Esemplare certificato conforme Tbilisi, il 25 giugno 2010 Il

RISOLUZIONE OIV/ENO 391/2010
LINEE DIRETTRICI SUGLI AUTOANALIZZATORI COLORIMETRICI IN ENOLOGIA
L'ASSEMBLEA GENERALE
Visto l’articolo 2 paragrafo 2 iv dell’Accordo del 3 aprile 2001 che ha portato alla
creazione dell’Organizzazione Internazionale della Vigna e del Vino,
Su proposta della Sotto-Commissione Metodi di Analisi,
CONSIDERANDO la risoluzione oeno 10/2005 «Guida pratica per la validazione, il
controllo qualità e la valutazione dell’incertezza di un metodo di analisi enologica
alternativa» che permette ai laboratori di assicurare il lavoro di collegamento del metodo
interno automatizzato in rapporto al metodo di riferimento OIV.
CONSIDERANDO che questa guida comprende anche procedure di controllo della qualità
dei risultati ottenuti tramite questi metodi automatizzati che permettono di renderne
sicuro l’utilizzo.
CONSIDERANDO che solo i metodi pubblicati nella Raccolta dei metodi internazionali
d'analisi dei vini e dei mosti dell’OIV o nella raccolta dei metodi internazionali d'analisi
delle bevande alcoliche d'origine vitivinicola dell’OIV hanno carattere ufficiale di
riferimento e sono applicabili per il controllo e la risoluzione di controversie.
DECIDE di pubblicare indipendentemente le linee direttrici relative agli autoanalizzatori
colorimetrici in enologia qui allegati.
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Federico CASTELLUCCI
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Linee direttrici sugli
Analizzatori automatici in enologia
I primi sviluppi dell'analisi automatica in enologia sono apparsi all'inizio degli anni 70.
Sono stati realizzati a partire da analizzatori a flusso continuo, utilizzati fino allora
principalmente in biologia medica.
I principali parametri accessibili erano allora l'acidità volatile, gli zuccheri riduttori, il
diossido di zolfo libero e totale. Più tardi, sono state acquisite tecniche enzimatiche che
permettevano, in particolare, il dosaggio del glucosio e del fruttosio e degli acidi malico e
lattico.
Nel 1980 degli analizzatori nel vicino infrarosso (NIR) hanno permesso una misura
rapida del titolo alcolometrico volumico nei vini e degli zuccheri nei mosti.
I primi analizzatori sequenziali, anch’essi derivati dall'analisi medica, sono apparsi
all'inizio degli anni 90. Permisero rapidamente l'accesso a numerose determinazioni a
base di reazioni chimiche (composti fenolici totali, diossido di zolfo libero e totale, acido
tartarico, acido acetico, o enzimatici (glucosio e fruttosio, acido malico e lattico, acido
citrico,…)
Più tardi, alla fine degli anni 90, la tecnica infrarossa a trasformazione di Fourier (IRTF) è
venuta a completare i dispositivi automatici a disposizione dei laboratori enologici.
Tutte queste tecniche automatiche sono attualmente estremamente diffuse in tutto il
mondo. Hanno permesso una diminuzione molto significativa del costo dell'analisi
enologica che si è tradotta nella possibilità, non di diminuire il costo per gli utenti ma
permettere loro di accedere, per un costo dato, a molti più parametri e dunque
informazioni. Questa situazione ha permesso di accompagnare, mediante l'analisi, tutte
le tappe della vita del vino in modo molto più efficace.
L'analisi automatica è dunque rapidamente risultata affidabile e ripetibile, a condizione di
attuare tecniche di controllo qualità interna (CQI) adatte.
Una caratteristica fondamentale di tutte le tecniche automatiche è che sono strettamente
comparative. Gli analizzatori automatici devono, infatti, essere oggetto di calibrature
iniziali con campioni di valore conosciuti. Queste calibrature possono essere permanenti,
semipermanenti, giornaliere o persino associate ad ogni serie di campioni. La qualità dei
risultati ottenuti è così direttamente dipendente da quella dei campioni di calibratura
attuati. Questi campioni possono essere vini o mosti che presentano valori conosciuti per
i parametri ricercati. Possono anche essere soluzioni sintetiche.
I metodi automatici restano, generalmente, metodi interni per i quali ogni laboratorio
deve potersi garantire della qualità dei risultati con vari approcci:
- convalida iniziale del metodo,
- qualità delle norme di calibratura e di controllo utilizzate,
- partecipazione molto regolare a reti di confronto interlaboratorio,
- confronto regolare dei risultati con quelli ottenuti dai metodi di riferimento, ecc.
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L’utilizzo decisamente alto delle tecniche automatiche nel mondo del vino rende il loro
ruolo tecnologico, commerciale e di controllo, innegabile e fondamentale per l'economia e
gli scambi vitivinicoli. Ciò giustifica la pubblicazione di questa guida che non costituisce
un documento di riferimento ma soltanto d'informazione. I suoi unici obiettivi sono:
- descrivere il principio delle tecniche attuate, la pratica della loro applicazione ed i
limiti del loro utilizzo
- esporre nei dettagli i metodi applicati più correnti, tenuto conto che questi sono
spesso adattati parzialmente dai laboratori in funzione dell'apparecchio utilizzato o
delle matrici attuate. L'elenco proposto non è mai restrittivo e altre applicazioni
sono possibili. Nuovi sviluppi sono regolarmente proposti.
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LINEE DIRETTRICI SUGLI AUTOANALIZZATORI COLORIMETRICI IN ENOLOGIA
Avvertenza: Questa guida non costituisce un documento di riferimento, ma solo d’informazione.
I metodi indicati nelle presenti linee direttrici non possono essere considerati come metodi di
riferimento alla stregua di quelli indicati nella Raccolta dei metodi internazionali d’analisi dei vini e
dei mosti dell’OIV o alla raccolta dei metodi internazionali d’analisi delle bevande spiritose d'origine
vitivinicola dell'OIV. Soltanto i metodi pubblicati nella Raccolta dei metodi internazionali d'analisi
dei vini e dei mosti dell’OIV o nella raccolta dei metodi internazionali d'analisi delle bevande
spiritose d'origine vitivinicola dell’OIV hanno carattere ufficiale e sono applicabili per il controllo e la
risoluzione di controversie.
Questi analizzatori automatizzano le varie fasi di un’analisi chimica o enzimatica e
utilizzano una rilevazione colorimetrica. Esistono due grandi famiglie utilizzate in
enologia:


