coronavirus reovirus - Sezione di Microbiologia

CORONAVIRUS
REOVIRUS (ROTAVIRUS)
CALICIVIRUS (NOROVIRUS)
PICORNAVIRUS (RHINOVIRUS)
Prof. O.E. Varnier – Dott.ssa Martini Isabella
Università degli Studi di Genova
Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia A.A. 2013-2014
Corso Integrato di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica
Reovirus
Calicivirus
Norovirus
CORONAVIRUS
Morfologia
Famiglia: Coronaviridae
Generi: Coronavirus & Torovirus
Dimensioni: virione sferico con diametro 80-220 nm
Pericapside:
Involucro fosfolipidico con proiezioni distanziate
(aculei o peplomeri) a forma di clava o di petalo
(aspetto a “corona solare”)
Nucleocapside (genoma + monomeri di proteina N)
Elicoidale - diametro 9-10 nm
Genoma:
RNA lineare a singolo filamento a
polarità positiva (27-32 kb)


È il più lungo di tutti gli RNA virali
Replica con elevata frequenza
di ricombinazioni
(Alta Variabilità Genetica)
Morfologia -Genoma

Genoma costituito da singolo filamento di RNA a polarità positiva con un
CAP al 5’ e un sito di poliadenilazione (PolyA) al 3’.

L’organizzazione genica è simile in tutti i coronavirus:

Una larga regione relativa a geni funzionali all’estremità 5’

Una sequenza di regioni codificanti le proteine strutturali (3’)
Morfologia

Proteina N (50-60 KDa): fosfoproteina
nucleocapsidica fosforilata; stabilizza RNA.

Glicoproteina S (E2,180-200 kDa) forma peplomeri
favorisce attacco del virus e la fusione con membrana
cellulare. Bersaglio degli Ab NT (principale Ag).

Glicoproteina M di transmembrana (E1, 20-30 kDa);
incastonata nel doppio strato fosfolipidico
dell’involucro, interagisce con il nucleocapside.

Proteina E; piccola proteina dell’envelope (9-12KDa).
Interviene insieme ad gp M per stimolare gemmazione.

Alcuni Virus hanno un’altra gp dell’envelope:
Emagglutinina Esterasi-HE (E3, 120-140 kDa)
implicata nel processo di rilascio del virus.
aspetto a “corona solare” del Coranavirus
Coronavirus - Caratteristiche

l virione è sensibile agli acidi, etere, essiccamento

Tropismo tissutale: cellule epiteliali del tratto respiratorio (cellule ciliate
delle prime vie aeree) e del tratto gastrointestinale.

Il virus si replica ad una T° di 33-35°C.

Colture in vitro difficili: 229E può svilupparsi in fibroblasti (MRC5 e L132),
OC43 si sviluppa bene in HRT18 (linea cellulare tumore rettale umano).

Specie-specifici: se ne conoscono 3 sierotipi con differenti spettri d’ospite
(Uomo, Maiale, Cane, Gatto, Coniglio, Topo, Bovini,Tacchini, Polli).

Coronavirus sono sostanzialmente associati a sindromi respiratorie, sindromi
enteriche, epatite, encefalite e, nei casi più gravi a patologia multiorgano.
Classificazione




3 gruppi sulla base della sequenza nucleotidica.
I gruppi I e II includono coronavirus di mammiferi, il gruppo III gli aviari.
Coronavirus umano NL63
Coronavirus umano HKU1
Classificazione – SARS CoV

I CoV sono noti da molti decenni come patogeni degli animali e dell’uomo ma a torto
si è ritenuto che fossero patogeni secondari in medicina umana, responsabili di
patologie di scarso rilievo (10-20% raffreddori comuni, occasionali infezioni
enteriche comuni nei bambini <12 anni; polmoniti nei lattanti e immunodepressi,
altrimenti infezioni lievi, autolimitanti, non richiedono terapia)

Negli anni 2002-2003 una forma di grave infezione respiratoria (Severe Acute
Respiratory Syndrome, SARS) venne segnalata nelle regioni del sud della cina e si
diffuse rapidamente in altri continenti (epidemia di polmonite atipica grave).

L’agente responsabile della SARS venne identificato in un coronavirus umano
sconosciuto prima di allora denominato SARS-Coronavirus (SARS-CoV)

4 settimane per identificare, sequenziare il genoma e stabilire la filogenesi del virus.

