ESPRESSIONE DI ABCB1 IN LINFOCITI T DEL SANGUE

Cattani Elia
Lavoro di diploma
Formazione Tecnico in Analisi Biomediche SSS
Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno
2006
ESPRESSIONE DI ABCB1 IN
LINFOCITI T DEL SANGUE
PERIFERICO
Lavoro svolto presso:
Istituto di Ricerca in Biomedicina, Bellinzona
Con la collaborazione di:
David Jarrossay, PhD
Federica Sallusto, PhD
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Indice
Riassunto, Abstract
3
Introduzione
4
Materiali e metodi
6
Risultati
12
Conclusioni
27
Bibliografia
28
Ringraziamenti
30
Allegato
31
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
2
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Riassunto
Abstract
I trasportatori ABC (ATP-Binding
Cassette Transporters) sono dei
trasportatori
di
membrana
presenti in molti organismi dai
batteri
all’uomo
e
sono
caratterizzati da una sequenza
peptidica
conservata
responsabile del legame e
dell’idrolisi di ATP (1). Il
prototipo dei trasportatori ABC è
ABCB1 (chiamato anche MDR o
PGP) che conferisce resistenza
ai
farmaci
in
tumori
multiresistenti. Recentemente è
stato dimostrato che ABCB1 è
espresso
selettivamente
su
cellule B naive e permette di
discriminare queste ultime dalle
cellule B memoria e transizionali
(2).
In questo lavoro si dimostra che
il
trasportatore
ABCB1
é
espresso su tutti i subsets di
cellule T CD4+, che la sua
espressione
diminuisce
in
risposta ad uno stimolo specifico
di attivazione ed aumenta se le
cellule vengono tenute in coltura
in assenza di stimoli ottimali (3).
Inoltre lo studio dimostra che
ABCB1 é un marcatore di cellule
TH1, attraverso l’analisi della
produzione di citochine e con
analisi
dell’espressione
di
recettori per chemochine.
Bloccando ABCB1 si inibisce il
rilascio di citochine da parte
delle cellule della memoria
CD4+. Ciò suggerisce che il
recettore ABCB1 é implicato,
direttamente o indirettamente
nel processo, o più in generale
nell’attivazione delle cellule T.
ATP-binding cassette (ABC)
transporters are ubiquitously
present in most organisms from
bacteria to man. They are
characterized by a domain
responsible for the hydrolysis of
ATP. The prototype of ABCBtransporters is ABCB1 (also
called MDR or PGP) which
confers multidrug-resistance in
tumors.
Recently,
it
has
been
demonstrated that ABCB1 is
selectively expressed on naïve B
cells, and discriminates naïve B
cells from transitional and
memory B cells.
In this work we show that
ABCB1 is expressed on every
subset of T CD4+ cells and this
expression on naïve CD4+ cells
is downregulated by an optimal
activation and is upregulated in
absence of optimal stimulus.
By analyzing the expression of
chemokine receptors and the
release of cytokines we also
demonstrate that ABCB1 is a
TH1 marker.
Blocking ABCB1 down-regulated
the cytokine release by Memory
T CD4+ cells suggesting that this
receptor may be implicated
directly or indirectly in the
cytokine production or more
generally in the activation of
CD4 T cells.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
3
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Introduzione
I linfociti T e B del sangue comprendono cellule naive (ovvero
indifferenziate che non hanno ancora incontrato l’antigene) e cellule
della memoria (differenziate, in seguito ad una precedente stimolazione
antigenica, a cellule in grado di diventare immediatamente effettrici in
caso di una seconda stimolazione antigenica). La distinzione tra cellule
naive e memoria e la definizione di sottopopolazione di cellule memoria
con diverse funzioni è importante nel monitoraggio immunologico dopo
vaccinazioni o in patologia.
Recenti risultati ottenuti all’Istituto di Ricerca in Biomedicina hanno
dimostrato che un trasportatore cellulare appartenente alla famiglia
ABC (ATP-Binding Cassette Transporters), il cui prototipo è
rappresentato dalla molecola ABCB1 o MDR-1 che conferisce
resistenza ai farmaci in cellule tumorali, è espresso selettivamente su
cellule B naive e permette di discriminare queste ultime dalle cellule B
memoria e transizionali (2). L’obiettivo del lavoro di diploma qui
proposto e quello di analizzare l’espressione di ABCB1 su linfociti T
CD4+ naive e memoria del sangue periferico (vedi allegato).
Per poter identificare le cellule che esprimono il trasportatore ABCB1 si
sono usati dei coloranti, MTG o MTO, che entrano liberamente in tutte
le cellule e che vengono attivamente espulsi in cellule ABCB1 positive.
L’attività dei trasportatori può essere bloccata usando degli inibitori
come ad esempio il verapamil (aspecifico), l’MK571 (specifico per
ABCC1) o il PGP-4008 (specifico per ABCB1).
Le cellule T CD4+ sono anche dette T Helper (TH) perché hanno la
funzione di aiutare le altre cellule del sistema immunitario grazie alla
produzione di citochine o all’interazione diretta tra le cellule mediante i
loro recettori di superficie.
Durante la risposta immunologica le cellule T CD4+ possono ricevere tre
tipi di segnale da parte delle cellule dendritiche o altre cellule APC
(cellule presentanti l’antigene ):
1. L’antigene processato viene presentato da una cellula APC su
molecole MHC di classe II, per essere riconosciuto da una
cellula T CD4+ per mezzo di un recettore per l’antigene formato
dal TCR (Recettore della cellula T) e dal complesso CD3. In vitro
la stimolazione con l’antigene delle cellule CD4+ può essere
riprodotta incubando le cellule T CD4+ con anticorpi specifici
diretti contro la molecola CD3.
2. Costimolazione: il segnale di attivazione per le cellule T CD4+
risulta più forte se oltre al TCR vengono attivati altri recettori, il
più importante dei quali é il CD28. Il CD28 viene attivato in vivo
dal CD80 e CD86 delle cellule APC. In vitro la situazione si può
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
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riprodurre con anticorpi specifici anti-CD28 in grado di attivare,
legandolo, il recettore.
3. Segnale polarizzante: la differenziazione della cellula T CD4+
può essere influenzata dalla cellula APC con la produzione di
citochine. Le cellule TH possono essere distinte in 2 principali tipi
a seconda delle funzioni che svolgono nella risposta
immunitaria, TH1 e TH2, le cellule TH1 sono importanti nelle
risposte immunitarie contro microbi intracellulari ed hanno la
funzione di aiutare altre cellule T e macrofagi; le cellule TH2 sono
coinvolte nelle risposte contro parassiti e microbi extracellulari
ed aiutano le cellule B a produrre anticorpi (T-B-Help). Le cellule
T naive si differenziano in TH1 in presenza di IL-12 ed in TH2 in
presenza di IL-4. Questa caratteristica viene riprodotta in vitro,
aggiungendo IL-12 e anticorpi anti-IL-4 per stimolare al
differenziazione in TH1, e con aggiunta di IL-4 e anti-IL-12 per
stimolare la differenziazione in TH2.
Le cellule TH1 e TH2 possono essere distinte tra loro grazie
all’espressione di recettori per chemochine quali CCR5 e CXCR3
(espressi su TH1) o CCR3, CCR4 e CRTH2 (espresso su TH2) oppure
grazie alla produzione di citochine da parte delle cellule, Le cellule TH1
producono soprattutto IFN-γ mentre le cellule TH2 producono soprattutto
IL-4 (4-7).
In questo lavoro si cerca una relazione tra l’espressione di ABCB1 e le
cellule TH1 e TH2 e si valuta l’espressione del trasportatore in diverse
condizioni.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
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Materiali e metodi
Isolamento delle cellule mononucleate (PBMC) a partire da
Buffy Coat
I Buffy Coat, un concentrato di leucociti che si ottiene centrifugando il
sangue intero anticoagulato, sono forniti dai centri trasfusionali della
Croce Rossa di Lugano o di Basilea, hanno un volume compreso tra 60
e 80 ml. Il buffy coat viene diluito fino a raggiungere un volume di 180
ml con RPMI Complete Medium (RPMI 1640 Medium con 25 mM
Hepes, GIBCO Invitrogen, Paislex, Scozia, cat. 42401-018).
In sei tubi vengono pipettati 13 ml di Lymphocyte Separation Medium
(LSM, 9,4 g di Diatrizoato di sodio e 6,2 g di Ficoll per 100ml, MP
Biomedicals LLC, Thuringer Strasse 15, 37269 Eschwege, Germania,
cat 50494) ai quali vengono aggiunti 30 ml della soluzione ottenuta
diluendo il Buffy Coat, pipettando delicatamente evitando che il Buffy
Coat diluito si mescoli con il LSM (8-10).
I 6 tubi vengono centrifugati per 30 min a 2000 rpm a 18°C (con bassa
accelerazione e decelerazione).
Le fasi contenenti le cellule mononucleate vengono aspirate e unite in
un nuovo tubo, le cellule vengono lavate due volte con Washing
Medium (RPMI complete con 1% di FCS [Fetal Calf Serum, GIBCO
Invitrogen, cat. 26140-111]).
Isolamento di linfociti T CD4
I linfociti T CD4+ vengono isolati a partire da PBMC con il metodo
MACS (MAgnetic Cell Sorting) CD4 MicroBeads (CD4 MicroBeads
Human, Miltenyi Biotech Gmbh, 51429 Bergisch Gladbach, Germania,
cat. 130-045-101). Le cellule vengono incubate con un anticorpo
specifico anti-CD4 ad una concentrazione di 2.5 µg/ml marcato con
particelle magnetiche per 20 min a 4°C, dopo un lavaggio le cellule
vengono passate in una colonna posta all’interno di un magnete. Le
cellule legate dall’anticorpo marcato magneticamente rimangono nella
colonna e vengono eluite in seguito.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
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Colorazione con Mitotrackers per espressione di trasportatori
ABC
Le cellule CD4+ vengono colorate con un anticorpo specifico antiCD45RA-PE (Monoclonal Antibody CD45RA-PE, Immunotech, cat.