Gli analizzatori a flusso continuo;
Gli analizzatori sequenziali.
1. GLI ANALIZZATORI FLUSSO CONTINUO
I primi lavori sull’automatizzazione dell’analisi chimica in enologia tramite flusso continuo sono stati
realizzati da MORFAUX, SARRIS et al. tra il 1969 e il 1972. Solo a partire dal 1974, tuttavia, questa
tecnica si estende ai laboratori di enologia con la messa a punto di metodi affidabili e ripetibili.
1.1 Composizione e principio di una catena di analisi automatica a flusso continuo
Una catena di analisi automatica a flusso continuo si compone di moduli separati che svolgono
ciascuno una funzione ben precisa (figura 1).
1.2 Campionatore
Comprende un vassoio che può contenere generalmente da 20 a 60 ciotole per campioni con
volume compreso tra 1 e 3 ml.
Un braccio rotante provvisto di un ago preleva i campioni uno dopo l’altro. Tra due successivi
campioni, l’ago si immerge in un liquido di risciacquo. L’ago è collegato al resto del circuito analitico
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tramite un tubo in PVC. A turno vengono aspirati con l’ago, verso il circuito analitico, il liquido di
risciacquo, un campione, poi nuovamente il liquido di risciacquo e un nuovo campione. La cadenza
dell’analisi è così regolata a livello del distributore di campione. Se l’ago preleva un campione per
un minuto poi il liquido di risciacquo per un altro minuto, la cadenza sarà di 30 campioni l’ora. Si
possono regolare a piacere sia la cadenza, sia il rapporto tra il tempo di risciacquo e il tempo di
prelievo del campione che non è necessariamente pari a 1, come nell’esempio qui sopra, ma può
essere di 2, 1/2, 1/3, 1/4, ecc.
1.3 Una pompa peristaltica
E' il cuore della catena di analisi automatica. Tutti i movimenti di liquido nel circuito analitico sono
regolati dalla pompa.
Comprende in generale da 20 a 30 canali. Ognuno è costituito da un tubo, generalmente in PVC,
schiacciato contro un supporto da una serie di rulli. L’avanzamento di questi rulli fa circolare il
liquido contenuto all’interno del tubo della pompa. La portata di ciascun tubo è funzione del suo
diametro interno. Così, utilizzando tubi di diverso diametro (da 0,005 a 0,110 cm) e a condizione
che la velocità di avanzamento dei rulli della pompa sia rigorosamente costante, si ottiene una
gamma molto vasta di portate.
Tutto questo permette di regolare in modo preciso le portate di aspirazione del campione e dei
diversi reagenti nel circuito analitico.
1.4 Una cassetta analitica
Comprende tutti gli elementi del circuito analitico. È al suo livello che il campione può essere
sottoposto a diversi trattamenti in funzione dell’analisi da realizzare:
-
diluizione;
dialisi;
aggiunta di reagente;
miscelazione;
distillazione;
passaggio a bagno-d’acqua regolata con termostato (temperatura e durata
variabile).
Una parte del circuito può essere termoregolata.
Tutti i flussi liquidi che circolano nel circuito analitico sono, al momento dell’uscita dalla pompa,
segmentati regolarmente da bolle d’aria ogni 1 o 2 centimetri. Queste bolle d’aria, grazie alle forze
di tensione superficiale, impediscono la diffusione di un composto in soluzione da una sezione di
colonna liquida compresa tra due bolle verso quella che la precede o quella che la segue. La bolla
d’aria asciuga inoltre la parete del tubo di vetro o di PVC nel quale circola.
In questo modo si eliminano tutte le contaminazioni da un campione all’altro e qualsiasi diluizione
di un campione con il liquido di risciacquo che lo precede e quello che lo segue.
Questo principio fondamentale della separazione dei liquidi tramite una bolla d’aria è utilizzato a
partire dal distributore di campioni. In effetti, al livello dell’ago di prelievo, l’aspirazione è costante;
quando l’ago passa dal bagno di risciacquo alla ciotola di campione, viene prelevata una piccola
quantità d’aria che favorisce la formazione della bolla che, nel tubo di prelievo, separa il liquido di
risciacquo dal campione.
È stata proposta una seconda generazione di materiale a flusso continuo che utilizza la tecnica del
micro-flusso, permettendo di fare a meno della segmentazione. A causa di problemi di incrostazioni
difficili da risolvere, questo tipo di materiale è tuttora poco diffuso. I principi analitici restano gli
stessi delle apparecchiature a segmentazione.
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1.5 Un rilevatore
La rilevazione più frequente è la colorimetria. La maggioranza delle analisi chimiche automatizzate
si basano su un metodo colometrico, in particolare nel campo enologico. Si possono tuttavia
utilizzare altri rilevatori:
-
spettrofotometro UV;
fotometro a fiamma;
fluorimetro;
nefelometro;
contatore di cellule;
rifrattometro;
elettrodi specifici.
1.6 Un registratore
La presenza del composto ricercato nel campione prelevato è confermata, a livello del rilevatore, da
un segnale la cui intensità è proporzionale alla concentrazione di tale composto. Questo segnale è
registrato sotto forma di picchi (fig. 2)
Il ritorno verso la linea di base tra due picchi successivi corrisponde al prelievo del liquido di
risciacquo. L’affidabilità del metodo di analisi a flusso continuo si basa sulla lettura del registratore
grazie ai seguenti principi:
1° La creazione di uno stato di equilibrio nel circuito analitico tale che il ritorno alla linea di base
è sempre ottenuto tramite prelievo del liquido di risciacquo e dal fatto che una data concentrazione
nel campione analizzato dia un picco di altezza costante.
2° Il metodo di dosaggio è un metodo comparativo. Tutte le misure sono fatte rispetto a una
curva di calibrazione dalle concentrazioni perfettamente note.
Qualsiasi funzionamento errato del circuito dà luogo a una perturbazione della registrazione (deriva
della linea di base, variazione della forma dei picchi, variazione dell’altezza dei picchi di verifica,
ecc); perciò le possibilità di analisi errata sono ridotte.
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Risposta
Tempo (min)
Fig. 2
Modello di registrazione ottenuto nel caso di dosaggio dell’acidità volatile nei vini con una
cadenza di 30 campioni ogni ora.
(i valori indicati sono espressi in g/L di acido solforico)
1.7 Interfaccia digitale
Permette la conversione del segnale analogico emesso dal colorimetro in un valore digitale che può
essere direttamente espresso in concentrazione del componsto dosato. Include, generalmente, un
sistema di controllo che permette di assicurarsi che il dosaggio non sia stato alterato.
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GLI ANALIZZATORI SEQUENZIALI
2.1 Principio e organizzazione di un analizzatore sequenziale
Questi analizzatori sono spesso multiparametrici. Possono così eseguire diversi dosaggi sullo stesso
campione e tali dosaggi possono essere programmati per ogni campione. Ogni campione da
analizzare è prelevato, messo in una vaschetta di misura trasparente, dove riceve il o i reagenti. La
misurazione colorimetrica è eseguita direttamente in questa vaschetta. Le cadenze sono comprese
tra 50 e 1000 dosaggi l’ora. Le principali applicazioni avvengono sia in analisi chimica, sia in analisi
enzimatica. I volumi di reagente necessari sono bassi, limitando i costi, in particolare per quanto
riguarda i dosaggi enzimatici. Un analizzatore sequenziale comprende vari elementi.
2.1.1 Composizione di un analizzatore sequenziale
1.6.0.1
Un vassoio di prelievo
Può contenere un numero variabile di contenitori nei quali si pongono i campioni da analizzare.
1.6.0.2
Un vassoio di reazione
È costituito da vaschette trasparenti che ricevono il prelievo effettuato sul campione da analizzare e
il o i reagenti necessari. Sono mantenute in un bagno termostatico a temperatura costante e
permettono la lettura colorimetrica. Le vaschette possono essere monouso o pulite da un
dispositivo di lavaggio prima di un nuovo utilizzo.
1.6.0.3
Un vassoio di reagenti
Contiene i serbatoi dei reagenti per preparare i dosaggi voluti. Sono posti in ambiente refrigerato,
per consentire l’utilizzo di reagenti fragili nel caso dei metodi enzimatici.
1.6.0.4
Uno o due bracci di prelievo
Permettono, con l’aiuto di un sistema di siringa automatica, di prelevare i campioni dal vassoio di
prelievo e i reagenti dal vassoio dei reagenti e di porli successivamente nella vaschetta di reazione.
1.6.0.5
Un lettore ottico
Permette una misurazione colorimetrica delle diverse vaschette di reazione, sia in momenti precisi
(per esempio, inizio e fine della reazione) sia in modo dinamico per poter stabilire una curva di
reazione per ciascuna di esse. Nel secondo caso, la misura della velocità iniziale di reazione può
essere valutata e utilizzata per il calcolo della concentrazione del composto ricercato.
1.6.0.6
Un modulo elettronico-informatico
Assicura il pilotaggio del sistema e i calcoli necessari per ottenere il risultato ricercato.
2.1.2 Schema analitico
Lo schema analitico può essere variabile. L’esempio riportato di seguito corrisponde al caso più
classico. Comporta le seguenti fasi:
Presa del campione
Dal vassoio dei campioni si preleva il campione di vino, il cui volume è determinato per ogni
dosaggio, e lo si pone in una vaschetta di reazione.
2.1.2.1 Aggiunta del primo reagente
Il primo reagente (R1) è prelevato dal vassoio dei reagenti, per un volume specifico, e aggiunto
nella vaschetta di reazione. L’insieme viene di solito omogeneizzato da un sistema agitatore.
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2.1.2.2 Temporizzazione 1
La miscela reagente è lasciata nel suo stato per una determinata durata (spesso da 4 a 6 minuti).
2.1.2.3 Misurazione dell’assorbimento
Si esegue una prima misurazione dell’assorbimento alla lunghezza d’onda richiesta. Corrisponde al
punto zero della reazione adottata e permette di tenere conto di un’eventuale influenza del colore
del vino.
2.1.2.4 Aggiunta del secondo reagente
Nella vaschetta di reazione si aggiunge il secondo reagente (R2). È lo stesso reagente che attiva la
reazione colorimetrica cercata.
2.1.2.5 Temporizzazione 2
La miscela reagente è lasciata nel suo stato per una determinata durata (spesso da 4 a 6 minuti).
2.1.2.6 Misurazione dell’assorbimento
Si esegue una seconda misurazione dell’assorbimento alla lunghezza d’onda richiesta. Permette di
misurare la variazione di assorbimento dovuta alla reazione stessa.
Questo schema di base può variare. Ad esempio, con le apparecchiature dalle prestazioni più
elevate, la misurazione dell’assorbimento può essere eseguita in modo dinamico con una lettura,
per esempio, ogni 12 secondi. Questo permette di determinare una curva di reazione e di misurare
la velocità iniziale di reazione che, in condizioni analitiche precise, può essere proporzionale alla
concentrazione del composto ricercato.
2.1.2.7 Calcolo delle concentrazioni
Per le applicazioni enologiche, il calcolo è sempre eseguito tramite calibratura con vini di
concentrazione conosciuta dell’analita o di soluzioni sintetiche dello stesso. Il numero di campioni di
calibratura può essere variabile e più elevato se la curva di reazione non è lineare.
Alcuni materiali possono utilizzare un solo reagente, eliminando così la possibilità di realizzare i
dosaggi per i quali sono necessari due reagenti distinti. In compenso, gli apparecchi che
permettono di utilizzare due reagenti possono facilmente utilizzarne uno solo, se questo è
sufficiente per il metodo considerato.
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ALLEGATO 1
ESEMPI DI METODI DI DOSAGGI ABITUALI IN ENOLOGIA CON
ANALIZZATORI AUTOMATICI A FLUSSO CONTINUO
I metodi descritti di seguito sono forniti a titolo puramente esemplificativo, poiché non sono gli
unici adoperabili.
1.Valutazione del tenore dell’acidità volatile nei vini e nei mosti
1.1 Principio
L’acidità volatile è costituita dagli acidi grassi appartenenti alla serie acetica. Gli acidi lattico,
succinico, carbonico e il biossido di zolfo sono esclusi dall’acidità volatile. Gli acidi della serie acetica
sono separati dai costituenti del vino tramite micro-distillazione a 98°C sotto corrente di azoto.
L’acido lattico è rettificato al momento della distillazione. Il biossido di zolfo è ossidato in acido
solforico con perossido d’idrogeno ed eliminato prima della fase di distillazione. L’anidride carbonica
non interferisce. Il distillato degli acidi della serie acetica viene messo in presenza di un reagente di
ossido-riduzione, le cui variazioni d’intensità colorante sono proporzionali al tenore in acidità
volatile: ioduro di potassio o blu di bromofenolo.
1.2 Apparecchiatura
Catena a flusso segmentato.
1.3 Reagenti e soluzioni
1.3.1 Soluzione di perossido d’idrogeno

perossido d’idrogeno (N° CAS[7722-84-1]) 30 al 35 % (o 110 vol.)

acqua demineralizzata fino a 200 ml.
Conservazione: 1 giorno.
0,5 ml
1.3.2 Soluzione di acido tartarico al 5%

acido tartarico (L, D o DL) cristallizzato puro 50 g

acqua demineralizzata fino a 1000 ml.
Conservazione in bottiglia leggermente colorata: 1 mese a + 4 °C.
1.3.3 Ioduro e iodato di potassio

Soluzione di KI (N° CAS[7681-11-0]) al 10% (p/v)

Soluzione di KIO3 (N° CAS[7758-05-6]) al 0,2% (p/v)
Conservazione in bottiglia leggermente colorata: 1 mese.
Si può verificare la neutralità delle soluzioni di KI e KIO3 mescolandone piccole quantità in un tubo.
La miscela deve restare incolore.
1.3.4 Blu di bromofenolo

