
Le piante possono essere poi propagate da
seme
sistema per recuperare i semi da
Arabidopsis
i semi si raccolgono nel cono
