Diagnosi genetica,
individuazione
dello stato di portatrice
e diagnosi prenatale
Maurizio Margaglione
Alberobello, 8 settembre 2012
Genetica Medica
Dipartimento di Medicina Clinica e
Sperimentale
Università di Foggia
Quando una donna è una portatrice di emofilia?
• Figlia biologica di un emofilico
• Madre biologica di più di un emofilico
• Madre biologica di un emofilico e con un altro
familiare emofilico
• Madre biologica di un emofilico
• Sorella di un emofilico
Cos’è cambiato nella diagnosi genetica dell’Emofilia
Cos’è cambiato nella diagnosi genetica dell’Emofilia
Cos’è cambiato nella diagnosi genetica dell’Emofilia
Cos’è cambiato nella diagnosi genetica dell’Emofilia
Cos’è cambiato nella diagnosi genetica dell’Emofilia
Marker A
-
Marker B
Marker C
C
-
Identificazione dei carrier
·
·
·
·
?
Analisi di linkage
Pro
Metodologia d’analisi identica in tutti
Metodo sufficientemente semplice
Applicazione immediata
Risposta in tempi brevi
Analisi di linkage
Contro
Necessaria eterozigosità
Scarsità di polimorfismi
Frequenza allelica
Talvolta non informativa
Possibilità di diagnosi errata
(ricombinazione)
Quando l’analisi di linkage non
da risposta?
• Famiglie non informative
• Analisi non informative
• Ricombinazione
• Nuove mutazioni
• Mosaicismi germinali
Analisi di linkage
Informativa in circa
85-90%
delle famiglie
Cos’è cambiato nella diagnosi genetica dell’Emofilia
Marker A
-
Marker B
Marker C
-
Approccio molecolare
1982 Identificazione del gene del FIX (Choo et al)
1983 Prima segnalazione mutazione del gene del FIX (Giannelli et al)
1984 Identificazione del gene del FVIII (Gitschier et al)
1984 Prima segnalazione mutazione del gene del FVIII (Gitschier et al,
Antonarakis et al)
1991 Mappaggio del gene del FVIII (Poustka et al; Freije & Schlessinger 1992)
FVIII (http://europium.csc.mrc.ac.uk)
615 sostituzioni nucleotidiche
120 grandi delezioni
152 piccole delezioni
57 inserzioni
FIX (www.klc.ac.uk/ip/petergreen/hemBdatabase.htlm)
1053 differenti mutazioni
Identificazione diretta della mutazione
Pro
Informativa in “tutti” i casi
Non necessari più familiari affetti
Identificazione diretta della mutazione
Contro
La mutazione dev’essere conosciuta
Approccio differente nei diversi casi
Tempi medio-lunghi per la risposta
Perché eseguire un test genetico?
• Identificazione dei carrier
• Predizione della risposta terapeutica o
dell’insorgenza delle complicanze
• Diagnosi prenatale
Test genetici: perché sono diversi dalle
consuete analisi di laboratorio?
I risultati sono permanenti per l’individuo sottoposto al test
Possono essere eseguiti con finalità diagnostiche ma anche
predittive per patologie future
I risultati possono avere conseguenze importanti per altri
membri familiari, solitamente figli, ma talvolta fratelli e genitori
Occasionalmente alcune forme di test genetico possono rivelare
informazioni non desiderate (paternità)
“Il test genetico deve essere considerato un servizio integrato, nel
senso che deve essere preceduto e seguito da una informazione
specifica (consulenza genetica collegata al test genetico)”
Conferenza Stato-Regioni, 15 luglio 2004, Linee-Guida per le Attività di Genetica Medica
Consulenza genetica
• Il “counseling” genetico fornisce informazioni pratiche alle
persone sul proprio rischio di sviluppare o trasmettere una
malattia ereditaria o un difetto congenito.
• Il “counseling” genetico discute il meccanismo di
ereditarietà della malattia, la sua incidenza, il rischio di
trasmissibilità, i test per identificarne lo stato di malattia o
di portatore e gli eventuali metodi di prevenzione e terapia.
• Il consulente genetista ha un approccio teso a fornire
informazioni alle persone e discutere con loro perchè siano
in grado di prendere in autonomia una decisione
“informata”.
Perché eseguire un test genetico?
• Identificazione dei carrier
Identificazione diretta della mutazione
Fenotipo
<1% grave
1-5% moderato
6-25% lieve
Frequenti emorragie spontanee; emorragie
prolungate anche dopo lesioni minime,
interventi chirugici ed estrazioni dentarie.