Indicatore colorato
- Blu di bromofenolo (N° CAS[115-39-9])
- Fosfato di potassio (N° CAS[7758-1-4]) 0.1 M
- Tetraidroborato di sodio (N° CAS[16940-66-2]) 0,1 M
- Acqua distillata fino a 1000 ml.
Agitare e poi lasciare a riposo per 3 giorni, al riparo dalla luce.
330 mg
100 ml
5 ml
Prima dell’utilizzo, filtrare poi aggiustare il pH a 4,9 con la soluzione di tetraidroborato di sodio.
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1.3.5 Soluzioni di verifica (a scelta)
1.3.5.1 Soluzioni di acido acetico (N° CAS[64-19-7]) da 0,2 a 1 g·l-1 espresso in H2SO4 (da 4 a 20
meq o da 0,28 a 1,40 g·l-1 in acido acetico)
Conservazione: 1 giorno.
1.3.5.2 Vini di riferimento dal tenore in acidità volatile noto
1.4 Modo operativo
Il diagramma dei flussi è indicato in allegato.
I campioni non subiscono alcun trattamento preliminare. La cadenza di analisi può variare da 30 a
60 campioni l’ora secondo la configurazione utilizzata.
1.5 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità intra-laboratorio: 0,05 g·l-1 in H2SO4 (0,07 g·l-1 in acido acetico)
Riproducibilità inter-laboratorio: 0,10 g·l-1 in H2SO4 (0,14 g·l-1 in acido acetico)
1.6 Bibliografia
DUBERNET M. Dosage automatique de l’acidité volatile dans les vins. Connaiss. Vigne et Vin,
1976,10,3, 297-309.
PILONE G.J. Effect of lactic acid on volatile acid determination of wine. J. of Oenol. 1967,18, 149156.
SARIS J., MORFAUX J.N., DERVIN L. Détermination automatique de l’acidité volatile du vin. Ind.
Alim. Agric., 1970, 87, 115-121.
1.7 Allegati : Esempi di diagrammi di flusso
1.7.1 Blu di Bromofenolo
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1.7.2 Ioduro di potassio
2 Valutazione del tenore degli acidi L-malico e L-lattico nei vini e nei mosti
2.1 Principio
In presenza di nicotinamide-adanina-dinucleotide (NAD), l’acido è ossidato in una reazione
catalizzata dal suo enzima specifico:


la malato-deidrogenasi (MDH) nel caso dell’acido malico,
la lattato-deidrogenasi (LDH) nel caso dell’acido lattico.
Si tratta di una reazione di equilibrio che si sposta nel senso della formazione di NADH con un
tampone di idrazina basica e un eccesso di NAD
MDH
L-malato + NAD+ <==> ossalacetato di idrazone + NADH + H+
LDH
L-lattato + NAD+ <==> piruvato di idrazone + NADH + H+
La quantità di NADH è proporzionale alla concentrazione in acido del campione. Il suo assorbimento
è misurato a 340 nm.
2.2 Apparecchiatura
Catena a flusso continuo segmentato.
2.3 Reagenti
2.3.1 Brij 35 (N° CAS[9002-92-0]) 30% (p/v)
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2.3.2 Tampone pH 9,5 circa
Per 500 ml:






Glicina pura
(N° CAS[56-40-6])
Solfato di idrazina (N° CAS[10034-93-2])
EDTA (N° CAS[60-00-1])
Idrossido di sodio (N° CAS[1310-73-2])
Brij 35 30 %
Acqua bidistillata fino a 500 ml.
38 g
26 g
1,0 g
20 g
5 gocce
Filtrare se necessario. Conservazione massima 2 mesi a +4°C.
2.3.3 NAD, MDH e LHD

β Nicotinamide adenina dinucleotide (forma ridotta) (NAD) (N° CAS [53-84-9]) di purezza
≥ 98%

MDH sospensione in solfato di ammonio (N° CAS [9001-64-3])

LDH sospensione in solfato di ammonio (N° CAS [9001-60-9])
Conservazione:

Flacone MDH o LDH non iniziato a -20 °C fino alla data di scadenza.

Flacone iniziato +4 °C al massimo 6 mesi o fino alla data di scadenza.

La polvere di NAD si conserva a secco a +4 °C fino alla data di scadenza.
2.3.4 Soluzioni enzimatiche per l’analisi


Soluzione NAD a 100 mg per 10 ml d’acqua bidistillata.
Soluzione di MDH o LDH: 100 µl in 10 ml d’acqua bidistillata. Le quantità da preparare sono
in funzione della durata dell’analisi.
Conservazione: una settimana a +4 °C.
2.3.4.1.1 Soluzioni di riferimento di acido L-malico (N° CAS[97-67-6]) o L-lattico (N°
CAS[79-33-4]) da 0,5 a 5 g/l
2.4 Modo operativo
In allegato si fornisce il diagramma dei flussi.
I campioni non subiscono alcun trattamento preliminare. Nel caso di campioni contenenti materiali
in sospensione, è indispensabile una centrifugazione.
La cadenza analitica è di almeno 30 campioni l’ora con tempo di prelievo/tempo di risciacquo =
1/1.
Nota: Per i vini rossi molto colorati, si sottrarrà all’assorbimento misurato quello dovuto alla
colorazione del vino a 340 nm, con passaggio di campioni senza l’enzima nei reagenti ma
mantendo il coenzima NAD.
2.5 Espressione dei risultati
I risultati sono espressi in grammi per litro con un decimale
2.6 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità interlaboratorio: 0,15 g·l-1
2.7 Bibliografia
Battle, J.-L. et Bouvier, J.C., Automatisation de dosages enzymatiques pour l’analyse oenologique,
Revue Française d’Oenologie (Cahier Scientifique), 1986, 26, (101) : 38-43.
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Battle, J.-L., Joubert, R., Collon, Y. et Giornoet, C., Dosage enzymatique en flux continu du Lmalate et du L-lactate dans les moûts de raisin et les vins, Ann. Fais. Exp. Chim., 1978, 71(766) :
223-228.
Curvelo-Garcia, A. S., La fiabilité des méthodes de flux continu segmenté appliquées à l’analyse
des vins et des moûts, Feuillet Vert de 1’OIV n° 941 (1993).
2.8 Allegato : Esempio di diagramma dei flussi
ml/mn
3 Valutazione del tenore dell’acido tartarico nei vini e nei mosti.
3.1 Principio
Il metodo di Rebelein si applica su campioni di vino dializzati per sviluppare un colore rosso
aranciato a caldo (37°C) con il metavanadato di sodio in ambiente alcalino. L’assorbimento è
misurato a 520 nm. Forti tenori di acido malico e zucchero possono interferire.
3.2 Apparecchiatura.
Catena a flusso continuo segmentato.
3.3 Reagenti
3.3.1 Brij 35 (N° CAS[9002-92-0]) 30% p/v
3.3.2 Acido acético (CH3COOH) (N° CAS[64-19-7]) puro.
3.3.3 Soluzione di acetato di sodio (NaCH3COO) (N° CAS[127-09-3]) al 27%.
3.3.4 Vanadato di ammonio (NH4 VO3) (N° CAS[7803-55-6])
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3.3.5 Soluzione N di idrossido di sodio (NaOH) (N° CAS[1310-73-2])
3.3.6 Soluzione acida di acetato di sodio

acido acetico

acetato di sodio 27%

Poliossietilene (35) Lauril Etere 30 %

acqua distillata fino a 1000 ml
Conservazione: 1 settimana.
80 ml
320 ml
1 ml
3.3.7 Soluzione di metavanadato di sodio.