SARS-CoV che pure si differenzia geneticamente e biologicamente per alcuni aspetti
dai tre gruppi noti, è stato assegnto al Gruppo II.
Classificazione – SARS CoV
I CASI DI SARS NEL MONDO
Country
Brazil
From 1 Nov 2002 to 16 April 2003
From 1 Nov 2002 to 31 July 2003:
Cumulative number of cases: 8096
Number of death: 774
Number
of deaths
2
0
103
13
China
1432
64
China, Hong Kong Special
Administrative Region
1268
61
27
0
France
5
0
Germany
6
0
Indonesia
1
0
Italy
3
0
Japan
1
0
Kuwait
1
0
Malaysia
5
1
Philippines
1
0
Republic of Ireland
1
0
Romania
1
0
Singapore
162
13
South Africa
1
0
Spain
1
0
Sweden
1
0
Switzerland
1
0
Thailand
8
2
United Kingdom
6
0
193
0
63
5
3293
159
Canada
Cumulative Number of Reported Cases of
Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)
Cumulative
number of
case(s)
China, Taiwan
United States
Viet Nam
Total
Genesi di SARS-CoV
1.
2.
3.
Virus umano non conosciuto precedentemente e improvvisamente diffuso grazie
a nuove vie di trasmissione?.
Virus animale che ha improvvisamente acquisito la capacità di infettare l’uomo
in virtù di mutazione genetica (salto di specie)?
Virus prodotto da una ricombinazione, avvenuta naturalmente, che ha generato
un coronavirus nuovo, con capacità di infettare l’uomo e notevole potenziale
patogeno?
Studi epidemiologia molecolare hanno accreditato Hp. 2 differenti SALTI DI SPECIE:
Co-V Pipistrello
Co-V Zibetto
Uomo – SARS-CoV
e altri animali selvatici e
d’allevamento utilizzati nella
gastonomia cinese
Addetti alla macellazione e
ristorazione sono stati tra i
primi ad infettarsi
Co-V molto simili dal punto di vista genetico
LA REPLICAZIONE VIRALE
 Il ciclo di replicazione avviene nel citoplasma.

La replicazione è molto lenta se confrontata con altri tipi di virus: 24 ore
(il triplo del tempo dell’influenza: 6-8 ore).

I Co-V legano R cellulari specifici che variano da un gruppo all’altro e spesso tra i
membri dello stesso gruppo; generalmente si tratta di glicoproteine o glicani.

Co-V Gruppo II legano Acido neuraminico.

SARS-CoV lega specificamente la proteina hACE2 (Human Angiotensin Converting
Enzyme 2), la stessa cui si lega NL-63 (Gruppo I) anche se la legano in regioni
diverse.

229E (Gruppo I) lega una metallo proteasi.
LA REPLICAZIONE VIRALE

Adesione R specifici su membrana
cellulare attraverso peplomeri
(glicoproteine S).

Penetrazione:
2 possibili vie di entrata
(a seconda del ceppo virale)
1.
Endocitosi
2.
Fusione dell’involucro virale
con membrana cellulare
mediata da glicoproteina S.

Sintesi RNA polimerasi virale:
nel citoplasma, viene prima direttamente tradotto un tratto dell’RNA genomico(+)
all’estremità 5’ (gene ORF1) che codifica per una RdRp (RNA polimerasi virale)
LA REPLICAZIONE VIRALE

Trascrizione:
RdRp avvia sintesi di un intermedio RNA – (minus strand).
RNA - usato come stampo per poi produrre sia le nuove copie dell’RNA genomico
virale+ sia 5-7 RNA sub-genomici
[mRNA (+)] che saranno
tradotti nelle proteine
strutturali corrispondenti.

Sintesi proteica:
→ proteina N sintesi nel citoplasma
→ HE, S, E, M sintesi nel rR.E. e
inserite in membrana

Formazione del nucleocapside
proteina N e RNA genomico
virale+ assemblati nel citoplasma
→ formazione nucleocapside .
LA REPLICAZIONE VIRALE

Assemblaggio e maturazione:
Formazione del compartimento di
gemmazione ERGIC (ER-to-Golgi
Intermediate Compartment):

ERGIC con proteine HE, S, E, M
inserite in membrana.

Nucleocapside si lega a proteina M
e grazie a intervento proteine E e M,
gemma nel lume (gemmazione
intracellulare).

