Lezione 10 File - e

Colture in vitro di cellule e
tessuti
Le conoscenze sugli ormoni vegetali, che nella metà del
900 aumentarono notevolmente aprì nuove strade alla
tecnologia delle colture in vitro.
Ci si rese conto che la coltura in vitro era un formidabile
mezzo per lo studio dei processi di sviluppo delle piante e
di come fosse possibile stabilire a priori quale organo della
pianta ottenere semplicemente dosando adeguatamente i
componenti dei mezzi di coltura, in particolare gli ormoni
vegetali.
Successivamente, quando si comprese che non solo gli
organi di una pianta potevano essere ottenuti in coltura in
vitro, ma addirittura una pianta intera, a partire da un
espianto piccolissimo (anche poche cellule o singoli
protoplasti), il mercato delle piante di interesse
agronomico e ornamentali fu completamente stravolto.
Nel mezzo di coltura sono sempre
presenti:
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Macroelementi:C,O,H,N,P,S,K,Mg,Ca
Microelementi: Fe, Mn, Zn, Cu, B, Mo, Cl
Vitamine
Auxine
Citochinine
Zucchero
Agar
Fu dimostrato, intorno al 1950, che un espianto midollare del
fusto di tabacco era in grado di formare una gran massa di
callo in presenza di auxina e citochinina a concentrazioni
equimolari. In presenza di sola auxina l’espianto produceva una
piccola quantità di callo
e da questo differenziava radici
(avventizie data la loro origine),processo noto come rizogenesi.
Al contrario la presenza di un’alta concentrazione di citochinina
ed una bassa di auxina portava alla produzione di gemme
vegetative (avventizie), questo processo è detto caulogenesi.
Negli anni ’70 fu messo a punto un sistema sperimentale per cui
pochi strati cellulari prelevati dal caule di tabacco (Strato
cellulare sottile – Thin cell layer) era in grado di formare,
callo, radici, gemme e perfino fiori se coltivati in presenza di
auxina e citochinina a concentrazioni ben precise.
Caulogenesi sperimentale
Per caulogenesi si intende la produzione di germogli avventizi
da espianti di diverso tipo o da cellule entro masse callose.
Queste masse cellulari possono organizzare meristemoidi che si
svilupperanno in organi (foglie e gemme ascellari) in particolari
condizioni colturali.
La micropropagazione degli
apici caulinari fa parte della
caulogenesi sperimentale e
rappresenta un sistema di
rigenerazione
Coltura di meristemi apicali.
Zona meristematica dell’apice caulinare, si aggiungono solitamente
citochinine a basse concentrazioni. INDUCE MERICLONI
Coltura di apici caulinari.
Simile alla propagazione per talea, si usa una talea caulina in miniatura. La buona
riuscita dipende dall’espianto e dagli ormoni adatti. La produzione di germogli
ascellari può essere accompagnata dalla proliferazione di gemme avventizie dal
callo alla base del propagulo.
SISTEMI DI RIGENERAZIONE
L’accrescimento dell’apice meristematico interviene quando il meristema apicale
di un’ estremità del germoglio viene fatto radicare (radici avventizie) per la
produzione di una plantula. Tale procedura viene impiegata principalmente per
ottenere piante esenti da virus, nelle quali solo il meristema apicale (0,5mm) è
rimosso assieme a poche foglie sottostanti.
COLTURA DI MERISTEMI APICALI
RISANAMENTO DA VIRUS
I virus si possono trasmettere da pianta a pianta, per contatto, per seme, per polline,
per propagazione vegetativa, per mezzo di funghi e per vettori animali.
Non essendo le malattie virali curabili con trattamenti in campo, l'unico modo per
controllarle rimane la prevenzione.
Il risanamento di piante infette prevede la coltura di meristemi apicali, che
si basa sul fatto che le particelle virali sono assai rare, o disturbate nel loro
metabolismo nei meristemi apicali. Essa consiste nel prelevare un apice vegetativo
ed allevarlo "in vitro“, in questo modo si otterrà l'intera pianta risanata ovviamente
la sua condizione deve essere confermata da saggi virologici.