vanadato di ammonio

soluzione NaOH M

acetato di sodio 27%

acqua distillata fino a 500 ml.
Conservazione: 1 settimana.
4g
150 ml
200 ml
3.3.8 Soluzioni di riferimento di acido D(+)-tartarico (N° CAS[147-71-7]) da 1 a
8 g/l.
3.4 Modo operativo.
In allegato si riporta il diagramma dei flussi.
I campioni non subiscono alcun trattamento preliminare. Nel caso di mosti o altri campioni
contenenti materiali in sospensione, è indispensabile una centrifugazione.
La cadenza analitica è di 30 campioni l’ora (tempo di prelievo/tempo di risciacquo = 1/1).
3.5 Espressione dei risultati .
I risultati sono espressi in grammi per litro con un decimale.
3.6 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità interlaboratorio: 0,7 g·l-1
3.7 Bibliografia
Battle, J.-L., Joubert, R., Colion, Y. et Giornoet, C., Utilisation du flux continu pour le dosage
colorimétrique de l’acide tartrique dans les moûts de raisin et les vins par la méthode de Rebelein,
Ann. Fals. Exp. Chim., 1978, 71(764), 155-158.
Curvelo-Garcia, A.S., La fiabilité des méthodes de flux continu segmenté appliquées àl’analyse des
vins et des moûts, Feuillet Vert de l’OIV N°941 (1993).
Trossais J. et Asselin C. Influence des teneurs en acide malique des moûts sur le dosage de l’acide
tartrique par analyse en flux continu par colorimétrie avec le métavanadate. Conn. Vigne Vin.
1985, 19, 4, 249-259.
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3.8 Allegato: Esempio di diagramma dei flussi
4 Valutazione del tenore dell’acido citrico nei vini e nei mosti
4.1 Principio
Il metodo automatico per la determinazione fluorimetrica dell’acido citrico è basato sul
metodo della dicicloesilcarbodiimide (DCC). Il campione reagisce con la DCC in presenza di
acido acetico in ambiente anidro, che provoca la formazione di aconitina.
La lunghezza d’onda di trasmissione dell’aconitina è di 490 nm, mentre la lunghezza d'onda
di eccitazione è di 400 nm. Il segnale dato dal fluorimetro viene inviato a un’interfaccia
collegata al software di sistema.
4.2 .Apparecchiatura
Catena a flusso segmentato.
4.3 Reagenti e soluzioni
4.3.1 Soluzione di cloruro di sodio (NaCI)
Cloruro di sodio (NaCl) N° CAS [7647-14-5], 4,0 g
Acido acetico (CH3COOH) N° CAS[64-19-7], 180 cm3
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Etanolo (CH3CH2OH) N° CAS[64-17-5], 20 cm3
Soluzione di acido citrico 10,0 g/dm3, 30 cm3
Acqua di tipo I (Norma ISO 3696) o equivalente fino a 2000 cm3
Brij 35 (30%) N °CAS [9002-92-0], 6 cm3
Preparazione:
In una fiala graduata da 2000,0 cm3, sciogliere il cloruro di sodio in circa 1600 cm3
d'acqua. Aggiungere delicatamente l’acido e lasciare a riposo fino a raggiungimento della
temperatura ambiente. Aggiungere l’etanolo e la soluzione di acido citrico e mescolare.
Aggiungere fino alla marcatura dell’acqua demineralizzata, quindi il Brij e mescolare.
Conservazione: 6 mesi
4.3.2 3. 2-1-butanolo (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3]
4.3.3 Soluzione di acido acetico all’1,7% (v/v)
Acido acetico (CH3COOH) N° CAS[64-19-7], 17 cm3
1-butanolo (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3] fino a 1000 cm3
Preparazione:
Nel flacone 1-butanolo (1 litro), aggiungere con precauzione l’acido. Mescolare bene.
Conservazione: 1 anno.
4.3.4 Soluzione Dicicloesilcarbodiimide (DCC)
Dicicloesilcarbodiimide (C13H22N2) N° CAS [538-75-0], 41 g
1-butanolo (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3] fino a 1000 cm3
Preparazione:
Pesare la Dicicloesilcarbodiimide in una fiala conica da 1000 cm3 e aggiungere l’nbutanolo. Mescolare bene.
Conservazione: 1 anno.
4.3.5 Brij 35 N° CAS [9002-92-0]
4.3.6 Soluzione di decontaminazione
1-butanolo (CH3(CH2)3OH) N° CAS [71-36-3]
4.4 Preparazione del campione
Disaerare il campione per eliminare il più possibile il biossido di carbonio tramite lo
spazio vuoto, agitando per almeno 2 minuti. Se il campione è torbido, è necessario
filtrarlo.
4.5 Soluzioni di verifica
4.5.1 Soluzioni di acido citrico (C6H8O7) N° CAS[77-92-9], da 0,07 a 1,00 g/dm3 in acido
citrico
Conservazione: la stabilità è data dal controllo interno della verifica.
4.5.2 Campioni di controllo di concentrazione conosciuta dell’acido citrico.
Conservazione: 1 mese o dal controllo interno
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4.6 Modo operativo
In allegato si riporta il diagramma dei flussi. La cadenza di analisi è di circa 18 campioni
l’ora secondo la configurazione utilizzata.
4.7 Risultati
I risultati sono presentati a due decimali ed espressi in g (acido citrico) ·l-1.
4.8 Caratteristiche del metodo descritto
Ripetibilità: 0,03 g (acido citrico)· l-1
Riproducibilità intralaboratorio: 0,03 g (acido citrico) ·l-1
Incertezza: uexp = 0,20 x concentrazione del campione in g (acido citrico) ·l-1.
4.9 Allegato: Esempio di diagramma dei flussi
Pompes Debits
Evier
ml/min
Fluorimètre
Émission 490 nm
L'extinction à 400 nm
2 mm d'épaisseur de cellule
Acide acétique
DCC
air
n-butanol
air
chlorure de sodium
échantillon
Sampler
evier
evier
o
* Membrane de dialyse, Ref SA5283
** Tubes à la bombe en aciflex
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5 Valutazione del tenore degli zuccheri riduttori nei vini e nei mosti
5.1 Principio
Il metodo di dosaggio permette di determinare separatamente la concentrazione in glucosio e in
fruttosio o la somma di queste due concentrazioni nei vini o nei mosti.
5.1.1 Fosforilazione del glucosio e del fruttosio
Questa reazione è catalizzata tramite esochinasi (HK):
HK
glucosio + ATP <==> glucosio-6-fosfato + ADP (1)
HK
fruttosio + ATP <=> fruttosio-6-fosfato +ADP
ATP :
ADP :
adenosina trifosfato
adenosina difosfato
5.1.2 Ossidazione del glucosio-6-fosfato (G-6-P)
Si ottiene tramite l’azione della nicotinamide adenina dinucleotide fosfato (NADP), in presenza del
suo enzima specifico glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PDH).
G6PDH
G-6-P + NADP+ <==> gluconato-6-fosfato + NADPH + H+ (2)
La reazione d’equilibrio è spostata nel senso della formazione di NADPH, grazie alla scelta delle
condizioni operative (tampone pH 7,6 e eccesso di NADP). Il NADPH proporzionale alla
concentrazione in glucosio nel campione è dosato misurando il suo assorbimento a 340 nm.
5.1.3 Isomerizzazione del fruttosio-6-fosfato
Questa reazione permette di dosare la somma glucosio + fruttosio.
L’enzima utilizzato è il fosfoglucosio-isomerasi (PGI).
PGI
fruttosio-6-fosfato <==> glucosio-6-fosfato
(3)
Il glucosio-6-fosfato formato reagisce con il NADP secondo (2) per formare NADPH, che si dosa a
340 nm.
5.2 Apparecchiatura
Catena a flusso continuo segmentato.
5.3 Reagenti e soluzioni
Esistono sul mercato numerosi fornitori che propongono cofanetti contenenti i reagenti preparati.
Qui di seguito sono forniti alcuni esempi tra i tanti.
5.3.1 Flacone 1:
Liofilizzato composto di:





Tampone trietanolammina pH = 7,6
NADP (N° CAS[53-59-8])
64 mg
ATP (N° CAS[987-65-5])
16O mg
Solfato di magnesio MgSO4 (N° CAS[7487-88-9])
Stabilizzatori
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5.3.2 Flacone 2:
0,7 ml di sospensione enzimatica composta da:


Esochinasi (N° CAS[9001-51-8]) circa 200 U
Glucosio-6-fosfato deidrogenasi (N° CAS[9001-40-5]) 100 U in soluzione in solfato
d’ammonio
5.3.3 Flacone 3 :
0,7 ml di fosfoglucosio-isomerasi (N° CAS[9001-41-6]) (circa 490 U) in sospensione in solfato
d’ammonio.
5.3.4 Flacone 4 :
7 ml di soluzione standard di D-glucosio (N° CAS[50-97-7]) a 0,5 g-1. Conservazione del cofanetto
non iniziato a -20 °C fino alla data di scadenza.
5.3.5 Soluzione tampone NAD/ATP
Si prepara a partire dal cofanetto enzimatico:
Sciogliere il contenuto del flacone 1 in 90 ml di acqua bidistillata.
Conservare il tampone diluito a -20 °C al massimo per 3 mesi.
5.3.6 Preparazione di soluzioni di enzimi per il dosaggio
Esempio di volumi da preparare per la configurazione:
Dosaggi
Fruttosio e glucosio + fruttosio
Durata dell’analisi
1 ora
4 ore
8 ore
Glucosio
tampone NAD/ATP
15 ml
60 ml
120 ml
HK/G6PDH
100 µl
500 µl
1000 µl
PGI
100 µl
500 µl
1000 µl
Il dosaggio del fruttosio richiede due passaggi dei riferimenti e campioni, il tempo di analisi
raddoppia rispetto al dosaggio del glucosio.
Conservazione delle soluzioni di enzimi per il dosaggio: una settimana a +4°C.
5.3.7 Soluzioni campione
5.3.7.1 Soluzione madre a 10,0 g/l
L’utilizzo del solo glucosio è sufficiente per la campionatura: l’isomerizzazione del fruttosio si
eseguirà unicamente per i campioni.



D-glucosio anidro
2,50 g
Acqua distillata fino a 250 ml
Isotiocianato d’allile (conservante) (N° CAS[57-06-7]) 2 gocce.
5.3.7.2 Soluzioni derivate di glucosio:



Queste
Campione da 3 g/l : 15 ml di soluzione madre in una fiala da 50 ml
Campione da 2 g/l : 10 ml di soluzione madre in una fiala da 50 ml
Campione da 1 g/l : 10 ml di soluzione madre in una fiala da 100 ml
soluzioni sono poi completate fino alla tacca di gradazione con acqua distillata.

Campione da 0,50 g/l: soluzione standard del cofanetto enzimatico
Conservazione: a + 4 °C per 1 mese.
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5.4 Modo operativo
In allegato si riporta il diagramma dei flussi.
La cadenza analitica è di 60 campioni ogni ora con un tempo di prelievo/risciacquo = 1/1.
I campioni non subiscono alcun trattamento preliminare. Nel caso di mosti o campioni contenenti
materiali in sospensione, è indispensabile un filtraggio preliminare.
5.5 Espressione dei risultati
La concentrazione in glucosio, in fruttosio o in glucosio + fruttosio è data in g·l-1 con un decimale.
5.6 Bibliografia
Battle J.L., Bouvier J.C. Rev. Fr. Oenol., 1986, 101, 38-43.
5.7 Allegato: esempio di diagramma dei flussi
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6 Valutazione del tenore del biossido di zolfo libero e totale nei vini e nei mosti dopo dialisi.
6.1 Principio
Dopo l’acidificazione del vino, il biossido di zolfo libero si diffonde attraverso una membrana di
dialisi. Il biossido di zolfo combinato è liberato con una idrolisi alcalina. I due dosaggi si effettuano
a 560 nm in presenza di para-rosanilina (o fucsina basica). La segmentazione si esegue con l’azoto
per evitare qualsiasi ossidazione.
SO2 + rosanilina —> complesso incolore + formaldeide —> complesso colorato.
Il metodo è applicabile per una gamma dal LOQ a 200 mg·l-1.
6.2 Apparecchiatura
Catena a flusso segmentato.
6.3 Reagenti e soluzioni
6.3.1 Reagente specifico per il dosaggio del biossido di zolfo libero
6.3.1.1 Soluzione al 10 % di acido solforico (purezza 98%)


H2SO4 (N° CAS[57-06-7])
20 ml
Acqua distillata fino a 200 ml.
6.3.2 Reagenti specifici per il dosaggio del biossido di zolfo totale
6.3.2.1 Soluzione di idrossido di sodio 4 M

NaOH (N° CAS[1310-73-2])
40 g

Acqua distillata fino a 250 ml.
Conservazione: 1 settimana.
6.3.2.2 Soluzione di acido solforico (N° CAS[57-06-7]) al 1/2 (v/v)
Conservazione: 1 mese.
6.3.3 Reagenti comuni
6.3.3.1 Azoto tipo R (N° CAS[7727-37-9])
6.3.3.2 Soluzione di acido solforico (N° CAS[57-06-7]) a 1% (v/v)
Conservazione: 1 mese.
6.3.3.3 Soluzione di formaldeide al 6% (v/v)

Formaldeide al 37% minimo (N° CAS[50-00-0])

Acqua distillata fino a 200 ml.
Conservazione: 1 giorno in flacone chiuso.
1,2 ml
6.3.3.4 Rosanilina (reagente colorato).