1834) ad una concentrazione di 2.5 µg/ml incubate 20 min a 4° C e poi
lavate 2 volte con Washing Medium. Le cellule vengono incubate a
37°C in RPMI 10% FCS per 20 minuti con aggiunta di MTG ad una
concentrazione di 100 nM (Mito Tracker Green FM, Molecular Probes,
cat. M7514), in 3 condizioni diverse: senza inibitori e con 2 inibitori
specifici. Come inibitori specifici si sono usati MK571 (Alexis
Biochemicals, Lausen CH, cat. 340-021-M005) ad una concentrazione
di 25 nM per inibire specificamente ABCC1 e PGP-4008 (Alexis, cat:
270-290-M002) ad una concentrazione di 10 nM per inibire
specificamente ABCB1. Dopo incubazione le cellule vengono lavate con
Washing Medium e quindi risospese in PBS (PBS privo di CaCl2 e
MgCl2, GIBCO Invitrogen, cat. 20012-019) con 1% FCS e analizzate al
citofluorimetro.
Stimolazione di cellule Naive CD4+ e analisi dell’espressione
di ABCB1
Le cellule naive CD4+ sono ottenute a partire da Buffy coat con
gradiente di Ficoll e CD4 MACS, colorate con anti-CD45RA-APC (APCanti-human CD45RA, BD Pharmingen, cat. 550855) in PBS 1%FCS ad
una concentrazione di 2.5 µg/ml, e sortate con FACSAria. Le cellule
sono poi risospese ad una concentrazione di 106 cellule/ml.
Le cellule vengono attivate in piastra con pozzetti ricoperti di anticorpi
specifici, preparati in precedenza mettendo 50 µl di soluzione di
anticorpi in PBS ( PBS con Cacl2 e MgCl2, GIBCO Invitrogen, cat.
14040-091). Le cellule sono attivate in 2 modi diversi, con anti-CD3
(clone TR66) o con anti CD3 e Anti CD28 (BD Pharmingen, cat.
553295), per diversi tempi.
In ogni pozzetto vengono aggiunti 200 µl di sospensione cellulare, la
piastra viene messa a 37°C e in tempi diversi viene effettuata la
colorazione con MTG, con l’aggiunta di 10 µl di soluzione di biglie
(6x105 beads/ml, 6000 beads, SPHERO Rainbow Calibration Particles,
BD Biosciences Pharmingen, cat. 559123) viene contato il numero di
cellule vive, contando 1500 beads. Ogni volta vengono contate le
cellule vive e analizzata l’espressione di ABCB1. Le cellule sono
analizzate al tempo 0, dopo 4, 24, 48, 72 e 144 ore. Le cellule dopo
attivazione vengono tenute in coltura a 37°C in RPMI 10% FCS ed
analizzate contemporaneamente alle altre in modo da seguire
l’espressione di ABCB1 una volta cessato lo stimolo.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
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Analisi dell’espressione di recettori per chemochine.
Le cellule CD4+ vengono risospese ad una concentrazione di 106
cellule/ml, Vengono pipettati 100 µl di sospensione in 8 pozzetti in una
piastra, 4 per le colorazioni con anticorpi specifici per chemochine e 4
come controlli negativi. Dopo centrifugazione le cellule vengono
risospese nella soluzione di PBS 1% FCS con l’anticorpo anti-recettore
per chemochine ad una concentrazione di 2.5 µg/ml. Le cellule sono
colorate rispettivamente con anti-CXCR3-PE (PE-anti-human-CD183
(CXCR3), BD Pharmingen, cat. 557185), anti-CCR5-PE (PE-antihuman-CCR5, R&D System, Minneapolis, cat. FAB155P), anti-CRTH2
(clone BM16, coniugato con biotina) e anti-CCR7-PE (PE-anti-humanCCR7, R&D System, cat. FAB197P), dopo un incubazione di 20 min a
4°C le cellule vengono lavate, nel pozzetto della colorazione con antiCRTH2 viene aggiunta streptavidina coniugata con PE (StreptavidinPE, Molecular Probes, cat. 5-866) ad una concentrazione di 2.5 µg/ml,
incubate per altre 20 min a 4°C. Alla fine delle colorazioni le cellule
vengono lavate 2 volte con PBS 1% FCS e risospese in 50 µl di PBS
1% FCS per essere analizzate al citofluorimetro.
Colorazione intracellulare per produzione di citochine ex vivo
Le cellule CD4+ sono isolate a partire da Buffy Coat su gradiente di
Ficoll e con il metodo CD4 MicroBeads. Le cellule CD4 sono poi
colorate con MTG, dopo lavaggio sono colorate con anticorpo antiCD45RA-PE ad una concentrazione di 2.5 µg/ml, dopo 2 lavaggi con
Washing Medium risospese in PBS 1% FCS. Le cellule vengono
separate con FACSAria in 4 popolazioni: naive MTG+, naive MTG-,
memory MTG+ e memory MTG-.
Le quattro popolazioni cellulari vengono risospese ad una
concentrazione di 106 cellule/ml, in una piastra vengono pipettati 2 volte
200 µl di ogni sospensione, un pozzetto verrà attivato e l’altro fungerà
da controllo negativo.
Le cellule vengono attivate in RPMI 10% FCS con PMA (1-metoxi-2propilacetato, Invitrogen, cat. 108-65-6 ) ad una concentrazione di 10-7
M e ionomicina (Invitrogen, cat. 56092-82-1) ad una concentrazione di 1
µg/ml per 2 ore, poi viene aggiunta Brefeldina A (BFA, Invitrogen, cat.
20350-15-6) ad una concentrazione di 10 µg/ml ed incubate per altre 2
ore. Le cellule vengono poi lavate 2 volte con PBS 1% FCS vengono
aggiunti 50 µl di soluzione di fissaggio di formaldeide (fix solution,
Becton Dickinson, cat. 51-2090-KZ ) e incubate 15 min a 4°C, le cellule
vengono poi lavate 2 volte con soluzione permeabilizzante
(Perm/Wash, Becton Dickinson, cat. 51-2091-KZ), le cellule sono poi
colorate con anticorpi specifici anticitochine: anti-IL-4 (PE-anti-human
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
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IL-4 , BD Pharmingen, cat. 554485) e anti-IFN-γ (APC-anti-human IFNγ, BD Pharmingen, cat. 554702), entrambi ad una concentrazione di
0.2 µg/ml, ed incubati per 30 min a 4°C. Dopo 2 lavaggi con Soluzione
permeabilizzante le cellule sono risospese in PBS 1% FCS ed
analizzate al citofluorimetro (11-12).
Beads Array per produzione di citochine
Le quattro popolazioni sortate (naive MTG-, naive MTG+, memory
MTG- e memory MTG+) sono attivate in piastra in 4 pozzetti diversi
ricoperti di anticorpi specifici, preparata in precedenza mettendo 50 µl di
soluzione di anticorpi anti-CD3 (clone TR66) e anti-CD28 (BD
Pharmingen, cat. 553295) in PBS ad una concentrazione di 2 µg/ml (
PBS con Cacl2 e MgCl2, GIBCO Invitrogen, cat. 14040-091) e lasciate
a 4°C per una notte. Le cellule vengono incubate in RPMI 10% FCS per
48 ore a 37°C, dopo incubazione il sovranatante viene separato dalle e
cellule e vi viene analizzata la concentrazione di IL-4 e IFN-γ µl con il
metodo Beads Array (Becton Dickinson) al citofluorimetro. Viene
preparata una serie di 8 standard a partire da una soluzione con
concentrazione di IL-4 e di IFN-γ di 5000 pg/ml con una diluizione
seriale 1:2.
A 50 µl di sovranatante o standard vengono aggiunti 50 µl di capture
beads solution, ottenuta miscelando 4 µl di Biglie anti-IL-4 (BD CBA
Human-IL-4 Capture Bead A5, Becton Dickinson, cat. 51-9004035) e 4
µl di Biglie anti-IFNγ (BD CBA Human-IFNγ Capture Bead E7, Becton
Dickinson, cat. 51-9004029) e 992 µl di wash Buffer (BD CBA Wash
Buffer, Becton Dickinson, cat. 51-9003797).
Dopo incubazione di 1 ora a TA vengono aggiunti 50 µl di detection
reagent preparato con 992 µl di wash Buffer, 4 µl di anti-IL-4-PE
(Human IL-4 PE Detection Reagent, Becton Dickinson, cat. 519004037) e 4 µl di anti-IFN-γ-PE (Human IFN-γ PE Detection Reagent,
Becton Dickinson, cat. 51-9004031) ed incubate per 2 ore a TA e al
riparo dalla luce. Le biglie vengono poi lavate con 150 µl di Wash Buffer
e risospese in 150 µl di Wash Buffer per essere poi analizzate al
citofluorimetro.
Colorazione intracellulare per produzione di citochine in vitro
Le cellule CD4+ sono colorate con anticorpi specifici anti-CD45RA-FITC
(Monoclonal Antibody CD45RA-FITC, Immunotech, cat. 0584) ad una
concentrazione di 2.5 µg/ml. Al FACSAria (Becton Dickinson) vengono
sortate le cellule naive (CD45RA+).