Sistemi di caulogenesi
sperimentale propriamente
detti
Sviluppo di germogli avventizi da vari organi
Sia direttamente dall’espianto che indirettamente dal callo che si forma sulla
superficie di taglio. I fattori che favoriscono lo sviluppo sono la scelta
dell’espianto e il regime ormonale.
Esempi di espianto: pezzi di foglia; espianti di apici di germogli; cotiledoni,
ipocotili; giovani foglie; infiorescenze immature o scapi fiorali; scaglie di bulbi,
sistemi sperimentali (TCL).
Sistemi di coltura di tessuti e di cellule.
La coltura di cellule vegetali sia come cellule isolate (es.protoplasti), che tessuto
calloso, che come sospensione liquida è un importante tecnica preliminare alla
rigenerazione dell’intera pianta.
ESPIANTO
Si pone in coltura un espianto sterile.
Fattori importanti: scelta dell’espianto, eliminazione inquinanti, nutrienti, luce,
temperatura e substrato. In generale, tessuti giovani, come apici dei germogli
terminali o laterali o avventizi hanno capacità rigenerative migliori. Ottime anche
le gemme a fiore immature.
Cellule private della parete
PROTOPLASTI
in coltura possono
propagarsi indefinitamente
Protoplasti di cellule del mesofillo
mantenute in coltura in presenza di
mannitolo per evitare la lisi.
MOLTIPLICAZIONE
Il materiale viene messo a crescere in presenza di elevati livelli di citochinina.
La moltiplicazione dei germogli dipende o dalla continua formazione di germogli
ascellari o dalla formazione di germogli avventizi dalle masse calliformi di tessuto
alla base dei germogli.
Espianti fogliari, coltivati in vitro sono in grado di
formare gemme vegetative.
Terreno MS
Vitamine
Auxina (IAA)
1mM
Citochinina (BA) 10 mM
Agar
pH 5.6
Controllo ormonale della caulogenesi
Citochinina
principale induttore della caulogenesi
Auxina
Etilene
Di per se non ha un’azione
induttiva di gemme
vegetative, ma una
variazione nei livelli di
etilene riduce la risposta
caulogenica.
La caulogenesi indiretta, cioè mediata da
callo, può associarsi a variazione
somaclonale
Variazione somaclonale
• Il termine ‘somaclone’ fu coniato per le
piante derivate da ogni forma di coltura
cellulare,
• ed il termine ‘variazione somaclonale’ fu
coniato in riferimento alla variazione
genetica fra queste piante
• Di solito questa variabilità insorge
spontaneamente ed è il risultato o di
cambiamenti temporanei o permanenti. I
cambiamenti temporanei provengono da
effetti epigenetici o fisiologici e non sono
ereditabili e sono reversibili. Al contrario, i
cambiamenti genetici sono ereditabili e
portano alla costituzione di
VARIETA’ SOMACLONALI
La variazione somaclonale si osserva
frequentemente nei casi di caulogenesi (ed
embriogenesi) indiretta
• Nei processi di sdifferenziamento e
riprogrammazione differenti sequenze del DNA
possono essere amplificate o delete.
• Può variare il numero e la struttura dei
cromosomi, e possono sorgere irregolarità in
questi, come rotture, delezioni, inversioni,
formazione di cromosomi ritardatari, ad
anello,ecc.
• I riarrangiamenti cromosomici possono risultare
in perdita di geni e loro funzioni, attivazione di
geni prima silenti, espressione di geni recessivi,
ecc.
rizogensi
caulogenesi
Neoformazione
di fiori
Servono questi nuovi varianti???
• La variazione somaclonale è una sorgente
di BIODIVERSITA’ e serve per ottenere
piante migliorate dal punto di vista
nutrizionale per l’uomo, più adattabili alle
condizioni di coltivazione in campo, più
produttive, più resistenti alle malattie.
Domande:
• Quanti aspetti conosci di caulogenesi sperimentale?
• Una pianta virosata può essere risanata ricorrendo alla
coltura in vitro?
• Quale è l’ormone principale per indurre caulogenesi?
• La rigenerazione da apice induce variazione
somaclonale?
• La caulogenesi da espianto fogliare o caulinare induce
variazione somaclonale?
• La caulogenesi e la rigenerazione hanno successo
senza rizogenesi avventizia?
• Cosa sono i protoplasti?
• Quali sono i vantaggi della variazione somaclonale?