Soluzione madre: 2 g/l di fucsina basica (o cloridrato di rosanilina) (N° CAS[632-99-5])
Agitare, poi lasciare a riposo per 3 giorni e conservare al riparo dalla luce.
Conservazione: 3 mesi in bottiglia leggermente colorata.
Soluzione di lavoro
soluzione madre
40 ml
acido ortofosforico (N° CAS[7664-38-2])
62 ml
acqua distillata fino a 500 ml.
Conservazione: 2 settimane in bottiglia leggermente colorata.
Nota: Questa preparazione è fortemente esotermica. Adottare le precauzioni d’uso.
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6.3.4 Soluzioni campione sintetiche
6.3.4.1 Soluzione acida a pH 3 circa.
H2SO4 1 % (N° CAS[57-06-7])
5ml
Acqua distillata fino a
1000 ml.
Questa soluzione servirà a completare le fiale campione di SO2.
Conservazione: 1 giorno.
6.3.4.2 Soluzione madre a 300 mg·l-1 di SO2
Disolfito di sodio puro (N° CAS[7681-57-4])
soluzione pH 3 fino a 500 ml.
227 mg
Conservazione: 1 giorno.
6.3.4.3 Soluzioni campione derivate.
Esempio di preparazione di una soluzione campione a 120 mg·l-1:
soluzione madre a 300 mg·l-1
soluzione pH3
acqua distillata fino a
50 ml
40 ml
125 ml.
6.3.5 Vini di riferimento
Vini di riferimento o controllati con il metodo di riferimento.
6.4 Modo operativo
In allegato si forniscono i diagrammi dei flussi. I campioni non subiscono alcun trattamento
preliminare. La cadenza analitica può arrivare a 60 campioni ogni ora con un tempo
risciacquo/prelievo = 2/1
Nota:
Al termine dell’analisi, sciacquare il circuito analitico con l’acqua per almeno 10 min.
Ogni qualvolta sia necessario, lavare il circuito con candeggina a 1/20 per almeno 30 minuti.
Sciacquare con acqua per almeno 2 h.
6.5 Espressione dei risultati
I valori in biossido di zolfo si esprimono in mg per litro senza decimali.
6.6 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità inter-laboratorio diossido di zolfo libero: 7 mg·l-1
Riproducibilità inter-laboratorio diossido di zolfo totale: 27 mg·l-1
6.7 Bibliografia
DUBERNET M., 1997. L’automatisation de l’analyse chimique en œnologie. Revue Française
d’Œnologie, 66, 45-61.
Scholten G., Woller R., Holbach B. Automatisierte weinanalyse, 2. Mittteilung. Die Wein. Wiss.,
1982, 38, 397-426.
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6.8 Allegato : Esempi di diagramma dei flussi
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7 Valutazione del tenore del biossido di zolfo libero e totale nei vini e nei mosti tramite
distillazione
7.1 Principio
Si utilizza diffusamente anche un’alternativa al metodo precedente. Consiste nel sostituire la dialisi
con una distillazione in una micro colonna. Nel caso del biossido di zolfo totale, non si esegue più
l’idrolisi alcalina: la liberazione della totalità del biossido di zolfo è assicurata da un’acidificazione
più spinta e da una temperatura di distillazione superiore.
7.2 Reagenti e soluzioni
7.2.1 Reagente specifico per il dosaggio del biossido di zolfo libero
7.2.1.1 Soluzione all’1% di acido solforico (purezza 98%)


2 ml
H2SO4 (N° CAS[57-06-7])
Acqua distillata fino a 200 ml.
7.2.2 Reagenti specifici per il dosaggio del biossido di zolfo totale
7.2.2.1 Soluzione di acido solforico (N° CAS[57-06-7]) al 20 % (v/v)
Conservazione: 1 mese.
7.2.3 Reagenti comuni
7.2.3.1 Azoto tipo R (N° CAS[7727-37-9])
7.2.3.2 Soluzione di acido solforico (N° CAS[57-06-7]) all’1% (v/v) con aggiunta di 4 gocce
ogni litro di tensioattivo Brij 35 (N° CAS[9002-92-0])
Conservazione: 1 mese.
7.2.3.3 Soluzione di formaldeide

Formaldeide al 40% (N° CAS[50-00-0])

Acqua distillata fino a 1000 ml.
Conservazione: 1 giorno in flacone chiuso.
10 ml
7.2.3.4 Soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 0,2 M
Idrossido di sodio (N° CAS[1310-73-2])
Brij 35 (N° CAS[9002-92-0])
Acqua distillata fino a 500 ml.
4g
2 gocce
7.2.3.5 Rosanilina (reagente colorato)