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Le cellule così separate sono lavate in PBS, colorate con CFSE ad una
concentrazione di 0.5 µM in PBS per 8 min a TA, poi lavate 2 volte con
RPMI 10 % FCS e risospese ad una concentrazione di 106 cellule/ml.
Separatamente delle cellule dendritiche provenienti da un altro donatore
sono attivate per 3 ore con LPS (lipopolisaccaridi, E. Coli 0111:B4 LPS,
Invitrogen, cat. tlrl-pelps) ad una concentrazione di 100 ng/ml in RPMI
10% FCS. Dopo un lavaggio sono risospese anch’esse a 106 cellule/ml.
In una piastra vengono pipettati 200 µl di sospensione cellulari sortate e
40 µl di cellule dendritiche (rapporto 5:1) per l’attivazione delle cellule T.
Le cellule sono messe in diverse condizioni:
• Controllo senza aggiunte
• Condizioni TH1; con aggiunta di IL-12 (Recombinant Human IL12, BD Pharmingen, cat. 554613) ad una concentrazione di 10
ng/ml e anti-IL4 (Purified Human anti-IL-42, BD Pharmingen, cat.
554434) ad una concentrazione di 2 µg/ml.
• Condizioni TH2; con aggiunta di IL-4 (Recombinant Human IL-4,
BD Pharmingen, cat. 554605) ad una concentrazione di 10 ng/ml
e anti-IL12 (Purified Human anti-IL-12, BD Pharmingen, cat.
551227) ad una concentrazione di 2 µg/ml.
Le cellule sono incubate per 5 giorni. Dopo incubazione le cellule sono
sottoposte a colorazione intracellulare per l’analisi della produzione di
citochine e una colorazione con MTO (Mito cracker Orange, CMTMRos,
Molecular Probes, cat. M-7510). Le cellule vengono separate in 4
porzioni, attivate con PMA 10-7 M e ionomicina 1 µg/ml per 1.5 ore, poi
viene aggiunta BFA 10 µg/ml ed incubate altre 1.5 ore. Durante gli ultimi
20 min viene aggiunto MTO ad una concentrazione di 50 nM . Alla metà
delle cellule viene aggiunto Verapamil (Verapamil hydrochloride, Sigma,
cat. V4629) ad una concentrazione di 50 µM per inibire ABCB1 e
fungere quindi da controllo positivo (13).
Le cellule vengono lavate 2 volte con PBS 1% FCS, vengono fissate
per 15 min con fix solution in ghiaccio, le cellule vengono poi lavate 2
volte con soluzione permeabilizzante (Permeabilisation Buffer), poi nei
diversi pozzetti vengono colorate con anticorpi specifici anti-citochine:
anti-IL-4 (APC-anti-human IL-4 , BD Pharmingen, cat. 554486) o antiIFN-γ (APC-anti-human IFN-γ, BD Pharmingen, cat. 554702), entrambi
ad una concentrazione di 0.2 µg/ml, ed incubati per 30 min a 4 C. Dopo
2 lavaggi con soluzione permeabilizzante le cellule sono risospese in
PBS 1% FCS ed analizzate al citofluorimetro.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
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Analisi della produzione di citochine da parte di cellule della
memoria con inibizione di trasportatori ABC
Le cellule della memoria CD4+ sono ottenute a partire da Buffy Coat
con gradiente di Ficoll e CD4 MACS. Le cellule CD4+ sono poi colorate
con anti-CD45RA-APC (APC-anti-human CD45RA, BD Pharmingen,
cat. 550855) ed al sorter sono isolate le cellule negative.
Le cellule della memoria vengono risospese ad una concentrazione di
106 cellule/ml ed in ogni pozzetto vengono pipettati 100 µl di
sospensione cellulare. Le cellule sono attivate con PMA 10-7 M e
ionomicina 1 µg/ml per 2 ore in diverse condizioni. un controllo negativo
(senza PMA e ionomicina) e un controllo positivo. Negli altri pozzetti
viene aggiunto un inibitore per trasportatori ABC, rispettivamente:
Verapamil (Verapamil hydrochloride, Sigma, cat. V4629) ad una
concentrazione di 50 µM, Ciclosporina A (Ciclosporine, Bedford Labs,
Bedford OH 44146 USA, cat. 55390-122-10) ad una concentrazione di
25 µM, e PGP in 3 diverse concentrazioni 5, 10 e 20 nM (Alexis, cat.
270-290-M002).
Dopo 2 ore le cellule vengono separate dal sovranatante e nel
sovranatante viene misurata la concentrazione di IL-2, IL-4 e IFN-γ con
il metodo Beads Array (già descritto sopra).
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
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Risultati e discussione
Colorazione con MTG per espressione di ABCB1
Il colorante MTG permea liberamente le cellule attraversandone la
membrana ed è espulso da trasportatori ABC, per accertarne la
presenza su linfociti T CD4+, le cellule ottenute da buffy coat con
gradiente di Ficoll e purificazione con CD4 Microbeads, sono state
risospese in RPMI 10% FCS, un mezzo in cui possono svolgere in vitro
le loro normali funzioni, e vi è stato aggiunto il colorante MTG. Dopo un
lavaggio per togliere il colorante in eccesso le cellule che non
esprimono un trasportatore ABC in grado di espellere il colorante
risultano positive all’analisi al citofluorimetro, mentre quelle che
esprimono un trasportatore ABC risultano negative. Per identificare il
subset cellulare che esprime il trasportatore ABC le cellule sono state
colorate con CD45RA-PE per identificare le cellule T naive (CD45RA+)
e memory (CD45RA-).
Le cellule sono state colorate in 3 condizioni diverse: solo con MTG, o
con l’aggiunta di un inibitore specifico per trasportatori ABC, con MK571
per inibire specificamente ABCC1 e con PGP-4008 per inibire
specificamente ABCB1.
L’analisi al citoflurimetro ha permesso di evidenziare due subset in tutte
e due le popolazioni, la percentuale di cellule naive che esprimono un
trasportatore in grado di espellere il colorante è risultata essere del
17%, mentre la percentuale di cellule della memoria che esprimono un
trasportatore ABC è risultata essere del 15%.
Con l’uso di inibitori, solo PGP-4008 (specifico per ABCB1) é stato in
grado di inibire l’espulsione del colorante, mentre MK571 (specifico per
ABCBC1 non é stato in grado di inibirla. Questo indica che il
trasportatore ABC espresso su linfociti T CD4+ é ABCB1 (Figura 1).
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
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A
B
MTG (FL1)
C
Controllo
PGP-4008
MK571
Percentuale di cellule MTG- (ABCB1+)
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
naive
memory
Controllo
MK571
PGP-4008
Figura 1. Espressione funzionale di ABCB1 in cellule CD4.
Inibizione con PGP-4008 (verde), con MK571 (blu) e senza inibitori
(rosso) su cellule CD4+ della memoria (A) e naive (B) e percentuale di
cellule MTG- (ABCB1+) con l’uso dei diversi inibitori (C).
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
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Stimolazione di cellule
dell’espressione di ABCB1
2006
Naive
CD4
e
analisi
Le cellule naive CD4 sono isolate grazie alla colorazione con anticorpi
specifici anti-CD45RA-APC a partire da Buffy Coat dopo purificazione
con CD4 MACS, vengono attivate in coltura in piastra in due modi
diversi: con anti-CD3 o con anti-CD3 e anti-CD28, le cellule vengono
attivate per tempi diversi (4, 24, 48 e 72 ore) e dopo attivazione tenute
in coltura in RPMI 10% FCS e sempre analizzate ai tempi seguenti per
seguire l’espressione di ABCB1. Il numero di cellule presenti in ogni
pozzetto viene misurato con l’aggiunta di Beads, il numero delle cellule
è riferito a 1500 biglie, in quanto non si vuole seguire il numero effettivo
di cellule presenti in ogni pozzetto, ma la variazione del loro numero nel
tempo. L’espressione di ABCB1 è misurata con colorazione con MTG.
Dai risultati si può vedere come il numero di cellule non aumenti dopo
attivazione con solo anti-CD3 (Figura 2A), lo stimolo non è
sufficientemente forte, ma aumenti in modo significativo con
l’attivazione con anti-CD3 e anti-CD28 (Figura 2B), dove lo stimolo è
sufficientemente forte.
L’espressione di ABCB1 non varia in modo significativo dopo
attivazione con anti-CD3 (Figura 3A). All’attivazione con anti-CD3 e anti
CD28 (Figura 3B)si può però notare come l’espressione di ABCB1
(quindi la percentuale di cellule MTG-) diminuisca dopo un’attivazione di
almeno 24 ore, si può notare come la percentuale di cellule MTG
negative passi da più del 90% fino a circa il 50%. Se le cellule vengono
poi tenute in coltura la percentuale di cellule negative ritorna a salire.