Dal Golgi → vescicole
a parete liscia contenenti particelle
virali mature
vescicole Golgi migrano verso membrana cellulare e il virus viene rilasciato per esocitosi
Patogenesi
Risposta immune dell’ospite (risposta T osservata in infezioni sperimentali) ritenuta a
lungo responsabile delle manifestazioni cliniche dell’infezione ma… → in animali
privi di risposta cellulo mediata si esprime comunque patogenicità dei coronavirus.
 Ruolo dell’effetto citopatico → citopaticità CoV varia in base a stipite virale e tipo
cellula infetta: es. OC43 e 229E non causano un rilevante effetto citopatico, ma molti
CoV sono in grado di sviluppare un’infezione litica.
 Meccanismi molecolari effetto citopatico di CoV approfonditi di recente, dimostrata:
 inibizione della trascrizione dei geni cellulari
 induzione apoptosi cellulare da parte proteina virale E

Variazioni gravità sindrome clinica sulla base di differenze genetiche tra diversi
stipiti virali: mutazioni puntiformi/piccole delezioni/inserzioni possono essere alla
base di profonde modificazioni di tropismo e virulenza di singoli CoV.
 Mutazioni gene S o M sembrano essere correlate allo stabilirsi di infezioni persistenti.

Risposta Immunitara

Ab neutralizzanti anti CoV presenti in soggetti pediatrici e adulti

Presenza Ab neutralizzanti non impedisce la reinfezione anche da parte di
CoV dello stesso tipo, ma la gravità della sintomatologia clinica è
notevolmente minore in presenza di un’immunità specifica.

In alcuni casi reinfezione può degenerare aggravando una patologia
polmonare cronica preesistente.
ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

Isolamento CoV è difficile e non diffusamente disponibile:

difficile coltivazione CoV in vitro; sistema ottimale su coltura di tessuto tracheale.

Eccezione per SARS-CoV che si coltiva bene → elevato cpe su cellule VERO

Tecniche sierologiche hanno scarso impiego.

Accertamenti si basano sulla ricerca nel materiale patologico (materiale fecale,
essudato rino-faringeo) di :

Ag specifici → TECNICHE IMMUNOENZIMATICHE o di IMMUNOFLUORESCENZA

Sequenze nucleotidiche specifiche→ amplificazione molecolare (Real Time PCR).
REOVIRUS: ROTAVIRUS
Reovirus - Caratteristiche Generali






“Reovirus”= virus Respiratori Enterici Orfani ; 1951- isolamento da apparati
respiratori e intestinali umani in assenza di associazioni patologiche nuove.
Assente pericapside.
Capside, formato da 6-10 polipeptidi diversi, costituito da strati concentrici.
RNA a doppio filamento, lineare, segmentato.
Famiglia: Reoviridae; divisa in generi in base alla struttura del capside, al numero dei
segmenti genomici e alla natura dell’ospite.
Generi: 15 generi di cui 5 infettano uomo e animali (altri infettano piante e pesci)
1.
2.
3.
4.
5.
Orthoreovirus
Rotavirus
Orbivirus
Coltivirus
Seadornavirus
Rotavirus - Caratteristiche

Più importanti reovirus patogeni umani ma isolati anche in ≠ specie animali
domestici/selvatici.

NON specie specifici →Identificati nell’uomo stipiti virali correlati Ag a virus animali.

Infettano enterociti maturi villi dell’intestino tenue → diarree neonatali uomo/animali.

Infettività favorita da basse T° e da umidità elevata.

Sono stabili a ph 3 e in quanto privi di envelope, resistono ai comuni disinfettanti
quali etere, cloroformio e acidi .

Coltivabili in vitro su linea cellulare MA-104 (cellule di rene fetale di scimmia).

Condizione essenziale per replicazione in vitro del virus e per la comparsa
dell’effetto citopatico è l’aggiunta di enzimi proteolitci (tripsina).

Effetto citopatico si manifesta in 24-72 h ed è caratterizzato dalla comparsa di
cellule rifrangenti che si distaccano dal monostrato e vanno incontro a lisi.
Morfologia





Caratteristico aspetto a ruota
Dimensioni: virione a simmetria icosaedrica, diametro 70 nm
Capside: triplo strato proteine concentriche (VP).
6 proteine strutturali (VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 & VP7)
6 proteine non strutturali (NSP1-6).
VP4 e VP7 formano lo strato più esterno
VP4 costituisce le spicole (proiezioni peduncolate)
coinvolte nei meccanismi di adesione;
Target degli nAb e attività emoagglutinante.
VP7 (gp) principale target Ab neutralizzanti.
VP6 forma lo strato intermedio.
Core interno è formato da
RNA +NSP+ VP2, VP1 e VP3
VP2 compone il terzo strato capsidico
VP1 e VP3 proteine enzimatiche con un ruolo
cruciale nella replicazione.
Classificazione- proteine capside

In base all’antigene VP6, i rotavirus sono distinti in 7 gruppi (A-G).

Infezioni umane (gastroenteriche) sono causate da virus dei gruppi A, B e C.