Soluzione madre: 2 g/l di fucsina basica (o cloridrato di rosanilina) (N° CAS[632-99-5])
Agitare poi lasciare a riposo per 3 giorni e conservare al riparo dalla luce.
Conservazione: 3 mesi in bottiglia leggermente colorata.
Soluzione di lavoro
soluzione madre
70 ml
acido ortofosforico H3PO4 (N° CAS[7664-38-2])
70 ml
acqua distillata fino a 500 ml.
Conservazione: 2 settimane in bottiglia leggermente colorata.
Nota: Questa diluizione è fortemente esotermica. Adottare le precauzioni d’uso.
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7.2.4 Soluzioni campione sintetiche
7.2.4.1 Soluzione acida con pH 3 circa.
H2SO4 1 % (N° CAS[57-06-7])
Acqua distillata fino a
5 ml
1000 ml.
Questa soluzione servirà a completare le fiale campione di SO2.
Conservazione: 1 giorno.
7.2.4.2 Soluzione madre a 300 mg·l-1 di SO2
Bisolfito di sodio puro Na2S2O5 (N° CAS[7681-57-4])
soluzione pH 3 fino a 500 ml.
227 mg
Conservazione: 1 giorno.
7.2.4.3 Soluzioni campione derivate.
Esempio di preparazione di una soluzione campione a 120 mg·l-1:
soluzione madre a 300 mg·l-1
soluzione pH3
acqua distillata fino a
50 ml
40 ml
125 ml.
7.2.5 Campioni di vini
Vini di riferimento o controllati con il metodo di riferimento.
7.3 Espressione dei risultati
I valori in biossido di zolfo si esprimono in mg per litro senza decimali.
7.4 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità inter-laboratorio diossido di zolfo libero: 7 mg·l-1
Riproducibilità inter-laboratorio diossido di zolfo totale: 27 mg·l-1
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7.5 Allegato: Esempi di diagrammi dei flussi
Dosaggio del biossido di zolfo libero
Cadenza: 90 camp. / ora
Rapporto
prelievo /risciacquo: 1/1
Colonna di
distillazione
5 giri
Azoto per
alimentazione
Portata: 40 ml/mn
Refrigerante
(acqua fredda)
Pompa
ml/mn
0,16
1,40
H2SO4 1%
0,05
20 giri
Azoto per segmentazione
1,60
NaOH 0,2 M
0,05
lavello
5 giri
5 giri
Colorimetro
560 nm
5 giri
2,50
Azoto per segmentazione
0,60
1,20
0,32
Bagno-maria
48° C ± 5° C
Campione
0,32
H2SO4 1% + Brij
Formaldeide
Para-rosanilina
0,80
Ripristino colorimetro
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Dosaggio del biossido di zolfo totale
Colonna di
distillazione
Refrigerante
(acqua fredda)
Azoto per
alimentazione
Portata: 40
Bagno-maria
105° C ± 5° C
Cadenza: 90 camp. / ora
Rapporto
prelievo /risciacquo: 1/1
Pompa
ml/mn
0,16
1,40
0,05
20 giri
lavello
colorimetro
560 nm
3 x 20 giri
5 giri
Campione
H2SO4 10%
Azoto per segmentazione
1,40
NaOH 0,2
0,05
Azoto per segmentazione
2,00
0,60
1,20
0,32
0,32
H2SO4 1% + Brij
Formaldeide
Para-rosanilina
0,80
Ripristino colorimetro
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ALLEGATO 2
ESEMPI DI METODI DI DOSAGGI ABITUALI IN ENOLOGIA
CON ANALIZZATORI SEQUENZIALI
I metodi descritti di seguito sono forniti a titolo puramente esemplificativo, poiché non sono gli
unici adoperabili.
1 Dosaggio dell’acido acetico nei vini e nei mosti
1.1 Principio
Metodo enzimatico.
In presenza di ATP, l’acido acetico si trasforma in acetil-fosfato con una reazione catalizzata tramite
l’acetato chinasi.
(1) Acetato + ATP
—Acetato chinasi
Acetil-fosfato + ADP
L’ADP formato da questa reazione è ritrasformato in ATP tramite reazione con fosfoenolpiruvato in
presenza di piruvato chinasi.
(2) ADP + fosfoenolpiruvato —Piruvato chinasi
Piruvato + ATP
Il piruvato è ridotto in L-lattato tramite la nicotinamide-adenina-nucleotide ridotta (NADH) in
presenza di lattato-deidrogenasi.
(3) Piruvato + NADH + H+
—Lattato deidrogenasi
Lattato + NAD+ + H2O
La quantità di NADH ossidato in reazione (3) è determinata dalla misura dell’assorbimento a 340
nm, ed è proporzionale alla concentrazione del vino in acido acetico.
Una quarta reazione permette di mantenere l’equilibrio della reazione 1 nel senso della formazione
di acetilfosfato tramite eliminazione di quest’ultimo.
(4) Acetil-fosfato + CoA
—Fosfotransacetilasi
Acetil-CoA + Fosfato inorganico
All’ambiente di reazione si aggiunge polivinilpirrolidone (PVP) per eliminare le interferenze dovute
ai composti fenolici del vino.
1.2 Reagenti
1.2.1 Preparazione del tampone MOPS
Aggiungere:
13 g di MOPS (Acido N-morfolino-3-propano sulfonico) CAS [1132-61-2]
500 mg di Cloruro di magnesio, 6H2O - CAS [7791-18-6]
1,5 g di Cloruro di potassio (KCl) - CAS [7447-40-7]
250 ml di acqua bidistillata
Aggiustare il pH a 4,75 con una soluzione 1,5 M di idrossido di potassio (KOH) - CAS [1310-58-3].
Attendere 5 minuti e riaggiustare nuovamente il pH a 7,45.
Riempire fino a 300 ml con acqua bidistillata.
Stabilità del tempone: 60 giorni a ± 4 °C.
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1.2.2 Preparazione dei reagenti
1.2.2.1 Reagente 1 (R1) :
Aggiungere a 100 ml di tampone MOPS 400 mg di Polivinilpirrolidone (PVP) - CAS [9003-39-8].
1.2.2.2 Reagente 2 (R2)
Aggiungere a 100 ml di tampone MOPS :
Da 300 a 350 mg di adenosina-5-trifosfato, sale disodico (ATP) - CAS [987-65-5]
50 mg di Fosfo-enolpiruvato di tricicloesilammonio (PEP) - CAS [35556-70-8]
38 mg di β Nicotinamide adenina dinucleotide (forma ridotta) (NADH) - CAS [606-68-8] - Purezza
≥ 98%
25 mg di Sale di trilitio di coenzima A - CAS [18439-24-2] –purezza 2
400 unità circa di piruvato chinasi (PK) - CAS [9001-60-9] e Lattato deidrogenasi (LDH) - CAS
[9001-60-9]
600 unità circa di di Fosfotransacetilasi (PTA) - CAS [9029-91-8]
230 unità di Acetato chinasi (AK) - CAS [9027-42-5]
Stabilità del reagente: circa 12 ore a + 4 °C.
1.3 Preparazione dei campioni
I campioni dei vini sono precedentemente diluiti al 1/10.
1.4 Procedura analitica
Può variare in funzione del materiale utilizzato. La seguente descrizione deve essere considerata
come esempio.
Il volume delle vaschette di reazione è di 300 µl. Il ciclo analitico è di 10 minuti, ossia 50 giri del
vassoio di reazione. Ogni 12 secondi, ossia a ogni giro del vassoio di reazione, si esegue una
lettura colorimetrica per poter tracciare la curva di reazione.
1.4.1 Programmazione
La lunghezza d’onda di lettura è di 340 nm.
Il volume di campione diluito al 1/10, aggiunto al tempo zero è di 20 µl.
Il volume di reagente R1 aggiunto a tempo zero è di 111 µl.
Il volume di reagente R2 aggiunto allo scadere di 5 minuti è di 125 µl.
Il volume di reazione totale è quindi di 256 µl.
1.4.2 Taratura
La taratura è realizzata in 4 punti. Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione al 9‰ di
cloruro di sodio - CAS [7647-14-15]. Gli altri tre agenti di taratura sono soluzioni con
concentrazioni crescenti di acido acetico puro - CAS [64-19-7] (0,25 g·l-1 ; 0,50 g·l-1 ; 1 g·l-1) o di
vini campione con concentrazione nota di acido acetico.
1.4.3 Risultati
La figura riportata qui sotto fornisce un’illustrazione della curva di reazione ottenuta.
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Nelle condizioni della misurazione adottata, la curva di reazione osservata dopo l’aggiunta del
reagente R2, nella scala di lavoro considerata (da 0 a 1 g/l) è una retta. Rivela la velocità iniziale di
reazione, proporzionale alla concentrazione di acido acetico. La misura della pendenza di questa
retta si può fare con una lettura in due momenti ai giri n° 27 e n° 50. Il valore della concentrazione
di acido acetico sarà dato dalla formula:
C = K (L1-L2)
Nella quale K è un fattore di reazione calcolato dall’apparecchio dopo ogni taratura secondo la
formula seguente:
K
CEt  CB
AEt  AB
Dove:
AB = assorbanza del bianco
CB = concentrazione del bianco
AEt = assorbanza del campione
CEt = concentrazione del campione
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I risultati sono espressi in g·l-1 di acido acetico.
1.5 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità intralaboratorio: 0,04 g·l-1
Riproducibilità interlaboratorio: 0,10 g·l-1
1.6 Bibliografia
DONECHE B., et SANCHEZ P.J., 1985 : Automatisation en flux continu du dosage enzymatique
de l’Acido aceticodans les vins, Connaissance de la vigne et du vin, 1985 ; n°3, 161-169.
DUBERNET M., PENNEQUIN F. et GRASSET F., 1997 Adaptation du dosage de l’Acido
aceticodans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717, Feuillet vert OIV N°1001
McCLOSKEY Leo P., 1980 : An improved enzymatic assay for acetate in juice and wine, Am. J.
Enol. Vitic. Vol 31, N° 2, 1980, pp 170-173.
2 Dosaggio del biossido di zolfo totale nei vini e nei mosti
2.1 Principio
Metodo chimico
Il campione da dosare è diluito in una soluzione tampone di fosfato con pH8. Dopo la
stabilizzazione, il mezzo di reazione riceve una soluzione tamponata di acido DTNB (5,5’-Ditiobis(2-acido nitrobenzoico) (3,3’-6) o Bis(3-Carbossi-4-nitrofenil) disolfuro, conosciuta con il nome
di «reagente di Ellman». Si tratta di un reagente specifico che permette la modifica e la rilevazione
quantitativa dei legami disolfuri la cui formula sviluppata è fornita qui sotto:
O
OH
O2N
S
S
NO2
O
OH
La reazione sviluppa una colorazione gialla misurabile a una lunghezza d’onda di 405 nm.
2.2 Protocollo di misurazione
2.2.1 Materiale
Può essere usato qualsiasi materiale di analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di due reagenti e
che consenta una misurazione a 405 nm.
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2.2.2 Reagenti
Si adottano due reagenti:
Reagente 1
K2HPO4 (CAS [7758-11-4])
Acqua bidistillata
17,4 g
fino a 1000 ml
Il pH della soluzione tampone così preparata è aggiustato con l’aggiunta di H3PO4 puro (CAS [766438-2]) per ottenere un valore di 8 (scarto minimo tollerabile: ± 0,2 unità pH).
Reagente 2
DNTB (CAS [69-78-3])
Reagente 1
Etanolo puro
760 mg
900 ml
100 ml
2.2.3 Implementazione
La seguente tabella riassume le diverse quantità di campioni di vino e di reagenti da aggiungere
nella vaschetta di reazione durante il tempo dell’analisi:
Tempo in
minuti
0
5
Campione in
µl
8
Reagente 1 in
µl
80
Reagente 2 in
µl
Acqua bidistillata
in µl
170
80
La lettura dell’assorbimento a 405 nm si esegue regolarmente durante un periodo di tempo della
durata totale di 10 minuti, ma che può essere eventualmente abbreviato tenuto conto della rapidità
di reazione che è praticamente istantanea. Il grafico seguente mostra il tipo di curva di reazione
ottenuta:
Courbe réactionnelle
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
588
564
540
516
492
468
444
420
396
372
348
324
300
276
252
228
204
180
156
132
84
108
60
36
12
0
Temps en secondes
Dopo l’aggiunta del reagente N° 1, la stabilizzazione è rapida. L’aggiunta del reagente N° 2
contenente il DNTB è seguita da una reazione colorata immediata il cui plateau viene raggiunto in