Quindi l’espressione di ABCB1 diminuisce se le cellule ricevono uno
stimolo specifico all’attivazione e aumenta se le cellule vengono tenute
in coltura in assenza di stimoli ottimali.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
14
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
A
attivazione con CD3
40000
no cellule vive
30000
4h CD3
24h CD3
20000
48h CD3
72h CD3
no stimolo
10000
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
ore
B
attivazione con CD3 CD28
200000
no cellule vive
150000
4h CD3/28
24h CD3/28
100000
48h CD3/28
72h CD3/28
no stimolo
50000
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
ore
Figura 2. Sopravvivenza cellulare dopo attivazione. Le cellule naive
sono sortate e messe in coltura con anticorpi anti-CD3 (A) o anti-CD3 e
anti-CD28 (B), il numero di cellule viene misurato con aggiunta di biglie
e quantificate per 1500 biglie.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
15
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
A
attivazione con CD3
100
% neg cells
90
nessun
80
4h CD3
70
24h CD3
48h CD3
60
72h CD3
50
40
0
20
40
60
80
100
120
140
160
ore
B
attivazione con CD3 CD28
100
% negative cells
90
nessun
80
4h CD3/28
24h CD3/28
70
48h CD3/28
60
72h CD3/28
50
40
0
20
40
60
80
100
120
140
160
ore
Figura 3. Espressione di ABCB1 dopo attivazione. Le cellule naive
sono sortate e messe in coltura con anticorpi anti-CD3 (A) o anti-CD3 e
anti-CD28 (B), l’espressione di ABCB1 è misurata grazie a colorazione
con MTG, nel grafico è riportato il numero di cellule MTG negative e che
quindi esprimono ABCB1.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
16
Cattani Elia, SSMT, TAB
Analisi
dell’espressione
chemochine
2006
di
recettori
per
Per ulteriori analisi dell’espressione di ABCB1 su cellule T CD4+ si é
cercato di correlare la sua espressione con l’espressione di recettori per
chemochine.
Nell’esperimento le cellule CD4+ sono state colorate con MTG e di
seguito con anticorpi specifici anti-CD45RA-APC per distinguerle in
Naive e Memory e in quattro pozzetti diversi con anticorpi specifici antirecettori per chemochine: anti-CCR7, anti-CXCR3, anti-CCR5 tutti
coniugati con PE e con anti-CRTH2-biotina cui ha seguito una
colorazione con streptavidina-PE. Le cellule sono state poi analizzate al
citofluorimetro per valutare l’espressione dei recettori nelle varie
popolazioni (Figura 4).
Le cellule naive si possono dividere in due popolazioni con la
colorazione con MTG, tutte le cellule esprimono CCR7 e non esprimono
altri recettori di quelli analizzati (risultati non mostrati).
Le cellule della memoria hanno dato invece i seguenti risultati: le cellule
MTG positive (che quindi non esprimono ABCB1) sono risultate essere
in maggioranza CCR7 positive (Central Memory) mentre le cellule MTG
negative (che quindi esprimono ABCB1) sono risultate essere in
maggioranza CCR7 negative (Effector Memory). Quindi il trasportatore
ABCB1 è espresso principalmente su Effector Memory e in minor
quantità su Central Memory (12).
Le cellule MTG negative esprimono in maggioranza CXCR3 (77%)
rispetto alle cellule MTG positive (45%). CCR5 é espresso in
percentuale maggiore sulle cellule MTG negative.
Le uniche cellule che esprimono CRTH2 sono risultate essere MTG
positive.
CXCR3 e CCR5 sono espressi preferenzialmente su celllule TH1 (1417) mentre CRTH2 é espresso selettivamente su TH2 (18). I risultati di
questo esperimento suggeriscono che ABCB1 sia espresso
preferibilmente su cellule TH1.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
17
Cattani Elia, SSMT, TAB
45.2
2006
64
2.0
12.7
29.9
4.1
59.3
4.1
16.9
46.4
36.5
0.2
15.7
20.9
23.8
MTG
18.3
CXCR3
CRTH2
CCR5
CCR7
Figura 4. Espressione di recettori per chemochine su cellule della
memoria CD4+. Doppia colorazione di cellule T CD4 totali,
selezionando le cellule CD45RA-, mostrando la colorazione con MTG
contro diversi recettori per chemochine.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
18
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Colorazione intracellulare per produzione di citochine
ex vivo
Per confermare il risultato ottenuto con i recettori per chemochine, é
stata presa in considerazione la produzione di citochine da parte dei
diversi subsets di cellule T CD4+.
Le cellule CD4+ vengono sortate in quattro popolazioni: naive e memory
MTG negative e positive, in modo da poterle attivare separatamente
con PMA e ionomicina per 2 ore. Vengono poi incubate con BFA per
altre due ore in modo da bloccare il rilascio delle citochine. Le cellule
vengono poi fissate con una soluzione di formaldeide e colorate con
anticorpi specifici anti-IL4-PE e anti-IFN-γ-APC in una soluzione di
saponina che rende la membrana della cellula permeabile agli anticorpi,
che possono penetrare all’interno della cellula e colorare le citochine
prodotte. Le cellule sono poi analizzate al citofluorimetro (Figura 5A).
Le cellule naive non producono, in pratica, IL-4 e IFN-γ nelle condizioni
usate nell’esperimento. Le cellule della memoria invece producono
diverse citochine. Delle cellule della memoria MTG positive (che non
esprimono ABCB1) il 18.5% producono di IFN-γ, il 15% producono IL-4
e il 3.9% producono sia IL-4 che IFN-γ . Delle cellule della memoria
MTG negative (che esprimono ABCB1) il 56.3% delle cellule producono
IFNγ, il 4% sia IFNγ che IL-4 e solo l’1.4% IL-4. Come mostrato nei
grafici (figura 5B) le cellule della memoria MTG positive (M+) producono
molta IL-4 e poco IFN-γ, mentre le cellule della memoria MTG negative
(M-) producono meno IL-4 ma più IFN-γ.
Questo risultato conferma quelli ottenuti con l’espressione dei recettori
per chemochine e suggerisce nuovamente che ABCB1 é espresso di
preferenza su cellule TH1.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
19
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Memory MTG +
A
Memory MTG -
18.5
3.9
53.6
5.0
62.7
14.9
39.8
1.7
Naive MTG +
Naive MTG -
1.4
0.0
0.9
0.1
98.1
0.5
98.5
0.5
IFNγAPC
IL-4-PE
B
IFNg
20.0
18.0
16.0
14.0
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0
70.0
60.0
50.0
%
%
IL4
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
M+
M-
N+
N-
M+
M-
N+
N-
Figura 5. Produzione di citochine da parte di subset di cellule T
CD4+. (A) Le cellule CD4 naive e memory sono sortate grazie a
colorazione con MTG e poi analizzate per espressione di IL-4 e IFN-γ.
(B) Percentuale di cellule positive per IL-4 e IFN-γ nelle cellule naive
MTG+ e MTG-(N+ e N-) e memory MTG+ e MTG- (M+ e M-).
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
20
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Beads Array per produzione di citochine
Per confermare ulteriormente la produzione di citochine da parte dei
subsets di csllule T CD4+, si é misurato il rilascio di citochine da parte
delle cellule precedentemente sortate in naive e memory, MTG negative
e positive. Sono state dapprima attivate in piastra con anticorpi antiCD3 e anti-CD28. La piastra é stata preparata in precedenza mettendo
in ogni pozzetto 50 µl di soluzione di anticorpi in PBS con CaCl2 e
MgCl2 con una concentrazione di ogni anticorpo di 2 µg/ml. La piastra
viene tenuta a 4°C per una notte, durante la quale gli anticorpi
aderiscono alla parete dei pozzetti. Dopo un lavaggio con RPMI 10%
FCS vengono messe le sospensioni cellulari. Le cellule vengono
incubate per 48 ore in modo che abbiano il tempo di attivarsi. Dopo 48
ore il sovranatante viene separato dalle cellule per il test Bead Array,
detto anche ELISA in citometria. Grazie a delle biglie ricoperte di
anticorpi specifici per citochine si può misurare, mediante una serie di
standards, la concentrazione di diverse citochine. Le diverse biglie
hanno una fluorescenza intrinseca di diversa intensità (FL3) che ne
permette la discriminazione, gli anticorpi di cui sono ricoperte legano la
citochine ed un secondo anticorpo coniugato con PE lega la citochine
con una reazione a sandwich. L’intensità della fluorescenza in FL2 è
direttamente proporzionale alla concentrazione delle citochine nel
sovranatante.
La concentrazione di IL-4 nel sovranatante delle cellule naive è risultata
non misurabile, per le cellule memory MTG+ è risultata essere di 6552
pg/ml, per le cellule memory MTG- è risultata essere 284 pg/ml.
La concentrazione di IFN-γ nel sovranatante delle cellule naive MTG+ è
risultata non misurabile, per le cellule naive MTG- è risultata essere 551
pg/ml, per le cellule memory MTG+ è risultata essere di 52660 pg/ml,
per le cellule memory MTG- è risultata essere 85580 pg/ml. (Figura 6).
Come si vede dai grafici le cellule MTG+ producono più IL-4 e meno
IFN-γ rispetto alle cellule della memoria MTG-.Questo risultato conferma
i risultati fino a qui ottenuti, rinforzando le evidenze precedenti che
ABCB1 sia espresso preferibilmente su cellule TH1.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
21
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
IL4
IFNg
7000
90000
80000
6000
70000
5000
60000
4000
50000
3000
40000
30000
2000
20000
1000
10000
0
0
M+
M-
N+
N-
M+
M-
N+
N-
Figura 6. Bead Array per produzione di citochine. Le cellule CD4
sono sortate in memory MTG+ e MTG- e naive MTG+ e MTG-,
mediante colorazione con MTG e anti-CD45RA-PE. Le cellule sono poi
attivate in piastra con anti-CD3 e anti-CD28 per 48 ore. Il grafico riporta
la concentrazione (in pg/ml) di IL-4 e IFNγ misurata al citofluorimetro
con il metodo Beads Array (BD).
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
22
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Colorazione intracellulare per produzione di citochine
in vitro.
Dopo gli esperimenti ex-vivo (attivazione con anticorpi anti-CD3 e antiCD28 e attivazioni con PMA e ionomicina) si é voluta analizzare la
produzione di citochine in una situazione che meglio rispecchia quella
fisiologica. Per l’esperimento vengono usate cellule naive per vedere se
con il priming delle cellule dendritiche prolifereranno cellule ABCB1+
che produrranno grandi quantità di IFN-γ.