Di questi, i rotavirus di gruppo A sono diffusi agenti di gastroenterite acuta nei
bambini piccoli e determinano infezioni intestinali in numerose specie animali.

Rotavirus del gruppo A distinti in base alle proteine capside esterno (VP7-VP4)

15 tipi G (da glicoproteina, in base al composizione chimica di VP7)

25 tipi P (da proteasi-sensibile, in relazione a una proprietà di VP4).

10 tipi G e 11 P infettano l’uomo, gli altri varie specie animali.
Classificazione – proteine capside

A causa di tale duplice caratterizzazione antigenica, i ceppi di rotavirus sono
definiti con una classifi cazione binaria GnP[n].

Esistono ≠ combinazioni G-P: 95% infezioni umane causate da 5 ceppi:
G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[8], G9P[8].

Sono continuamente prodotte nuove combinazioni G-P per il frequente
riassortimento genomico, che si realizza in corso di infezione doppia di una
stessa cellula.

Il riassortimento si realizza nell’ambito dei ceppi di gruppo A e può coinvolgere
due ceppi umani o ceppi umani e animali.
Classificazione - genoma
Genoma costituito da 11 segmenti di RNA bicatenario (dsRNA).
 Ogni segmento codifica per una proteina (strutturale-VP o non strutturale-NSP),
eccetto il segmento 11, che codifica per due proteine non strutturali.


Distinzione dei ceppi (A-B-C) di rotavirus può essere effettuata dopo estrazione
dell’RNA genomico virale e separazione
elettroforetica su gel degli 11 segmenti
in relazione al loro differente
peso molecolare.
Fig. a lato: Struttura e organizzazione
genomica di un Rotavirus
Classificazione - Genoma



Distinzione dei ceppi di rotavirus può essere effettuata dopo estrazione dell’RNA
genomico virale e separazione elettroforetica su gel di poliacrilamide (staining con
ethidium bromide o silver nitrate) degli 11 segmenti in relazione al loro differente
peso molecolare (→ 4 gruppi).
I pattern elettroforetici vengono definiti
elettroferotipi
Frammenti più lenti
e sono differenti
nell’ambito di ciascun
gruppo (A, B e C).
Caratteristico profilo di migrazione
degli 11 segmenti può essere utilizzato
per caratterizzare i rotavirus
in feci e colture cellulari.
Frammenti più veloci
~3302 bp
~667 bp
Elettroforesi di Rotavirus Umani
Replicazione: attacco e penetrazione del
virus nella cellula ospite

Rotavirus infettano in primo luogo gli enterociti maturi delle porzioni intermedia e
superiore dei villi del tenue.

Proteine del capside esterno (VP7 e VP4) entrambe coinvolte nella fase iniziale del
ciclo replicativo virale (legame al R e penetrazione).

Sembra che esistano differenti R cellulari, uno dei quali costituito da acido sialico.

Osservazione sperimentale: Rotavirus moltiplicano in colture di cellule in vitro solo
con accorgimenti come aggiunta di tripsina al mezzo di coltura (difficile coltivazione).

Pretrattamento proteolitico con tripsina importante per l’infettività virale → il taglio
di VP4 in due porzioni (VP5 e VP8) facilita la penetrazione del virus nella cellula.
Replicazione: attacco e penetrazione del
virus nella cellula ospite

I virioni di rotavirus sono attivati da proteasi:
nel tratto GI avviene la proteolisi del capside più esterno (taglio di VP4 in
VP5 e VP8) che rende il virus infettivo e stimola la produzione di particelle
subvirali intermedie/infettive (ISVP)

ISVP si lega alla cellula, penetra al suo interno per endocitosi.

Particelle virali sono trasportate nei lisosomi, ove si realizza un
denudamento parziale: virus perde capside esterno ma l’RNA virale rimane
sempre rivestito (capside interno).
Replicazione: sintesi mRNA e produzione
dei trascritti virali



Nel citoplasma: produzione mRNA mediata da una RNA polimerasi-RNA dipendente
(RdRp) composta dal complesso VP1-VP3 (enzimi del capside interno).
Filamento(-) del dsRNA virale usato come stampo da RdRp per la produzione di un
filamento (+) che funge da mRNA .
Capping e poliadenilazione: enzimi contenuti nel core del virione attaccano il 5’
“cap” metil-guanosina (*G) e il poli A al 3’ (AAA) dell’mRNA → mRNA maturo.
Replicazione: sintesi mRNA e produzione
dei trascritti virali