pochi secondi. In seguito rimane stabile. La lettura si esegue per differenza tra assorbimento DO 1
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rilevato dopo la stabilizzazione del reagente N°1 e l’assorbimento DO 2 rilevato sul plateau. Questa
differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di SO2 totale del campione esaminato.
La taratura è realizzata sia con vini campione i cui valori di SO2 totale sono noti e coprono la
gamma di misurazione considerata, sia con l’aiuto di soluzioni di metabisolfito di potassio
(N° CAS[16731-55-8]) stabilizzate in mezzo solforico all’1% e di concentrazione nota. In generale,
non essendo la curva di taratura del tutto lineare, occorrono da 4 a 5 punti di taratura. Il valore
zero si ottiene utilizzando una soluzione di cloruro di sodio (N° CAS[7647-14-5]) al 9‰.
2.3 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità intra-laboratorio: 12 mg·l-1
Riproducibilità inter- laboratorio: 20 mg·l-1
2.4 Bibliografia
ELLMAN G.L., 1959. For the modification and quantitative detection of sulfhydryl groups ; Arch.
Biochem. Biophys. 82,70.
DUBERNET M., LEBOEUF J.P. et GRASSET F., 1998. Méthode automatisée de dosage colorimétrique
du dioxyde de soufre total dans les vins. FV N° 1068 OIV.
DUBERNET M., PENNEQUIN F. et GRASSET F., 1995. Adaptation du dosage du dioxyde de soufre
total dans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717. FV N° 997 OIV.
3 Dosaggio del biossido di zolfo libero nei vini e nei mosti
3.1 Principio
Metodo chimico
Il biossido di zolfo libero è stabilizzato in mezzo acido. Il suo dosaggio è assicurato tramite lo
sviluppo, in presenza di formaldeide, di una colorazione rosa in combinazione con la Fucsina
precedentemente decolorata in mezzo fosforico. Il dosaggio è corretto da una reazione parassita
dovuta ai componenti fenolici presenti nel vino.
3.2 Materiale
Può essere usato qualsiasi materiale di analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di due reagenti e
che consenta una misurazione a 570 nm.
3.3 Reagenti
Si adottano due reagenti:
3.3.1 Reagente 1
3.3.1.2 Soluzione madre di Fucsina basica (Cloridrato di rosanilina)
Cloridrato di rosanilina (N° CAS[632-99-5])
Acqua bidistillata fino a
2g
1000 ml
Conservazione: 6 mesi nel frigorifero
3.3.1.2 Soluzione di lavoro (R1)
Soluzione madre di Fucsina basica
Acido fosforico (CAS [7664-38-2]) al 10%
Acqua bidistillata
3 ml
77 ml
20 ml
Conservazione: 5 giorni a 4° C e al riparo dalla luce.
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3.3.2 Reagente 2
Formaldeide (N° CAS[50-00-0])
Acqua bidistillata
fino a
5 ml
1000 ml
Conservazione: 1 settimana a temperatura ambiente.
3.4 Preparazione dei campioni
I campioni di vino non sono diluiti. Si raccomanda di procedere all’analisi il più rapidamente
possibile dopo il prelievo per evitare le perdite di biossido di zolfo libero.
3.5 Procedura analitica
La lunghezza d’onda della lettura è di 570 nm.
La sequenza analitica è la seguente:
Giro
Giro
Giro
Giro
Giro
1 (6 secondi): prelievo dal campione di vino di 20 µl
1 (12 secondi): aggiunta di 250 µl di reagente R1
24 (288 secondi): lettura DO1 a 570 nm
25 (300 secondi): aggiunta di 106 µl di reagente R2
28 (336 secondi): lettura DO2 a 570 nm
3.6 Taratura
Si realizza in due punti. Il valore zero è ottenuto con l’utilizzo di una soluzione di cloruro di sodio
(N° CAS[7647-14-5]) al 9‰. Il valore standard è dato da una soluzione regolarmente titolata di
metabisolfito di potassio (N° CAS[16731-55-8]) stabilizzata in mezzo solforico all’1% e dalla
concentrazione di 50 mg·l-1 circa.
3.7 Lettura dei risultati
Il seguente schema mostra l’evoluzione dell’assorbanza a 570 nm.
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Si è constatato che la miscela di vino con la soluzione di fucsina provoca una prima reazione
colorata che porta a un aumento dell’assorbimento (reazione N° 1). L’importanza di quest’ultimo è
proporzionale alla ricchezza di componenti fenolici nel vino e rappresenta un effetto parassita. La
reazione N°2 interviene dopo l’aggiunta del reagente R2 e corrisponde strettamente alla
combinazione del biossido di zolfo libero e della fucsina. Si deve tenere conto solo quest’ultima. La
lettura si ottiene per differenza tra l’assorbimento di base DO 1 e l’assorbimento DO 2. Questa
differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di SO2 libero del campione preso in
considerazione.
3.8 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità intra-laboratorio: 6 mg·l-1
Riproducibilità inter-laboratorio: 12 mg·l-1
3.9 Bibliografia
DUBERNET M., PENNEQUIN F. et GRASSET F., 1995. Dosage du dioxyde de soufre libre dans les
vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717. FV N° 998 OIV.
4 Dosaggio del glucosio e del fruttosio nei vini e nei mosti
4.1 Principio
Metodo enzimatico
Il glucosio e il fruttosio sono fosforilati in presenza di adenosina trifosfato (ATP). La reazione è
catalizzata tramite l’esochinasi (HK) e produce rispettivamente glucosio-6-fosfato (G6P) e fruttosio6-fosfato (F6P).
HK
1) Glucosio + ATP ------> G6P + ADP
HK
2) Fruttosio + ATP ------> F6P + ADP
Il glucosio-6-fosfato è ossidato in gluconato-6-fosfato in presenza di nicotinamide-adenosinadinucleotide (NAD). La reazione è catalizzata con glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PDH).
G6PDH
3) G6P + NAD -----> gluconato-6-fosfato + NADH + H+
Il fruttosio-6-fosfato è trasformato in glucosio-6-fosfato in presenza di fosfoglucosio isomerasi
(PGI)
PGI
4) F6P -----> G6P
L’aumento dell’assorbimento alla lunghezza d’onda di 340 nm è proporzionale alla quantità di Dglucosio e D-fruttosio presente.
4.2 Materiale
Si può usare qualsiasi materiale per analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di due reagenti e che
consenta una misurazione a 340 nm.
4.3 Reagenti
I reagenti utilizzati sono abitualmente forniti dai fabbricanti sotto forma di cofanetto enzimatico che
ne facilita l’utilizzo da parte dei laboratori. Si riporta qui sotto un esempio.
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Reagente 1 (30 ml)
Soluzione tampone pH 7,5
NAD (N° CAS[53-84-9])
ATP (N° CAS[987-65-5])
70 mg
90 mg
Reagente 2 (0,6 ml)
HK (N° CAS[9001-51-8]) 160 U e G6PDH (N° CAS[9001-40-5]) 200 U
Reagente 3 (0,6 ml)
PGI (N° CAS[9001-41-6]) 380 U
Il reagente unico utilizzato nell’apparecchiatura è preparato con l’aggiunta dei 3 reagenti del
cofanetto ai quali si aggiungono 900 mg di PVP (Polivinilpirrolidone) (N° CAS[9003-39-8]). Nel caso
citato, permette di realizzare circa 600 test. La sua conservazione è di 1 mese a +8° C.
4.4 Preparazione dei campioni
I campioni di vino sono diluiti 10 volte. I campioni di mosto sono diluiti in modo da ottenere una
concentrazione iniziale inferiore a 1 g·l-1.
4.5 Procedura analitica
La lunghezza d’onda di lettura è di 340 nm.
La sequenza analitica è la seguente:
Giro
Giro
Giro
Giro
1 (6 secondi): prelievo di un campione di vino di 5 µl
1 (12 secondi): aggiunta di 50 µl di reagente e 200 µl di acqua demineralizzata
1: lettura dell’assorbanza DO1 a 340 nm
50 (600 secondi): lettura dell’assorbanza DO 2 a 340 nm
4.6 Taratura
Si esegue in quattro punti. Il valore zero è ottenuto utilizzando una soluzione di Cloruro di sodio
(N° CAS[7647-14-5]) al 9‰. I valori standard sono dati da soluzioni di glucosio (N° CAS[50-997]) e fruttosio (N° CAS[57-48-7]) (50/50) coprenti la gamma da 0 a 10 g·l-1 diluiti 10 volte al
momento del loro utilizzo. La taratura può anche essere effettuata con vini dalle concentrazioni
note.
4.7 Lettura dei risultati
La lettura è data dalla differenza tra l’assorbimento DO 2 e l’assorbimento di base DO 1. Questa
differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di glucosio e fruttosio del campione adottato.
Il risultato è espresso in g di glucosio + fruttosio per litro.
4.8 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità intra-laboratorio: 0,3 g·l-1 da 0 a 5 g·l-1 e 0,6 l-1 oltre i 5 g·l-1.
Riproducibilità inter-laboratorio: 0,35 g·l-1 da 0 a 2 g·l-1
5 Dosaggio dell’acido L-malico nei vini e nei mosti
5.1 Principio
L’acido L-malico in presenza di nicotinamide-adénosine– dinucléotide (NAD+), è ossidato in
ossalacetato in una reazione catalizzata dalla L-malato deidrogenasi (L-MDH). L’equilibrio della
reazione è in favore del malato. Lo spostamento dell’equilibrio della reazione nel senso della
formazione di ossalacetato si ottiene con l’eliminazione dell’ossalacetato che, in presenza di Lglutammato, si trasforma in L-aspartato. Questa reazione è catalizzata tramite la glutammatoossalacetato-transaminasi (GOT)
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1) L-malato + NAD+ -> ossalacetato + NADH + H+ (in presenza di L-malato deidrogenasi)
2) ossalacetato + L-glutammato -> L-aspartato + 2-ossoglutarato (in presenza di GOT)
La formazione di NADH, misurata con l’aumento di assorbimento alla lunghezza d’onda di 340 nm,
è proporzionale alla quantità di L-malato presente.
5.2 Materiale
Si può utilizzare qualsiasi materiale per l’analisi sequenziale che consenta una misurazione a 340
nm.
5.3 Reagenti
I reagenti utilizzati sono abitualmente forniti dai fabbricanti sotto forma di cofanetto enzimatico che
ne facilita l’utilizzo da parte dei laboratori. Si riporta qui sotto un esempio
Reagente 1 (30 ml)
Soluzione tampone pH 10 / acido glutammico (N° CAS[56-86-0]) 440 mg
Reagente 2 (6 ml)
NAD (N° CAS[53-84-9]) 210 mg
Reagente 3 (0,6 ml)
L-MDH (N° CAS[9001-64-3]) 2400 U / GOT (N° CAS[9000-97-9]) 160 U
Il reagente unico utilizzato nell’apparecchiatura si prepara con l’aggiunta di 3 reagenti del cofanetto
ai quali si aggiungono 300 mg di PVP (Polivinilpirrolidone) (N° CAS[9003-39-8]). La sua
conservazione è di 1 mese a 8° C.
5.4 Preparazione dei campioni
I campioni di vino o di mosto sono diluiti 10 volte.
5.5 Procedura analitica
La lunghezza d’onda di lettura è di 340 nm.
La sequenza analitica è la seguente:
Giro
Giro
Giro
Giro
1 (6 secondi): prelievo del campione di vino di 5 µl
1 (12 secondi): aggiunta di 20 µl di reagente e 200 µl d’acqua demineralizzata
1: lettura dell’assorbimento DO 1 a 340 nm
50 (600 secondi): lettura dell’assorbimento DO 2 a 340 nm
5.6 Taratura
Si esegue in tre punti. Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione di cloruro di sodio (N°
CAS[7647-14-5]) al 9‰. I valori standard sono dati da soluzioni di acido L-malico (N° CAS[97-676]) che copre la gamma da 0 a 3,5 g·l-1 diluite 10 volte al momento del loro utilizzo. La taratura
può essere anche eseguita con vini dalle concentrazioni note.
5.7 Lettura dei risultati