50% dei casi.
Numero medio di emorragie/anno: 52
Emorragie spontanee rare; emorragie
prolungate dopo lesioni minime, interventi
chirugici ed estrazioni dentarie.
15% dei casi.
Numero medio di emorragie/anno: 12
Emorragie spontanee assenti; emorragie
prolungate dopo traumi maggiori,
interventi chirugici ed estrazioni dentarie.
35% dei casi.
Numero medio di emorragie/anno: 0-1
The Italian AICE-Genetic Hemophilia A database
Type of mutations
Severe
Moderate/Mild
Inv IVS-22
Nonsense
Small ins
Missense
Small del
Splice site
Inv IVS-1
Large del
Perché eseguire un test genetico?
• Identificazione dei carrier
• Predizione della risposta terapeutica
o dell’insorgenza delle complicanze
• Diagnosi prenatale
Presenza di anticorpi inibenti: caratteristiche
Emofilia
A
Prevalenza
25%
“High responders”
Risposta alla ITI
+
60-80%
B
1-5%
++
50%
Gravi effetti collaterali con
somministrazione fattore carente
--
++
Correlazione con il tipo di
mutazione
+
++
The Italian AICE-Genetic Hemophilia A database
Inhibitors in severe Hemophiliacs
Large deletions
71 %
46 %
41 %
Nonsense mutations
40 %
35 %
31 %
IVS-1 inversions
35 %
/
17 %
26 %^
IVS-22 inversions
27 %
/
21 %
21 %°
Splicing-site mutations
28 %
8%
17 %
Small deletions
16 %
17 %
Small insertions
13 %
19 %
Missense mutations
5%
Italy
Margaglione M, Haematologica, 2008
16 %
5%
Germany*
Hamster
10 %
*Oldenburg J, Haematologica, 2000
^Oldenburg J, J Thromb Haemost 2006
° Saint-Remy JM, Haemophilia 2004
Emofilia B
Database internazionale
(Green, 2004)
2891 gravi
Pazienti con inibitore
54 (1.9%)
Mutazioni nonsense
14 (26%)
Grandi delezioni
13 (24%)
Delezione completa del gene
17 (31%)
Mutazioni missense
10 (19%)
Pazienti italiani con (Tagariello, modificato)
Pazienti con inibitore
277 gravi
10 (3,6%)
Mutazioni nonsense
6
Delezione esoni A-H
2
Delezione completa del gene
2
Mutation type
Success
Partial
Response
Failure
Large deletions (n=6)
1 (17%)
1
4
Splice site mutations (n=3)
1 (33%)
1
1
Translocations (n=50)
25 (47%)
9
18
Nonsense (n=11)
6 (60%)
1
3
“High-risk” mutations 33/71 (47%)
Small deletions (n=6)
5 (71%)
1
Small insertions (n=6)
5 (87%)
1
Missense (n=1)
3 (100%)
“Low-risk” mutations 13/15 (87%)
Coppola A et al. J Thromb Haemost. 2009
OR (95% CI) 7.5 (1.7-31.6) p=0.005
Time to success
Low-risk vs high-risk
Low-risk mutations
High-risk mutations
RR (95% CI) 2.4 (1.2-4.9) p=0.01
Coppola A et al. J Thromb Haemost. 2009
Perché eseguire un test genetico?
• Identificazione dei carrier
• Predizione della risposta terapeutica o
dell’insorgenza delle complicanze
• Diagnosi prenatale
ANALISI MOLECOLARE DEL GENE:
QUANDO?
In epoca preconcezionale, nelle coppie a rischio di
avere un feto con la malattia.
In questi casi, lo studio del DNA e’ la premessa
indispensabile per poter eseguire tempestivamente
la diagnosi prenatale.
Diagnosi prenatale: prelievo
DIAGNOSI PRENATALE: RISCHI
Tutte le tecniche attualmente in uso, che
hanno lo scopo di ottenere campioni di
DNA fetale per la diagnosi prenatale,
sono invasive e non prive di rischi per il
feto e la donna.
Un centro per la diagnosi di portatrice e per la
diagnosi prenatale di emofilia necessita della
collaborazione delle seguenti strutture:
- Centro per la diagnosi e terapia dell’emofilia.
- Laboratorio di biologia molecolare per lo studio del DNA.
- Reparto di ostetricia per il prelievo dei villi coriali, del
liquido amniotico, del sangue fetale.
- Laboratorio di citogenetica per lo studio del cariotipo e la
determinazione del sesso nel feto.