I trascritti virali degli 11 segmenti (mRNA) sono tradotti in proteine:
Nel citoplasma: sintetizzate/accumulate VP1, VP2, VP3,VP6 + alcune proteine non
strutturali → utilizzate per montaggio del doppio capside: si formano particelle
subvirali.
Nel reticolo endoplasmatico: sintetizzate glicoproteine VP7 e NSP4 ed inserite in
membrana R.E.
Replicazione: sintesi del genoma virale
 Filamenti(+) sintetizzati da RdRp utilizzati anche per la sintesi dei filamenti
complementari che costituiranno il nuovo genoma (11 segmenti).
 Filamenti(+) inclusi nella formazione delle particelle subvirali e RdRp li usa come
stampo per sintetizzare il filamento(-) complementare, originando un genoma
segmentato di dsRNA, avvolto in una particella a doppio strato.
Replicazione: maturazione


La fase successiva è rappresentata dalla maturazione delle particelle subvirali per
aggiunta delle proteine capsidiche dello strato esterno (VP4 e VP7).
I capsidi aggregano “agganciandosi” sulla proteina NSP4 all’esterno del R.E.
------> gemmando all’interno acquisiscono le proteine del capside esterno
(VP7/VP4?) e un pericapside
(transitoria acquisizione di envelope).
Replicazione: rilascio del virus

Il virus perde poi il pericapside e abbandona la cellula in seguito a lisi cellulare.

La morte cellulare è preceduta dal blocco della sintesi proteica e del DNA cellulare.

Le proteine non strutturali sono coinvolte nella morte cellulare, causando alterazioni delle
membrane cellulari.
Patogenesi

Trasmessi per via fecale-orale.

Infezione avviene principalmente mediante contatto con individui infetti, ma può
essere trasmessa attraverso acqua, cibo o per contaminazione ambientale.

Una volta ingerito, il virus, resistente all’acidità gastrica, raggiunge l’intestino tenue,
infetta gli enterociti maturi delle porzioni intermedia e superiore dei villi del tenue
→ diarrea.

Un soggetto infetto elimina n°particelle virali > 1012/ gr di feci.

È sufficiente una bassa dose infettante (< 100 particelle virali)
Patogenesi
1.
“Switch-off” cellulare al fine di produrre progenie virale → morte cellulare è
preceduta dal blocco della sintesi proteica e del DNA cellulare.
2.
Necrosi degli enterociti maturi infettati concorre alla sintomatologia riducendo la
digestione e l’assorbimento di nutrienti → accumulo di lattosio e di altri disaccaridi
nel lume intestinale → aumento della pressione osmotica → richiamo di acqua.
3.
Ripopolazione dei villi da parte cellule a livello delle cripte → appiattimento dei
villi e iperplasia delle cripte → cellule immature delle cripte sono secretorie
pertanto la rapida rigenerazione delle cellule criptiche concorre alla diarrea
acquosa.
4.
Le proteine non strutturali sono coinvolte nella morte cellulare causando alterazioni
delle membrane cellulari: NSP4 ha un ruolo patogenetico (enterotossina virale)
→ probabilmente aumenta la [Ca++] intracellulare → Hp che NSP4 interagisca
con un R cellulare dell’epitelio intestinale stimolando un segnale di traduzione Cadipendente che aumenta la permeabilità della membrana plasmatica al Cl e
potenzia la secrezione di Cl → induzione diarrea secretoria.
Risposta Immunitaria

L’infezione primaria induce memoria immunologica specifica delle cellule B e T :
questa non è sufficiente a prevenire una reinfezione, ma riduce la gravità delle
infezioni contratte negli anni successivi (→forma più lieve o decorrenza asintomatica).

L’infezione da rotavirus induce sia una risposta immune omotipica che eterotipica →
infezione associata ad un sierotipo induce generalmente protezione anche verso gli
altri sierotipi.

Ripetuta esposizione al virus in età pediatrica contribuisce a consolidare l’immunità
verso l’infezione e giustifica la rarità delle manifestazioni cliniche dell’infezione
nell’adolescente e nell’adulto.
ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

La presentazione clinica aspecifica dell’infezione ed il contesto epidemiologico
difficilmente orientano la diagnosi di gastroenterite da rotavirus → esami di
laboratorio indispensabili per la diagnosi eziologia, quando le condizioni cliniche la
rendono necessaria.

La diagnosi viene comunemente effettuata ricercando Ag specifici del rotavirus in
campioni fecali con tecniche immunoenzimatiche (ELISA) o tecniche di agglutinazione
al lattice.

I kit disponibili in commercio hanno un’alta sensibilità e specificità, e soprattutto
semplicità e rapidità di esecuzione alla portata di qualsiasi laboratorio.