La lettura si ottiene per differenza tra l’assorbimento DO 2 e l’assorbimento di base DO 1. Questa
differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di acido L-malico nel campione esaminato. Il
risultato si esprime in g di acido L-malico per litro.
5.8 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità intra-laboratorio: 0,4 g·l-1.
Riproducibilità inter-laboratorio: 0,6 g·l-1
Esemplare certificato conforme
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Secretario dell’Assemblea Generale
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© OIV 2010
38/43
6 Dosaggio dell’acido L-lattico nei vini e nei mosti
6.1 Principio
Metodo enzimatico
L’acido L-lattico in presenza di nicotinamide-adénosine-dinucléotide (NAD) è ossidato in piruvato in
una reazione catalizzata dalla L-lattato deidrogenasi (L-LDH). L’equilibrio della reazione è in favore
del lattato. L’eliminazione del piruvato dal mezzo di reazione sposta l’equilibrio della reazione nel
senso della formazione del piruvato. In presenza di L-glutammato, il piruvato si trasforma in Lalanina. Questa reazione è catalizzata dal glutammato-piruvato-transaminasi (GPT)
1) L-lattato + NAD+ -> piruvato + NADH + H+ (in presenza di L-lattato deidrogenasi)
2) Piruvato + L-glutammato -> L-alanina + 2-ossoglutarato (in presenza di GPT)
La formazione di NADH, misurata con l’aumento di assorbimento alla lunghezza d’onda di 340 nm,
è proporzionale alla quantità di lattato presente.
6.2 Materiale
Si può utilizzare qualsiasi materiale per l’analisi sequenziale che consenta una misurazione a 340
nm.
6.3 Reagenti
I reagenti utilizzati sono abitualmente forniti dai fabbricanti sotto forma di cofanetto enzimatico che
ne facilita l’utilizzo da parte dei laboratori. Si riporta qui sotto un esempio.
Reagente 1 (30 ml)
Soluzione tampone pH 10 / acide glutammico (N° CAS[56-86-0]) 440 mg
Reagente 2 (6 ml)
NAD (N° CAS[53-84-9]) 210 mg
Reagente 3 (0,6 ml)
GPT (N° CAS[9000-86-6]) 1100 U
Reagente 4 (0,6 ml)
L-LDH (N° CAS[9001-60-9]) 3800 U
Il reagente unico utilizzato nell’apparecchiatura si prepara con l’aggiunta dei 4 reagenti del
cofanetto ai quali si aggiungono 300 mg di PVP (Polivinilpirrolidone ) (N° CAS[9003-39-8]). La sua
conservazione è di 1 mese a 8° C.
6.4 Preparazione dei campioni
I campioni di vino o di mosto sono diluiti 10 volte.
6.5 Procedura analitica
La lunghezza d’onda di lettura è di 340 nm.
La seguenza analitica è la seguente:
Giro
Giro
Giro
Giro
1 (6 secondi): prelievo di un campione di vino di 5 µl
1 (12 secondi): aggiunta di 20 µl di reagente e 200 µl di acqua demineralilzzata
1: lettura dell’assorbimento DO1 a 340 nm
50 (600 secondi): lettura dell’assorbimento DO2 a 340 nm
Esemplare certificato conforme
Tbilisi, il 25 giugno 2010
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Federico CASTELLUCCI
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6.6 Taratura
Si esegue in tre punti. Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione di cloruro di sodio (N°
CAS[7647-14-5]) al 9‰. I valori standard sono dati da soluzioni di acido L-lattico (N° CAS[79-334]) che coprono la gamma da 0 a 1,2 g·l-1 diluite 10 volte al momento dell’utilizzo. La taratura si
può eseguire anche con vini dalle concentrazioni note.
6.7 Lettura dei risultati
La lettura si ottiene per differenza tra l’assorbimento DO 2 e l’assorbimento di base DO1. Questa
differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di acido L-lattico nel campione esaminato. Il
risultato si esprime in g di acido L-lattico per litro.
6.8 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità intra-laboratorio: 0,2 g·l-1.
Riproducibilità inter-laboratorio: 0,5 g·l-1
7 Dosaggio dei componenti fenolici totali nei vini con indice di Folin-Ciocalteu
7.1 Principio
Metodo chimico
L’insieme dei componenti fenolici presenti nel vino è ossidato con il reagente di Folin-Ciocalteu.
Quest’ultimo è costituito da una miscela di acido fosfotungstico e di acido fosfomolibdico che si
riduce, al momento dell’ossidazione dei fenoli, in una miscela di ossidi blu di tungsteno e di
molibdeno. La colorazione blu prodotta presenta un assorbimento massimo intorno ai 750 nm. È
proporzionale al tasso di composti fenolici presenti nel vino. Il metodo proposto rappresenta
un’automatizzazione diretta del metodo manuale.
7.2 Materiale
Si può utilizzare qualsiasi materiale per l’analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di 2 reagenti e
che consenta una misurazione a 750 nm.
7.3 Reagenti
Reagente 1
Reagente di Folin Ciocalteu
Reagente 2
Carbonato di sodio (CAS [497-19-8]) 20 g
Acqua demineralizzata fino a 100 ml.
7.4 Preparazione dei campioni
I campioni di vino o di mosto non sono diluiti.
7.5 Procedura analitica
La lunghezza d’onda di lettura è di 750 nm.
La sequenza analitica è la seguente:
Giro
Giro
Giro
Giro
1 (6 secondi): prelievo di 2 µl del campione di vino o di mosto
1 (12 secondi): aggiunta di 50 µl di reagente 1 e 40 µl di acqua demineralizzata.
25 (300 secondi): aggiunta di 200 µl di reagente 2
50 (600 secondi): lettura dell’assorbimento Do a 750 nm
7.6 Taratura
Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione di cloruro di sodio (N° CAS[7647-14-5]) al 9‰.
Un valore standard è dato da un vino dosato con il metodo manuale di riferimento.
Esemplare certificato conforme
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7.7 Lettura dei risultati
Il valore dell’indice di Folin-Ciocalteu è direttamente proporzionale all’assorbimento misurato DO.
7.8 Caratteristiche del metodo descritto
Riproducibilità intra-laboratorio: 4,5
Riproducibilità inter-laboratorio: 8,5
8 Dosaggio dell’azoto -amminico nei vini e nei mosti
8.1 Principio
Metodo chimico
La quantità di azoto -amminico si determina tramite reazione con l’oftaldialdeide. L’intensità
dell’assorbimento a 340 è confrontata con quelle ottenute per campioni di concentrazioni note in
isoleucina.
8.2 Materiale
Si può utilizzare qualsiasi materiale per l’analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di 2 reagenti e
che consenta una misurazione a 340 nm.
8.3 Reagenti
Reagente 1
NaOH (N°CAS [1310-73-2])
Acido borico (N°CAS [10043-35-3])
Acqua demineralizzata fino a
3,837 g
8,468 g
1000 ml
Reagente 2
O-ftaldialdeide 99% (N°CAS[643-79-8])
N-acetil–cisteina (N°CAS [616-91-1])
Etanolo (N°CAS [64-17-5]) al 1/2
0,671 g
0,0816 g
fino a 100 ml
8.4 Preparazione dei campioni
I campioni di vino o di mosto non sono diluiti
8.5 Procedura analitica
La lunghezza d’onda di lettura è di 340 nm.
La sequenza analitica è la seguente:
Giro
Giro
Giro
Giro
Giro
1 (6 secondi): prelievo di 5 µl del campione di vino
1 (12 secondi): aggiunta di 200 µl di reagente 1
24 (294 secondi): lettura dell’assorbimento DO1 a 340 nm
25 (300 secondi): aggiunta di 200 µl di reagente 2
50 (600 secondi): lettura dell’assorbimento DO2 a 340 nm
8.6 Taratura
Si esegue in 6 punti. Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione di Cloruro di sodio (N°
CAS[7647-14-5]) al 9‰. Gli altri 5 valori si ottengono con una gamma di soluzioni di L-isoleucina.
Soluzione madre di L-isoleucina
L-isoleucina (N°CAS [73-32-5])
0,936 g
Acqua demineralizzata
fino a 100 ml
Agitare bene fino alla completa dissoluzione. Questa soluzione contiene 1 g di azoto -amminico
per litro. È stabile per tre mesi.
Esemplare certificato conforme
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Soluzioni di taratura
Si preparano secondo la tabella seguente:
Quantità in ml di soluzione
madre per 100 ml di acqua
demineralizzata
Concentrazione in azoto
amminico in mg/l
Tempo di conservazione:
3 mesi
1
5
10
15
20
10
50
100
150
200
8.7 Lettura dei risultati
La lettura si ottiene per differenza tra l’assorbimento DO 2 e l’assorbimento di base DO 1. Questa
differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di azoto -amminico del campione esaminato.
Il risultato è espresso in mg di azoto -amminico per litro.
9 Dosaggio dell’azoto ammoniacale nei vini e nei mosti
9.1 Principio
Metodo enzimatico.
In presenza di nicotinamide-adenosina-dinucleotide ridotta (NADH), in una reazione catalizzata con
glutammato deidrogenasi(GLDH), gli ioni NH4+ e il 2- ossoglutarato formano L-glutammato.
NH4+ + 2-ossoglutarato + NADH -> L-glutammato + NAD+ + H2O (in presenza di GLDH)
La quantità di NADH ossidato in NAD+ è proporzionale alla quantità di azoto ammoniacale presente.
9.2 Materiale
Si può utilizzare qualsiasi materiale per l’analisi sequenziale che permetta l’utilizzo di 2 reagenti e
che consenta una misura a 340 nm.
9.3 Reagenti
I reagenti utilizzati sono abitualmente forniti dai fabbricanti sotto forma di cofanetto enzimatico che
ne facilita l’utilizzo da parte dei laboratori. Qui di seguito si fornisce un esempio.
Reagente 1 (30 ml)
Tampone TRIS, 2-ossoglutarato pH 8
Reagente 2 (6 ml)
NADH (N° CAS[606-68-8])
14 mg
Reagente 3 (0,6 ml)
GLDH (N° CAS[9029-11-2])
550 U
9.4 Preparazione dei campioni
I campioni di vino o di mosto sono diluiti 10 volte.
9.5 Procedura analitica
La lunghezza d’onda della lettura è di 340 nm.
La sequenza analitica è la seguente:
Giro
Giro
Giro
Giro
Giro
1 (6 secondi): prelievo di 5 µl del campione di vino o di mosto
1 (12 secondi): aggiunta di 100 µl di reagente e 100 µl di acqua demineralizzata
24 (294 secondi): lettura dell’assorbimento Do1 a 340 nm
25 (300 secondi): aggiunta di 20 µl di reagente 2
50 (600 secondi): lettura dell’assorbimento Do2 a 340 nm
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9.6 Taratura
Si esegue in 6 punti. Il valore zero si ottiene utilizzando una soluzione di cloruro di sodio (N°
CAS[7647-14-5]) al 9‰. Gli altri 5 valori si ottengono con un gamma di soluzioni di solfato di
ammonio.
Soluzione madre di solfato di ammonio
(NH4)2SO4 (N°CAS [7783-20-2])
4,8563 g
Acqua demineralizzata
fino a 100 ml
Agitare bene fino alla completa dissoluzione. Questa soluzione contiene 12,5 g di azoto
ammoniacale per litro. È stabile per 3 mesi.
Soluzioni di taratura
Si preparano secondo la seguente tabella:
Quantità in ml di soluzione
madre diluita al 1/10 per 100
ml di acqua demineralizzata
Concentrazione di azoto
ammoniacale in mg•l-1
Tempo di conservazione:
3 mesi
1
5
10
15
20
12,5
62,5
125
187,5
250
9.7 Lettura dei risultati
La lettura si ottiene per differenza tra l’assorbimento DO 2 e l’assorbimento di base DO 1. Questa
differenza di assorbimento è proporzionale al tenore di azoto ammoniacale nel campione
esaminato. Il risultato è espresso in mg di azoto ammoniacale per litro.
Esemplare certificato conforme
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