Dalle cellule CD4+ sono state isolate le cellule naive con colorazione
con anticorpi specifici anti-CD45RA-FITC. Le cellule isolate al
FACSAria sono colorate con CFSE, un colorante che si fissa a proteine
citoplasmatiche e che permette di seguire le divisioni cellulari. Infatti
una cellula con una data intensità di colorazione CFSE darà luogo,
dopo divisione a due cellule con intensità di colorazione dimezzata e
così via.
Le cellule naive vengono attivate con cellule dendritiche provenienti da
un donatore diverso attivate per 3 ore con lipopolisaccaridi. In ogni
pozzetto vengono messe 200'000 CD4+ e 40'000 cellule dendritiche, in
tre condizioni diverse: da una parte con aggiunta di IL-4 e anti IL-12 per
stimolare la differenziazione di cellule TH2 e bloccare la differenziazione
delle TH1 e dall’altra con aggiunta di IL-12 e anti-IL4 per stimolare la
differenziazione di cellule TH1 e bloccare la differenziazione di TH2 e
nella terza condizione senza aggiunta di citochine come controllo.
Le cellule vengono tenute in coltura in queste condizioni per 5 giorni e
poi vengono attivate con PMA e ionomicina per 1,5 ore, poi vi si
aggiunge BFA per altre 1,5 ore e per gli ultimi 20 minuti di stimolazione
le cellule sono divise in 2 e viene aggiunto MTO e ad una serie
verapamil per inibire ABCB1 e fare quindi da controllo positivo, dopo
lavaggio e fissazione le cellule vengono ulteriormente separate in due
porzioni e colorate con due anticorpi specifici anti-IL4 e anti-IFNγ entrambi coniugati con APC in soluzione di saponina per colorazione
intracellulare e infine analizzate al citofluorimetro. Con la colorazione
CFSE (FL1) vengono selezionate le cellule che sono state attivate dalle
celllule dendritiche e che quindi hanno cominciato a proliferare, di
queste si guarda poi MTO (FL2) contro la citochina (FL4).
Le cellule Naive hanno prodotto IFN-γ nel 93% delle cellule in condizioni
TH1 e queste sono soprattutto MTG- (86% delle cellule) mentre in
condizioni TH2 le cellule non hanno prodotto IFN-γ, le cellule Naive non
hanno in queste condizioni prodotto IL-4 (Figura 7).
Quindi l’esperimento ci fornisce un ulteriore conferma dell’evidenza che
ABCB1 sembra essere espresso di preferenza su cellule TH1.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
23
Cattani Elia, SSMT, TAB
Controllo
55.2
16.1
2006
Condizioni
TH1
22.4 80.4
6.3
5.9
1.2
3.9
1.8
71.8
22.5 84.6
Condizioni
TH2
13.1 1.7
0.5
0.2
14
69.8
0.7
IFNγ−
APC
27.9
0.7
0.2
73.7
25.4
IL-4APC
MTO (FL2)
Figura 7. Produzione di citochine dopo stimolazione in vitro su
cellule Naive. Le cellule naive sono state sortate a partire da cellule
CD4 totali, colorate con CFSE e messe in coltura con cellule dendritiche
di un diverso donatore. Nel grafico sono riportate la produzione di IL-4 e
IFNg da parte delle cellule che hanno ricevuto il priming da parte delle
cellule dendritiche.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
24
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Analisi della produzione di citochine da parte di cellule
della memoria con inibizione di trasportatori ABC
Per evidenziare se il trasportatore ABCB1 ha un influsso sul rilascio di
citochine da parte delle cellule CD4+, le cellule CD4+ totali sono colorate
con anticorpi specifici anti-CD45RA-APC ed al sorter sono state isolate
le cellule negative, le cellule della memoria. Per mettere in evidenza la
partecipazione del trasportatore ABCB1 nel rilascio di citochine da parte
delle cellule, le stesse vengono attivate con PMA e ionomicina per 2 ore
in presenza o assenza di inibitori dei trasportatori ABC (Verapamil,
Ciclosporina e PGP 4008). Dopo l’attivazione il sovranatante viene
separato dalle cellule ed in esso si é misurata la concentrazione di IL-2,
IL-4 e IFNγ.
Per controllare la sopravvivenza le cellule sono state risospese in PBS
1% FCS e con l’aggiunta di biglie si é valutata la concentrazione di
cellule presenti (figura 8 A). Il grafico dimostra che glil inibitori non
hanno indotto morte cellulare nelle concentrazioni utilizzate. La
percentuale di inibizione riportata nei grafici (figura 8 BCD) é stata
calcolata in base alla concentrazione misurata nel controllo positivo,
sottraendo ad ogni campione la concentrazione di citochina misurata
nel controllo negativo e normalizzandola con il numero di cellule vive
(calcolate grazie all’aggiunta di biglie) .
La produzione di citochine da parte delle cellule della memoria é
risultata essere influenzata dall’attività dei trasportatori ABC. Come si
vede dai grafici, la produzione di citochine risulta essere inferiore con
l’uso di inibitori, l’inibitore più efficace risulta essere la ciclosporina (oltre
a bloccare i trasportatori ABC inibisce anche la trascrizione dei geni
codificanti per le citochine (19)), anche Verapamil inibisce la secrezione
delle citochine analizzate, anche se in modo minore rispetto alla
ciclosporina.
L’inibitore specifico per ABCB1 (PGP 4008) inibisce anch’esso la
liberazione di tutte le citochine analizzate, anche se in modo meno
efficace, inoltre si può notare un effetto dose-dipendente, in quanto se
si diminuisce la concentrazione di inibitore la secrezione di citochine
aumenta. Questo indica un coinvolgimento del trasportatore ABCB1 nel
rilascio di citochine da parte delle cellule della memoria. E’ possibile
ipotizzare che anche se non implicato direttamente nel rilascio delle
citochine analizzate ABCB1 regola l’attività di altri trasportatori implicati
nel rilascio di citochine. Alcuni trasportatori ABC sono infatti noti per
regolare altri trasportatori con diverse funzioni (20). Inoltre non é
escluso che i trasportatori ABC siano coinvolti, in maniera più generale,
nell’attivazione delle cellule T.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
25
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Numero di cellule con inibitore PGP in diverse
concentrazioni
A
30000
25000
numero di cellule
PGP
Verapamil (50 µM)
20000
CsA (25 µM)
15000
10000
5000
0
0
5
10
15
20
25
Concentrazione (nM)
Percentuale di inibizione del rilascio di IL-2
B
100
90
% di inibizione
80
70
60
PGP
50
Verapamil (50 µM)
40
CsA (25 µM)
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
Concentrazione (nM)
Percentuale di inibizione del rilascio di IL-4
C
100
90
% di inibizione
80
70
60
IL-4
50
Verapamil (50 µM)
CsA (25 µM)
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
Concentrazione (nM)
Percentuale di inibizione del rilascio di IFNγ
D
100
90
% di inibizione
80
70
60
IFNg
50
Verapamil (50 µM)
40
CsA (25 µM)
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
Concentrazione (nM)
Figura 6. Rilascio di citochine da parte di cellule della memoria con
inibitori per trasportatori ABC. Le cellule della memoria sono state
attivate con PMA e ionomicina per 2 ore. Le cellule sono state contate
grazie all’aggiunta di biglie (A). Nel sovranatante sono state misurate IL2, IL-4 e IFNγ (B, C e D) con il metodo Beads Array (BD). Il rilascio di
citochine risulta inibito con l’uso di inibitori per trasportatori ABC
aspecifici, Verapamil e CsA, e con PGP 4008 specifico per ABCB1 che
mostra un effetto dipendente dalla dose.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
26
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Conclusioni
Il trasportatore ABCB1 è espresso su ogni subset di cellule CD4.
Questo si è dimostrato grazie all’uso di inibitori specifici di trasportatori
ABC. L’espressione di ABCB1 può variare a seconda delle condizioni in
cui si trovano le cellule, in questo lavoro si è visto che l’espressione di
ABCB1 su cellule T Naive diminuisce quando le cellule ricevono uno
stimolo specifico di attivazione dato da anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 e
che l’espressione del trasportatore ritorna ai valori iniziali se le cellule
vengono successivamente tenute in coltura in assenza di stimoli.
Quindi l’espressione del trasportatore ABCB1 viene indotta se le cellule
vengono tenute in coltura o attivate con solo anti-CD3, l’espressione di
ABCB1 viene invece inibita se le cellule ricevono uno stimolo di
attivazione dato da anticorpi anti-CD3 e anti-CD28. Il trasportatore
potrebbe essere un marcatore di ”stress”, visto che le cellule in coltura
senza stimolo sufficientemente forte di attivazione subiscono una forma
di ”stress”.
Le cellule che esprimono ABCB1 sono risultate essere arricchite in
cellule TH1 e le cellule che non esprimono ABCB1 sono risultate essere
arricchite in cellule TH2. Questo è stato dimostrato grazie
all’espressione di recettori che caratterizzano le due sottopopolazioni, in
particolare CCR5, che è espresso su cellule TH1, espresso su cellule
ABCB1 positive mentre CRTH2, specifico per TH2 é espresso
solamente su cellule ABCB1 negative. Gli stessi risultati si sono ottenuti
con gli esperimenti per la produzione di citochine, sia con colorazione
intracellulare che con Beads Array, si è dimostrato come le cellule che
esprimono ABCB1 producano grandi quantità di IFNγ e minori quantità
di IL-4 rispetto alle cellule che non esprimono ABCB1. Questo concorda
nel dire che le cellule che esprimono ABCB1 sono prevalentemente di
tipo TH1 e le cellule che non esprimono ABCB1 sono prevalentemente
TH2. I dati quindi suggeriscono che l’espressione del trasportatore
ABCB1 sia parte del programma di differenziazione in TH1.