Il ceppo coinvolto può essere ulteriormente caratterizzato tramite saggi molecolari,
ma si tratta di analisi che non vengono effettuate comunemente.
CALICIVIRUS: NOROVIRUS
Morfologia
Famiglia: Caliciviridae
Generi: Norovirus, Sapovirus, Lagovirus & Vesivirus
Norovirus: particelle rotondeggianti di 27 nm
Sapovirus: virioni sferici di 31-35 nm, con 32 tipiche depressioni a
forma di coppa sulla superficie del capside (da cui “calicivirus”).
Pericapside assente (virus nudi)
Capside: icosaedrico, costituito da proteina strutturale VP1.
VP1 è polifunzionale: riconoscimento R, specificità d’ospite,
assemblaggio capside e immunogenicità.
VP1 → subunità P1 e P2 che protrudono all’esterno
subunità S (da shell), che riveste genoma.
Porzione centrale di P2 media maggior parte interazioni
virus/cellule e mostra le maggiori divergenze Ag.
Esiste anche proteina strutturale VP2 che stabilizza la struttura.
Morfologia - Genoma


RNA lineare a singolo filamento a polarità positiva
circa 7600 nucleotidi e poliadenilato in 3’

Norovirus: organizzato in tre ordini di lettura (Open Reading Frames, ORF).
ORF 1 → proteine non strutturali, tra cui la RNA polimerasi-RNAdipendente
ORF2 → proteina strutturale VP1 (capside)
ORF3 → proteina strutturale VP2 (regola espressione VP1/stabilizza struttura).






Sapovirus: genoma contiene, salvo rare eccezioni, due ORF.
ORF1 → codifica sia per le proteine non strutturali sia per quelle del capside
ORF2 → codifica per una proteina strutturale minore a funzione non nota
Caratteristiche

Norovirus legano R su cellule epitelio delle mucose del tratto digerente,
respiratorio e genitourinario.

Diffusi agenti di gastroenterite acuta, epidemica ed endemica, che coinvolge
soggetti di tutte le età.

Virus ad altissima variabilità genetica, dovuta a ≠ meccanismi:

elevato tasso di mutazioni puntiformi

predisposizione agli errori della RNA polimerasi-RNA dipendente

frequenti eventi di ricombinazione intra e inter-genogruppo, nell’ambito di
ciascuno dei due generi.

Variabilità genetica è correlata a una spiccata eterogeneità antigenica.

Eterogeneità Ag molto > di quella di altri virus a RNA+ (es. enterovirus).
Letteratura: ceppo responsabile di un’infezione cronica in un paziente
trapiantato, in un anno modificava 32 aa della proteina capsidica.

Classificazione

I calicivirus umani non sono tuttora coltivabili in vitro, a differenza dei ceppi animali
→ studi su replicazione fatti su volontari umani infettati e calicivirus animali.

Tuttavia, il genoma di alcuni norovirus e sapovirus è stato clonato e sequenziato.

Il confronto delle sequenze nucleotidiche codificanti per la proteina del capside e
la RNApolimerasi-RNAdipendente di norovirus e sapovirus ha consentito di
classificare i membri dei due generi in 5 genogruppi (da GGI a GGV) e di
differenziare i norovirus in 30 genotipi e i sapovirus in 9 genotipi.
Replicazione: attacco e penetrazione del
virus nella cellula ospite

Il ciclo di replicazione avviene nel citoplasma.

Per norovirus è noto che la subunità P2 del capside virale lega combinazione di 2
o 3 Ag cellulari ≠: AB0, H e di Lewis (marcatori dei gruppi ematici).

Ag sono oligosaccaridi legati a proteine/lipidi espressi su eritrociti o anche cellule
del tratto gastrointestinale o liberi nella saliva, nel latte e in secrezioni mucose.

Questa complessità di legame antirecettore/recettore spiega la difficoltà di
adattamento dei norovirus alla crescita in vitro.

Ceppi di ≠ genogruppi di norovirus legano ≠ combinazioni antigeniche.

Non sono ancora stati identificati R virali e gli
antirecettori cellulari dei sapovirus.

Il virus penetra nella cellula per endocitosi.
Replicazione: sintesi mRNA e produzione dei
trascritti virali

Calicivirus si replicano in sede citoplasmatica associati a membrane intracellulari.

Nella cellula si riscontrano 2 tipi di RNA:
RNA genomico: codifica per proteine non strutturali (RNApolimerasi-RNA
dipendente (RdRp), l’elicasi e la proteasi).
RNA subgenomico: codifica per le proteine strutturali.