I dati ottenuti dimostrano anche che il trasportatore ABCB1 é coinvolto
nel rilascio di citochine da parte delle cellule T della memoria. Non é
chiaro però in che modo esso sia coinvolto. Probabilmente ABCB1 é
coinvolto indirettamente nel rilascio di queste citochine, regolando
l’attività del trasportatore direttamente responsabile per il loro rilascio o,
in modo più generale, l’attivazione delle cellule T.
Nel futuro si dovrà determinare più specificamente in quale processo
cellulare delle cellule T CD4+ sono implicati i trasportatori ABC. Si può
già affermare, in ogni caso, che non hanno funzioni esclusivamente di
trasporto di sostanze attraverso la membrana cellulare.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
27
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Bibliografia
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Thomas Efferth, The human ATP-Binding Cassette transporter
genes: from the bench to the bedside, Current Molecular
Medicine 2001, 1, 45-65
Stefan Wirths and Antonio Lanzavecchia, ABCB1 transporter
discriminates human resting naive B cells from cycling
transitional and memory B cells, Eur. J. Immunol. 2005, 105,
3433-3341
James I. Elliott, Selina Raguz and Christofer F. Higgins,
Multidrug transporter activity in lymphocytes, British Journal of
Pharmacology 2004, 143, 899-907
Kenneth M. Murphy and Steven L. Reiner, The lineage decisions
of helper T cells, Nature 2002, 1, 933-944
Kim Bottomly, T cells and dendritic cells get intimate, Science
1999, 283, 1124-1125
E. Gemmell, GJ. Seymour, Cytokines and T cell switching, Crit.
Rev. Oral. Biol. Med. 1994, 5, 249-279
A. langerkamp, M. Messi, A. Lanzavecchia, F. Sallusto, Kinetics
of dendritic cell activation impacting on priming of TH1, TH2 and
unpolarized cells, Nature Immun. 2000, 1, 311-316
Böyum A., Separation of white blood cells, Nature 1964, 204,
793-794
Böyum A., Isolation of mononuclear cells and granulocytes from
human blood, Scand. J. Clin. Lab. Invest 1968, 21 Suppl. 97, 77
Kay H. D., A new procedure to overlay diluted blood on FicollHypack gradients, J. Immunol. Meth. 1980, 39, 81
Pala, Tracy Hussel and Peter J. M. Openshaw, Flow cytometric
measurement of intracellular cytokines, J. of Immunological
Methods 2000, 243, 107-124
Federica Sallusto, Danielle Lenig, Reinhold Förster, Martin Lipp
and Antonio Lanzavecchia, Two subsets of memory T
lymphocyte with distinct homing potentials and effector
functions, Nature 1999, 401, 708-712
Raphael J. Röbe and Stephan Grissmer, Block of the
lymphocyte channel mKv1.3 by the phenylalkylamine verapamil:
kinetic aspects of block and disruption of accumulation of block
by a single point mutation, British Journal of Pharmacology
2000, 131, 1275-1284
L. Rivino, M. Messi, D. Jarrossay, A. Lanzavecchia, F. Sallusto
and J. Geginat, Chemokine receptors expression identifies pre-T
helper (Th)1, pre-Th2, and nonpolarized cells among human
CD4+ central memory cells, J. Exp. Med. 2004, 200, 725-735
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
28
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
15. F. Sallusto, D. Lenig, C. R. Mackay, A. Lanzavecchia, Flexible
program of chemokine receptor expression on human polarized
T helper 1 and 2 lymphocytes, J. Exp. Med. 1998, 187, 875-883
16. A. Zingoni, H. Soto, J. A. Hedrick, A. Stoppacciaro, C. T.
Storlazzi, F. Sinigaglia, D. D’Ambrosio, A. O’Garra, D. Robinson,
M. Rocchi, The chemokine receptor CCR8 is preferentially
expressed in Th2 but not in Th1 cells, J. Immunol. 1998, 161,
547-551
17. F. Sallusto, C. R. Mackay, A. Lanzavecchia, Selective
expression of the eotaxin receptor CCR3 by human T helper 2
cells, Science 1997, 277, 2005-2007
18. K. Nagata, K. Tanaka, K. Ogawa, K. Kemmotsu, T. Imai, O.
Yoshie, H. Abe, K. Tada, M. Nakamura, K. Sugamura and S.
Takano, Selective expression of a novel surface molecule by
human TH2 cells in vivo, J. Immunol. 1999, 162, 1278
19. S. Ho, N. Clipstone, L. Timmerman, J. Northrop, I. Graef, D.
Fiorentino, J. Nourse, G. R. Crabtree, The mechanism of action
of cyclosporin A and FK506, Clin. Immunol. Immunopathol.
1996, 80, 40-45
20. C. F. Higgins, The ABC of channel regulation, Cell 1995, 82,
693-696
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
29
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Ringraziamenti
Vorrei ringraziare coloro che mi hanno aiutato in questo lavoro.
In primo luogo ringrazio il direttore dell’Istituto di Ricerca in Biomedicina,
il professor Antonio Lanzavecchia, per avermi permesso di svolgere il
mio stage di formazione e quindi il lavoro di diploma in un laboratorio
all’avanguardia nella ricerca.
Ringrazio Federica Sallusto per avermi seguito nello svolgimento del
mio lavoro e David Jarrossay per il continuo contributo.
Ringrazio i docenti che mi hanno aiutato dal lato metodologico, Daniela
Marcacci il direttore Andrea Boffini. Inoltre Susan Gilbert per la parte in
inglese.
Ringrazio Elena per l’aiuto nella stesura del lavoro e le correzioni delle
bozze. Jole e Sara per la lettura delle bozze.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
30
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Allegato: I trasportatori ABC
La membrana cellulare separa il reparto intracellulare da quello
extracellulare, le sue funzioni principali sono definire I confini della
cellula e mantenere l’omeostasi. Le membrane cellulari hanno tutte la
stessa struttura: due strati lipidici che formano un doppio strato con un
interno idrofobico e due superfici idrofile.
A causa della sua parte interna idrofobica, la membrana cellulare funge
da barriera per la maggioranza delle sostanze polari. Per questo le
cellule hanno dovuto trovare il modo di trasportare le sostanze
organiche idrosolubili attraverso la membrana in modo da importare
nutrienti essenziali, esportare prodotti di scarto del metabolismo e
regolare la concentrazione intracellulare di ioni.
Il trasporto di ioni inorganici e sostanze organiche idrosolubili di piccole
dimensioni attraverso il doppio strato lipidico é svolto da proteine di
membrana specializzate, ognuna delle quali é responsabile del
trasporto di uno ione specifico o di una molecola specifica (o un piccolo
gruppo di molecole molto simili tra loro).
Ci sono due classi principali di proteine di membrana che sono
responsabili del trasporto di sostanze attraverso la membrana: proteine
canale, che formano un poro idrofilo e permettono il libero passaggio di
sostanze inorganiche e proteine carrier che hanno parti mobili per
spostare molecole specifiche da una parte all’altra della membrana.
Le proteine carrier legano il soluto specifico e compiono una serie di
cambiamenti nelle loro conformazione in modo da spostare il soluto
attraverso la membrana, il processo di trasporto può essere attivo o
passivo, quando il movimento avviene nella direzione del gradiente
elettrochimico il processo è passivo e non necessita di energia, quando
il processo avviene invece nel senso contrario al gradiente
elettrochimico il processo è attivo e necessita quindi di energia. Il
trasporto attivo è sempre mediato da carrier e necessita di energia
fornita dall’idrolisi di ATP (Figura 1).
Le proteine carrier possono trasportare le sostanze in diversi modi,
quelle che trasportano un singolo soluto da una parte all’altra sono
chiamate
uniporters,
altre
proteine
possono
trasportare
simultaneamente due soluti, nella stessa direzione (symport) o nelle
due diverse direzioni (antiport) (Figura 2)
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
31
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Figura 1. Confronto tra trasporto
passivo (seguendo il gradiente
elettrochimico) e attivo (contro il
gradiente elettrochimico).
Diffusione semplice e trasporto
passivo avvengono spontaneamente, il trasporto attivo necessita
invece di energia (3).
Figura 2. Tre tipi di trasporto
mediato da carrier.
Lo schema rappresenta proteine
carrier che funzionano come
uniporter, symporter e antiporter
(3).
La famiglia dei trasportatori ABC
In questo allegato si focalizza l’attenzione su una famiglia di proteine
carrier che svolgono un trasporto attivo chiamati ATP-Binding cassette
(o ABC) transporters.
I trasportatori ABC sono presenti in tutte le speci dai batteri all’uomo, la
loro famiglia di geni é la più grande fino ad oggi conosciuta ed è in
continua espansione a causa di nuove scoperte. I trasportatori ABC
presentano tutti una comune struttura molecolare, ci sono due possibili
strutture: o il trasportatore è formato da una singola proteina con 2
sequenze transmembrana e 2e ATP-binding, oppure da due proteine
che dimerizzano, ognuna avente una sequenza transmembrana e una
ATP-binding., ogni proteina contiene delle zone altamente conservate
chiamate ATP-binding Cassette.(Figura 3).
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
32
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Finora sono stati descritti più di 50 appartenenti alla famiglia degli ABC
transporters, ogni trasportatore é specifico per una sostanza (detta
anche allocrite), che può essere: un aminoacido, zuccheri, ioni
inorganici, polisaccaridi, peptidi o anche proteine. In alcuni casi la
funzione e l’espressione nei vari tessuti dei diversi trasportatori non è
ancora stata chiarita (Figura 4).
Figure
3.
Rappresentazione
schematica
di
un
tipico
trasportatore ABC.
(A) Topologia.
(B) sistemazione ipotetica della
catena polipeptidica attraverso la
membrana. Il trasportatore è
formato da 4
sequenze due
altamente idrofobiche che si situano
attraverso la membrana e due ATPbinding cassette. In alcuni casi la
proteina è formata da una singola
catena di aminoacidi (come nelle
figura) e in altri da due catene che
dimerizzano (3).
i trasportatori ABC sono stati trovati in tutte le speci e svolgono una
serie di funzioni:
1. Trasportatori: spostano attivamente sostanze attraverso la
membrana.
2. Proteine canale: spostano passivamente sostanze attraverso la
membrana.
3. Recettori: legano sostanze trasmettono il segnale all’interno
della cellula.
4. regolatori di altre proteine di membrana.
ATP è il substrato dei trasportatori ABC nel vero senso del termine,
ATP viene idrolizzato in ADP e P, e questo da l’energia necessaria al
trasporto della sostanza attraverso la membrana. Il meccanismo di
idrolisi di ATP può cambiare da un trasportatore all’altro, alcuni esempi
sono:
1. ABCB1: entrambe le binding cassette idrolizzano ATP e
interagiscono per trasportare il soluto.
2. ABCC7: entrambe le binding cassette idrolizzano ATP, una è
responsabile dell’apertura del canale e l’altra per la chiusura
3. ABCC8: Una binding cassette lega ATP e l’altra ADP
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
33
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
La famiglia dei trasportatori ABC comprende finora 53 proteine divise in
7 sottofamiglie, la loro organizzazione genomica suggerisce
un’evoluzione autonoma, i dati molecolari di ogni trasportatore sono
raffigurati nella figura 5.
Figura 4: Allocriti ed espressione nei tessuti dei diversi trasportatori
ABC nell’uomo.
Gene
ABCA1
Allocrita
Colesterolo, lipidi
ABCA2
Estramustine
ABCA3
Xenobiotici
ABCA4
ABCA7
ABCB2
Retinoidi
Lipidi
Medicamenti citostatici, xenobiotici,
steroidi, composti idrofobici
Peptidi
ABCB3
Peptidi
ABCB4
ABCB5
ABCB6
ABCB7
ABCB8
Fosfatidilcolina
Fosfatidilcolina
Ferro
Ferro
Composti mitocondriali
ABCB1
ABCB9
ABCB10
Peptidi
ABCB11
ABCC2
ABCC3
Sali biliari monovalenti
Medicamenti citostatici, xenobiotici,
leucotrieni, coniugati anionici
Sali biliari
Sali biliari
ABCC4
Anioni inorganici medicamenti antivirali
ABCC5
Anioni organici
Medicamenti citostatici, xenobiotici,
componenti della matrice extracellulare
ABCC1
ABCC6
ABCC7
Cloruro, anioni organici, glutatione
ABCC8
ABCC9
ABCD1
ABCD2
ABCD3
ABCD4
ABCE1
ABCF1
ABCF2
ABCF3
ABCG1
ABCG2
Potassio
Potassio
Acidi grassi liberi o coniugati a CoA
Acidi grassi liberi o coniugati a CoA
Acidi grassi liberi o coniugati a CoA
Acidi grassi liberi o coniugati a CoA
Regolatore di RNAse
Coinvolto nelle traslazione di MRNA
ferro
Colesterolo, fosfolipidi
Medicamenti citostatici
Espressione nei tessuti
Utero, fegato ubiquitario a bassi livelli
Cervello, fegato, reni polmoni, cuore,
ubiquitario a bassi livelli
Cervello, fegato, reni, pancreas,
ubiquitario a bassi livelli
Retina
Milza, organi linfatici
Surreni, cervello, tratto intestinale, reni,
fegato, tumori multiresistenti
Reticolo endoplasmatico
Reticolo endoplasmatico, aorta, colon
reni, polmoni, stomaco, utero
Seno, colon, cuore, fegato
Ubiquitario
Mitocondri, ubiquitario
Mitocondri, ubiquitario
Mitocondri, ubiquitario
Lisosomi, cervello, cellule germinali,
testicoli, tonsille utero
Mitocondri, ossa, linfonodi, polmoni,
stomaco
Epatociti
Ubiquitario
Intestino, fegato, reni
Intestino, fegato, reni
Cistifellea, prostata, polmoni, ovaie,
pancreas, muscoli scheletrici, testicoli
Ubiquitario
Capillari, precursori emopoietici, reni,
fegato, retina, pelle
Epididimo, intestino, reni, polmoni,
pancreas, ghiandole salivari, testicoli
β-cells delle isole pancreatiche
Ubiquitario
Ubiquitario
Surreni, cervello, cuore
Ubiquitario
Ubiquitario
Ubiquitario
Ubiquitario
Ubiquitario
Fegato fetale, milza
Cervello, milza, polmoni
Placenta, seno, fegato, intestino
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
34
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Figura 5 : molecular key data of human ABC Transporters
ABCA1
ABCA2
ABCA3
ABCA4
ABCA5
ABCA6
ABCA7
ABCA8
ABCA9
ABCA10
ABCA11
ABCA12
ABCA13
ABCB1
ABCB2
ABCB3
ABCB4
ABCB5
ABCB6
ABCB7
ABCB8
ABCB9
ABCB10
ABCB11
ABCC1
ABCC2
ABCC3
ABCC4
ABCC5
ABCC6
ABCC7
ABCC8
ABCC9
ABCC10
ABCC11
ABCC12
ABCC13
ABCD1
ABCD2
ABCD3
ABCD4
ABCE1
ABCF1
ABCF2
ABCF3
ABCG1
ABCG2
ABCG3
ABCG4
ABCG5
ABCG6
ABCG7
ABCG8
Sinonimi
ABC1, TGD, HDLDT1, CERP
ABC2
ABC3, ABC-C
ABC10, ABCR, STGD1, RP19, FFM
ABC13
ABCX
ABC20, MDR1, P-gp, PGY1, P-170
ABC17, TAP1, PSF1, RING4
ABC18i, TAP2, PSF2, RING11
ABC21, MDR2 (3), PGY3, PFIC-3
ABC19
ABC14, MTABC3
ABC7, ATM1P
ABC2, M-ABC1
ABC23, TAPL
M-ABC2, MTABC2
ABC16, BSEP, SPGP, PGY4
ABC29, MRP1, GS-X
ABC30, MRP2, cMOAT, cMRP
ABC31, MRP3, cMOAT2, MPL2,
MOAT-D
ABC32, MRP4, MOAT-B
ABC33, MRP5, MOAT-C, pABC11
ABC34, MRP6, ARA, MLP1
ABC35, CFTR
ABC36, SUR1, PHHI, HI, HRINS
ABC37, SUR2
ABC26, MRP7
MRP8
ABC42, ALD, ALDP, AMN
ABC39, ALDL1, ALDR, ALDRP
ABC43, PMP70, PXMP1
ABC41, PMP69, PXMP1L, P70R
ABC38, RNAseLI, OABP
ABC50
ABC28
ABC25
ABC8, WHITE
ABC15, BCRP1, MXR1, ABCP
WHITE2
WHITE3, Sterolin1
WHITE4, Steroline2
Chromosomal locus
9q22-31
9p34
16p13.3
1p22
17q21-24
17q21
19p13.3
17q24
17q24
17q24
4p16
2q35
7p11-q11
7q21
6p21.3
6p21.3
7q21
7p14
2q33-36
Xq131.1-131.3
7q35-36
12q24
1q42
2q24
16p13.1
10q24
Exoni
49/50
48
50
38
38
> 37
38
38
38
62
28
11
11
28
19
31
32
17q21.3
13q32
3q27
16p13.1
7q31.2
11p15.1
12p12.1
6p21
16q12
21q11.2
Xq28
12q11
1p21-22
14q24.3
4q31
6p21.33
7q35-36
3q25.1-25.2
21q22.3
4q22
8p12
11q23.3
2p21
7
15
2p21
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
27
39
38
22
28
29
14
mRNA
6,9 kb
8 kb
6.5 kb
7.3 kb
6.5 kb
5.3 kb
6.6 kb
5.7 kb
6 kb
6.2 kb
Proteina
2261 aa
2436 aa
1704 aa
2273 aa
1642 aa
1617 aa
2146 aa
1581 aa
1624 aa
1543 aa
7 kb
450 kb
4.5 kb
2.5 kb
2.8 kb
4.5 kb
2.5 kb
3.5 kb
2.4 kb
2.4 kb
3.5 kb
4.1 kb
5.4 kb
6.5 kb
5.5 kb
6.5 kb
2595 aa
5058 aa
1280 aa
748 aa
703 aa
1280 aa
748 aa
842 aa
752 aa
718 aa
723 aa
738 aa
1321 aa
1531 aa
1545 aa
1527 aa
6.5 kb
6.6 kb
6.5 kb
6 kb
5 kb
5 kb
5.5 kb
4.6 kb
5 kb
2.8 kb
3.5 kb
3.3 kb
2.9 kb
2.9 kb
3.1 kb
2.2 kb
2.8 kb
2.7 kb
2.4 kb
1325 aa
1437 aa
1503 aa
1480 aa
1581 aa
1549 aa
1464 aa
1382 aa
1359 aa
325 aa
745 aa
740 aa
659 aa
606 aa
402 aa
807 aa
623 aa
709 aa
638 aa
655 aa
3.5 kb
2.3 kb
627 aa
651 aa
2 kb
673 aa
35
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
ABC transporters umani nelle
malattie
ABCA1 é localizzato nelle membrana plasmatica e nell’apparato di
Golgi e trasporta il colesterolo intracellulare e i fosfolipidi fuori dai
macrofagi. Una serie di diverse mutazioni e delezioni nel gene di
ABCA1 sono state trovate in pazienti affetti da sindrome di Tangier
(deficienza di HDL tipo I) e in pazienti con ipo-α-lipoproteinemia
(deficienza di HDL tipo II).Sintomi clinici della sindrome di Tangier sono
tonsille molto ingrossate, epatosplenomegalia, linfonodi ingrossati,
rischio aumentato di aterosclerosi e neuropatie. La chimica clinica
evidenzia ipercolesterolemia, diminuito HDL e aumento dei trigliceridi.