Questa strategia (tipica dei virus ssRNA+) viene utilizzata per ottenere una
separazione temporale delle fasi precoci e tardiva della replicazione:
fase precoce: RNA+ virale funziona da mRNA e tradotto in una poliproteina, poi
processata nelle varie proteine non strutturali: elicasi, proteasi e RdRp.
RdRp si attiva a formare filamento complementare a ssRNA+→ intermedio RNA(-)
su cui si sintetizza mRNA (+) subgenomico.
Nella fase tardiva dall’mRNA (+) subgenomico si ottengono direttamente, per
sintesi ribosomiale, le proteine strutturali capsidiche.
Replicazione: replicazione genoma,
assemblaggio e maturazione

La replicazione del genoma avviene attraverso un intermedio a polarità negativa.

RdRp si attiva a formare filamenti complementari RNA(-)

Da questo intermedio a polarità negativa si sintetizzano gli mRNA(+) subgenomici,
ma si formano anche molecole di RNA (+) genomico, della stessa dimensione
dell'RNA(-) stampo (NON di dimensioni ridotte), che risultano quindi essere
identiche al genoma virale e sono utilizzate nell'assemblaggio dei virioni.

La fase di maturazione si realizza nel citoplasma e la liberazione dei nuovi virioni
si ha per lisi cellulare.
Patogenesi

Si trasmettono per via oro-fecale, sia indirettamente (esposizione ad acqua o cibo
contaminato) sia direttamente (contatto con persone infette).

Non noti i precisi meccanismi del vomito e della diarrea ma studi effettuati sui R dei
norovirus rivestono ruolo determinante nella comprensione dei meccanismi
patogenetici.

Per accedere alle cellule verso le quali hanno tropismo devono superare diverse
barriere: norovirus sopravvive nella saliva e nello stomaco.

Secrezione salivare: gli oligosaccaridi componenti l’antigene H esibiscono una bassa
affinità per l’antirecettore virale e non hanno capacità di neutralizzare il virus.

Ambiente acido dello stomaco non danneggia il virus, che raggiunge l’intestino
tenue, ove si replica attivamente.

Diarrea è associata a transitorio malassorbimento carboidrati/grassi e a mancata
attività di enzimi.
Risposta Immunitaria

Studi condotti su volontari indicano che l’immunità anti-calicivirus è di breve
durata e che la risposta immune nei confronti di un ceppo non fornisce
buona protezione dall’infezione con ceppi eterologhi.

Vi è, generalmente, una limitata cross-reattività tra genotipi di uno stesso
genogruppo e una scarsissima reattività nei confronti di ceppi di
genogruppo differente.

La protezione è pertanto omologa e l’immunità non superiore a 6 mesi.

La produzione di IgA salivari specifiche in corso di infezione da norovirus è
stata correlata a una protezione contro manifestazioni più gravi.
ACCERTAMENTI MICROBIOLOGICI, DIAGNOSTICA

La diagnosi delle calicivirosi, al contrario di quanto accade per altre
malattie virali, si avvale esclusivamente di metodi diretti volti cioè ad
identificare il patogeno, o parti di esso, nei campioni (feci-vomito).

Non esistendo linee cellulari sulle quali era possibile coltivare il virus,
l’osservazione al microscopio elettronico era uno dei mezzi d’elezione per
la diagnosi → oggi poco usata e sostituita con saggi immunoenzimatici e
saggi di agglutinazione per rilevamento di Ag virali.

Approccio diagnostico più sensibile è la PCR (Real Time).
PICORNAVIRUS: RHINOVIRUS
Picornavirus
N.B. recentemente (2008) aggiunto il genere Parechovirus per
Echovirus 22 e 23 notevolmente diversi dagli altri
Caratteristiche generali
Famiglia: Picornaviridae
Pericapside assente (virus nudi)
Dimensioni: piccoli, da 25 a 30 nm
Capside: simmetria icosaedrica (20 facce, 12 vertici)
Caratteristiche generali
Studi di cristallografia a raggi X hanno evidenziato presenza di una stretta
depressione della struttura capsidica, profonda 25 Å, che corre intorno ai 12
vertici, denominata “canyon”.
 All’interno del “canyon”, che non permette l’ingresso di molecole
anticorpali, avviene l’interazione della VP4
con R cellulare specifico.

Caratteristiche generali - Genoma
Genoma: RNA a singolo filamento a polarità positiva → ssRNA(+).
 Replicazione: citoplasmatica
 Il genoma (infettivo) è costituito da 7200 nucleotidi, è poliadenilato all'estremo 3' e
possiede una piccola proteina (Virion Protein genomic -VPg) legata covalentemente
all'estremo 5' al posto del caratteristico CAP degli mRNA eucariotici.
 VPg non necessaria per per la traduzione del genoma ma per sua replicazione.