ABCA4 é un trasportatore organo-specifico della retina localizzato nei
fotorecettori. Mutazioni nel gene sono state trovate in pazienti affetti da
Stardgardt’s disease o la malattia ad esso associata il fundus
flavimaculatus. Stardgardt’s disease è una distrofia maculare
rapidamente progressiva e ha una pessima prognosi per la vista. Si
presenta nella prima o seconda decade di vita, la sua frequenza è di
1:10'000. I sintomi clinici sono: perdita della visione centrale, perdita
della visione a colori, dovuta all’atrofia della retina. Mutazioni del gene
sono state trovate anche in pazienti affetti da retinite pigmentosa.
Il gene di ABCB1 é espresso ad alti livelli in vari organi normali come
ghiandole surrenali, fegato, reni e tratto intestinale. Il trasportatore
contribuisce alla barriera emato-encefalica, trasloca ormoni ed espelle
xenobiotici assorbiti con I nutrienti. Il gene codificante per ABCB1 è
stato il primo ad essere identificato, nel 1986 fu scoperto che le cellule
di alcuni tumori con multiresistenze ai farmaci esprimevano in modo
esagerato due geni correlati tra di loro che furono chiamati MDR1 e
MDR2 (che sono poi stati identificati essere ABCB1 e ABCB4). Il gene,
se espresso esageratamente è un fattore di rischio per il fallimento della
chemioterapia e una prognosi negativa.ABCB1 conferisce resistenza ai
farmaci abbassando il livello del medicamento all’interno della cellula a
livelli non letali.
ABCB2 (TAP1) e ABCB3 (TAP2) sono subunità di un complesso che
trasporta peptidi dal compartimento intracellulare al reticolo
endoplasmatico e da lì al sito di legame del MHC di classe I.Anomalie
del trasportatore causano diverse malattie:
• Bare lymphocyte syndrome type I, una mutazione puntiforme
causa una deficienza di HLA di classe I.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
36
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
• Infezioni virali: Herpes simplex virus type I blocca il sito di legame
dei trasportatore TAP, il Citomegalovirus ne inibisce invece la
capacità di trasportare peptidi.
• L’inibizione dei TAP é stata osservata in carcinomi delle cellule
renali, portando ad un Blocco della presentazioni di antigeni
cancerogeni e quindi ad una tolleranza da parte del sistema
immmunitario.
• Il polimorfismi del geneTAP2 contribuisce alla suscettibilità
genetica della sclerosi multipla.
• E’ stata osservata una relazione tra uno degli alleli del gene
TAP1 con il diabete mellito insulino-dipendente.
ABCB4 é coinvolto nella traslocazioni della Fosfatidilcolina nella bile,
mutazioni nel gene di ABCB4 sono state trovate in pazienti con
colestasi intraepatica familiare progressiva (PFIC), la malattia consiste
in una deficienza di sali biliary. La malattia può presentare anche
mutazioni nel gene di ABCB11.
ABCB7 é coinvolto nel trasporto di heme dai mitocondri nel citoplasma,
una mutazione del gene é stata trovata in pazienti affetti da X-linked
anemia sideroblastica con atassia (ASAT).
Il trasportatore ABCC1 (MRP1) ha diverse funzioni: trasporto di allocriti
esogeni (medicamenti antitumorali, anioni inorganici, mediatori della
risposta infiammatoria) e trasporto di composti endogeni. Il contributo di
ABCC1 nella resistenza tumorale ai farmaci é oggetto di discussione, il
trasportatore é espresso su diversi tumori solidi e in proliferazioni
ematologiche
ABCC7 o CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Receptor) é espresso
nell’epitelio delle vie respiratorie, nel duodeno e digiuno e nei
compartimenti cellulari delle cellule del tratto intestinale, il trasportatore
é un canale di cloruro.Il 70% delle mutazioni nel gene consistono nella
delezione di tre basi che causano la perdita di una fenilalanina nella
posizioni 508 della proteina, l’altro 30% è costituito da tutta una serie di
altre mutazioni.Le manifestazioni cliniche della fibrosi cistica sono
dovute alla distruzione delle funzioni esocrine del pancreas
(insufficienza pancreatica), delle ghiandole intestinali (occlusione
intestinale), dell’albero biliare (ostruzione biliare e cirrosi), delle
ghiandole bronchiali (infezioni broncopolmonari croniche con enfisemi).
La riduzione delle funzioni polmonari e infezioni polmonari sono la
causa della morbidità e della mortalità della fibrosi cistica, una
colonizzazione delle vie aeree da Pseudomonas aeruginosa è tipica.
ABCC8 é una subunità di un canale di potassio espresso nelle isole
pancreatiche. Mutazioni nel gene sono state trovate in pazienti affetti da
ipoglicemia iperinsulinica infantile persistente(PHHI), un disordine
caratterizzato da una elevata secrezione di insulina da parte delle
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
37
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
cellule β. PHHI si presenta durante il periodo prenatale o durante
l’infanzia con stanchezza, coma e altri sintomi dell’ipoglicemia.
ABCC2 é responsabile dell’escrezione di acidi organici biliari nel fegato
e nei reni. Mutazioni nel gene sono state trovate in pazienti affetti da
sindrome di Dubin-Johnson. La malattia è caratterizzata da un disturbo
della secrezione di bilirubina nei capillari biliari da parte degli epatociti,
che causa un ristagno di bilirubina nel fegato.
ABCC3 può sostituire le funzioni di ABCC2 ed é espresso ad alti livelli
in pazienti affetti da sindrome di Dubin-Johnson.
ABCC6 esporta composti dai reni e dal fegato e contribuisce alla
deposizione di matrice extracellulare ed al turn-over del tessuto
connettivo. Mutazioni nel gene sono state trovate in pazienti affetti da
pseudoxanthoma elasticum, un disordine caratterizzato da cambiamenti
nella pelle e complicazioni vascolari occlusive.
Mutazioni nel gene ABCD1 causano l’adrenoleucodistrofia, un disordine
metabolico caratterizzato dall’accumulo di acidi grassi a catena molto
lunga (VLCFA) nella sostanza bianca del cervello e nella corteccia
cerebrale, questo accumulo causa una demielinazione del sistema
nervoso centrale, portando ad un deterioramento mentale neuropatia.
ABCD2 può compensare le funzioni di ABCD1.
ABCD3 é oggetto di discussione per causare la sindrome di Zellweger,
una malattia caratterizzata da dismorfia facciale, epatomegalia, cisti
renali, ritardo mentale dovute all’accumulo di VLCFA.
Terapie
Tumori multiresistenti
Per contrastare la resistenza ai farmaci dei tumori sono stati trovati
diversi antagonisti per ABCB1, la prima scoperta é stata che verapamil
aumenta l’attività dei farmaci antitumorali. Il problema è dato dagli effetti
collaterali dei medicamenti, infatti inibiscono l’attività di ABCB1 non
solo delle cellule tumorali, ma di tutte le cellule che esprimono ABCB1,
il blocco del trasportatore da solo non ha grandi effetti, ma in
combinazione con i citostatici gli effetti possono essere molto tossici.
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
38
Cattani Elia, SSMT, TAB
2006
Fibrosi cistica
Il medicamento ibuprofene inibisce la formazione di leucotrieni e può
essere usato nel trattamento della fibrosi cistica, però il medicamento
inibisce l’attività di CFTR e questo può contrastarne gli effetti benefici.
Adrenoleucodistrofia
Peroxisome proliferation stimulator fenofibrate induce l’epressione di
ABCD2 e ABCD3 questo ristabilisce la -ossidazione di VLCFA
deficiente nel fegato. Rolipram e lovastatin diminuiscono la produzione
di citochine e stimolano la -ossidazione.
Bibliografia
1. Stefan Broer, Carsten A. Wagner, Membrane transporters diseases,
Plenum Publishers, New York, 2003, ISBN 0306478838
2. A. K. Duttaroy, F. Spenser, Cellular Protein and their fatty acids in
health and disease, Wiley-VCH verlag, Weinheim, 2003, ISBN
3527304371
3. B. Alberts, D. Bray, Molecular biology of the cell, , garland Publishing
Inc., New York, 1994, ISBN 0815316208
4. Efferth T., The human ATP-Binding cassette transporter genes: from the
bench to the bedside, Current molecular medicine 2001 (1), 45-65
5. Stefan Wirths and Antonio Lanzavecchia, ABCB1 transporter
discriminates human resting naïve B cells from cycling transitional and
memory B cells, Eur. J. Immunology, 2005 (35), 3433-3441
6. http://nutrigene.4t.com/humanabc.htm
Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico
39