Caratteristiche Rhinovirus

Molti simili a enterovirus nella composizione proteica, nella struttura del virione e nel
ciclo replicativo→ per questo riclassificati e non costituiscono più genere a sé stante.

Tuttavia, alcune importanti proprietà fisico-chimiche li differenziano da tutti gli altri
picornavirus:




Sensibili all’esposizione ad ambiente acido (pH < 5); quindi non sono in grado di
infettare la mucosa intestinale (come invece fanno gli enterovirus).
Crescono generalmente meglio a temperature di 33-35 °C piuttosto che a 37°C;
questo spiega il tropismo per le prime vie aeree (moltiplicazione a livello del tratto
respiratorio superiore).
Rhinovirus dal greco Reno= naso → optimum di temperatura di incubazione 33°C e
pH 7 (temperatura delle cavità nasali).
Recentemente è stata dimostrata capacità di replicarsi in cellule epitelio bronchiale.
Classificazione e Caratteristiche Rhinovirus

I Rhinovirus comprendono più di 130 sierotipi/genotipi che infettano
l’uomo causando il cosiddetto “raffreddore comune”
(30% dei raffreddori) e altre affezioni respiratorie.

In base al tipo di recettore cellulare, si distinguono:

100 genotipi di rinovirus che utilizzano una
proteina di membrana di tipo 1,
InterCellular Adhesion Molecole 1
(ICAM-1, CD54), della superfamiglia delle Ig.

12 genotipi che utilizzano lipoproteine di
membrana a bassa densità, Low Density
Lipoprotein Receptor (LDLR).

altri che utilizzano un R non ancora identificato.
ICAM-1 are
glycoproteins that are
anchored in the membrane
which they span once.
Their extracellular
regions, to which the
picornavirus binds, 5
immunoglobulin-like
domains, with
immunoglobulin-like folds.
The virus binds to the
N-terminal domain.
ICAM-1 is protrudes
deep into the canyon.
Replicazione: attacco e penetrazione del
virus nella cellula ospite

Ciclo replicativo virale ha inizio con l’interazione specifica R cellulare - anti R virale
che permette l’ingresso e la liberazione del genoma nel citoplasma della cellula
ospite.

Picornavirus possono
o meno essere endocitati
ma comunque inducono la
formazione di pori.

Rhinovirus: internalizzazione del virione
avviene per endocitosi mediata da R;
la scapsidazione è favorita dalla progressiva
acidificazione endosomiale (pH 6.5→4.5)

Poliovirus invece può penetrare
per traslocazione diretta dell’RNA
attraverso pori.
Replicazione
1. Interazione dei picornavirus con R cellulari.
2.Genoma iniettato attraverso virione e
membrana cellulare oppure (2’) virione
endocitato e genoma rilasciato.
3.Genoma è utilizzato come mRNA per la
sintesi proteica. Una grossa poliproteina
tradotta dal genoma del virione.
4.Poliproteina scissa per via proteolitica in
proteine singole, compresa la RdRp.
5.RdRp produce filamento (−) dal genoma e
lo replica in tanti RNA+ genomici virali.
(VPg) si attacca con legame covalente
all’estremità 5 ’ del genoma virale.
6.Proteine strutturali si associano in struttura
capsidica, viene inserito il genoma e i virioni
sono rilasciati al momento della lisi cellulare.
Patogenesi

Trasmessi via aerosol di goccioline respiratorie e da
superfici contaminate, tra cui il contatto diretto da
persona a persona.

Si replicano nelle mucose nasali, in modo più o meno
intenso a seconda della carica virale d’inoculo, con una
breve incubazione (1-4 giorni) che precede la
sintomatologia tipica del raffreddore comune.

Sintomatologia dovuta non tanto a lisi virus-indotta delle
cellule dell’epitelio del nasofaringe quanto al rilascio di
mediatori di flogosi: le cellule infettate rilasciano
bradichinina, istamina ed interleuchine che sono
responsabili del naso che cola.

L’immunità è tipo specifica e dura qualche anno.
CORONAVIRUS
REOVIRUS (ROTAVIRUS)
CALICIVIRUS (NOROVIRUS)
PICORNAVIRUS (RHINOVIRUS)
Prof. O.E. Varnier – Dott.ssa Martini Isabella
Università degli Studi di Genova
Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia A.A. 2013-2014
Corso Integrato di Malattie Infettive e Microbiologia Clinica